李云霞， 李男， 姜小川, 加慧， 夏書月

沈陽醫(yī)學(xué)院附屬中心醫(yī)院呼吸內(nèi)科(遼寧沈陽 110024)

非編碼微小RNA-155(microRNA-155，miR-155)是miRNAs家族的重要成員，由23個(gè)核苷酸組成。研究發(fā)現(xiàn)，miR-155可以致小鼠肺部炎癥及肺損傷，同時(shí)也證實(shí)miR-155在調(diào)節(jié)與T細(xì)胞功能相關(guān)的基因表達(dá)和炎癥反應(yīng)方面發(fā)揮重要的作用[1-2]。也有研究表明，miR-155在乳腺癌患者血清中的表達(dá)水平顯著高于其在健康體檢者血清中的表達(dá)水平[3]，在二次感染患者的巨噬細(xì)胞中表達(dá)明顯增加[4]，miR-155已成為近年來的研究熱點(diǎn)。2007年，國外研究首次報(bào)道白細(xì)胞介素-35(interleukin-35，IL-35)是一種具有強(qiáng)大抗炎作用的新型細(xì)胞因子[5]，此后IL-35的研究逐漸增多。最新的研究Chen等[6]報(bào)道，在哮喘及慢性阻塞性肺疾病(chronic obstructive pulmonary disease，COPD)患者血漿中，IL-35的濃度出現(xiàn)下降現(xiàn)象，該文獻(xiàn)報(bào)道在哮喘和COPD患者中，IL-35很有可能參與Th2和Th17介導(dǎo)的炎癥反應(yīng)。本研究通過檢測各組受試者中miR-155、IL-35的水平，分析miR-155與肺功能、血?dú)庵笜?biāo)、IL-35的相關(guān)性，從而明確miRNA-155對COPD的影響。

1 資料與方法

1.1 一般資料 隨機(jī)選取2017年6月至2018年6月我院呼吸內(nèi)科門診就診的穩(wěn)定期COPD(COPD穩(wěn)定組)患者30例，住院的COPD急性加重期患者30例(AECOPD組)， 健康對照組30例，重度吸煙組30例。男58例，女62例。年齡40～80歲，平均(66±5.8)歲。

1.2 入選標(biāo)準(zhǔn) (1)健康對照組：無吸煙史，無慢性呼吸系統(tǒng)疾病，無高血壓、冠狀動脈粥樣硬化性心臟病、糖尿病、神經(jīng)系統(tǒng)疾病、肝腎疾病等病史，年齡、性別與COPD穩(wěn)定組匹配。(2)COPD穩(wěn)定組：COPD診斷符合2011年由美國胸科學(xué)會(American Thoracic Society，ATS)和歐洲呼吸學(xué)會(European Respiratory Society，ERS)聯(lián)合制定的診治指南，且近3個(gè)月無COPD急性加重。(3)重度吸煙組：來自健康管理中心的吸煙的健康者，年齡40～80歲，每天吸20支及以上卷煙，吸煙指數(shù)(SI) ≥400。SI=每天吸煙支數(shù)×吸煙年數(shù)。(4)AECOPD組：符合以下條件：①曾診斷過COPD；②急性加重指標(biāo)：發(fā)熱，咳嗽加劇，痰量增多或出現(xiàn)黃痰；③呼吸困難指標(biāo)：安靜狀態(tài)下，呼吸頻率>20次/min；④肺功能受損指標(biāo)：活動后氣短加重或出現(xiàn)啰音；⑤經(jīng)常使用COPD藥物；⑥年齡>65歲。

1.3 排除標(biāo)準(zhǔn) 合并其他慢性呼吸系統(tǒng)疾病如哮喘、支氣管擴(kuò)張、肺結(jié)核、肺癌、肺間質(zhì)疾病等，合并有其他系統(tǒng)慢性未控制疾病如高血壓、糖尿病、冠狀動脈粥樣硬化性心臟病、嚴(yán)重肝腎功能損害、神經(jīng)系統(tǒng)疾患等。

1.4 檢測指標(biāo)

1.4.1 外周血PBMC中miRNA-155的表達(dá)水平 抽取實(shí)驗(yàn)對象全血5 mL用percoll分離液法分離單個(gè)核細(xì)胞，采用RT-PCR技術(shù)來檢測單個(gè)核細(xì)胞PBMC中miRNA-155的表達(dá)水平；RT-PCR試劑盒購自美國RD公司。PCR反轉(zhuǎn)錄條件：65℃、5 min，42℃、60 min，80℃、5 min，PCR擴(kuò)增條件：預(yù)變性95℃、10 min,循環(huán)(40次)95℃、15 s→60℃、60 s，溶解曲線75℃→95℃，每20 s升溫1℃，處理方法：ΔΔCT法：A=CT(目的基因，待測樣本)-CT(內(nèi)標(biāo)基因，待測樣本)，B=CT(目的基因，對照樣本)-CT(內(nèi)標(biāo)基因，對照樣本)(K=A-B)表達(dá)倍數(shù)=2-K。miRNA-155 RT引物序列：5′-CTCAACTGGTGTCGTGGAGTCGGCAATTCAGTTGAGA-CCCCTAT-3′。PCR引物序列上游：5′-ACACTCCAGCTGGGTTAATGCTAATTGTGAT-3′，下游：5′-TGGTGTCGTGGAGTCG-3′。

1.4.2 外周血炎癥因子IL-35的表達(dá)水平 采集外周空腹靜脈血5 mL，2 000 r/min 離心20 min，提取上層血清于-80℃保存待測。ELISA方法測定血清標(biāo)本中IL-35 的水平。試劑盒由上海西唐生物科技有限公司提供，嚴(yán)格按照說明書操作步驟進(jìn)行。本實(shí)驗(yàn)采用雙抗體夾心法。

1.4.3 各組受試者肺功能檢查 檢測指標(biāo)為第1秒用力呼氣容積(FEV1%)、FEV1占用力肺活量百分比(FEV1/FVC%)、用力肺活量(FVC%)。重復(fù)3次，取最好的結(jié)果。

1.4.4 各組受試者血?dú)夥治鰴z查 抽取動脈血，查看血?dú)夥治鼋Y(jié)果，檢測指標(biāo)為PO2(mmHg)、PCO2(mmHg)、SO2%。

2 結(jié)果

2.1 各組血清中miR-155、IL-35的表達(dá)結(jié)果 健康對照組miR-155表達(dá)量最低，IL-35的表達(dá)量最高；AECOPD組miR-155表達(dá)量最高，IL-35的表達(dá)量最低；COPD穩(wěn)定組miR-155表達(dá)較AECOPD組表達(dá)少，但較重度吸煙組表達(dá)增多，各組間比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=25.21、19.98，P<0.01)。隨著疾病的進(jìn)展，IL-35的表達(dá)量逐漸下降，miR-155表達(dá)逐漸升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)。見表1。

項(xiàng)目例數(shù)miR-155-5pIL-35(pg/mL)健康對照組300.24±0.06326.25±56.23重度吸煙組300.56±0.05?224.12±16.25?COPD穩(wěn)定組301.13±0.15?130.44±36.14?AECOPD組302.24±0.25?34.12±21.01?F值25.2119.98P值0.000.00

*與健康對照組比較P<0.01

2.2 血清中miR-155-5p與FEV1%、FEVI/FVC%、FVC%的相關(guān)性分析 根據(jù)Spearman 相關(guān)分析，血清中miR-155-5p的水平與FEV1%的水平呈負(fù)相關(guān)(r=-0.706 2，P<0.01)；與FEVI/FVC%無相關(guān)性；與FVC %無相關(guān)性。見圖1。

圖1 miR-155與FEV1%的相關(guān)分析

2.3 血清中miR-155-5p與血?dú)庵笜?biāo)的相關(guān)性分析 根據(jù) Spearman 相關(guān)分析，血清中miR-155-5p的水平與PO2的水平呈負(fù)相關(guān)(r=-0.739 7，P<0.01)；與PCO2無相關(guān)性。見圖2。

圖2 miR-155與PO2的相關(guān)分析

2.4 miR-155與IL-35表達(dá)水平的相關(guān)性分析 通過Spearman相關(guān)分析，miR-155與血清中IL-35的表達(dá)水平呈負(fù)相關(guān)(r=-0.652 2，P<0.01)。見圖3。

圖3 miR-155與IL-35的相關(guān)分析

3 討論

眾所周知，COPD是一種慢性氣道炎癥，氧化/抗氧化失衡、蛋白酶/抗蛋白酶失衡是COPD發(fā)病機(jī)制的關(guān)鍵環(huán)節(jié)[7-8]。COPD發(fā)病過程中常常伴有IL-17、IL-10、IL-6、腫瘤壞死因子-α(TNF-α)等細(xì)胞因子表達(dá)的異常。研究報(bào)道，在COPD發(fā)病過程中，IL-17通過刺激 IL-6、IL-8、粒細(xì)胞-巨噬細(xì)胞集落刺激因子(GM-CSF)及基質(zhì)金屬蛋白酶2(MMP-2) 等炎性細(xì)胞因子，同時(shí)誘導(dǎo)氣道黏液分泌，促進(jìn)氣道重塑，而最終導(dǎo)致其靶器官病變。但I(xiàn)L-35在COPD中如何表達(dá)，國內(nèi)外相關(guān)報(bào)道極少。目前研究證明，IL-35是一種具有強(qiáng)大抗炎作用的新型細(xì)胞因子[9-11]，作為免疫抑制性細(xì)胞因子，IL-35與COPD、糖尿病、哮喘等疾病密切相關(guān)[12-14]。我們的研究結(jié)果表明，健康對照組IL-35的平均水平為(326.25±56.23)pg/mL，重度吸煙組IL-35的平均水平為(224.12±16.25)pg/mL，COPD穩(wěn)定組為(130.44±36.14)pg/mL，AECOPD組為(34.12±21.01)pg/mL，隨著病情的進(jìn)展，IL-35的表達(dá)量呈現(xiàn)下降趨勢，說明IL-35與COPD的發(fā)病過程密切相關(guān)，且很可能對COPD的進(jìn)展起保護(hù)作用。

miRNAs是一類長度為19～25個(gè)核苷酸的非編碼RNA，參與多種重要生物學(xué)過程[15]。miRNAs究竟在COPD發(fā)病機(jī)制中扮演何種角色，目前尚不知曉。研究顯示，miRNAs靶向控制哺乳動物30%的基因組表達(dá)，且在細(xì)胞生長、分化、凋亡、代謝及病毒感染、腫瘤發(fā)生等病理生理過程中發(fā)揮至關(guān)重要的作用[16-17]。近年來眾多研究探討了某些miRNAs在COPD發(fā)病機(jī)制中的作用，并闡明其作為COPD早期診斷的生物標(biāo)志物的可能性，是COPD疾病診斷、治療以及預(yù)后評估方面的一個(gè)新突破。miR-155是一種經(jīng)典的多功能miRNA，參與T細(xì)胞、B細(xì)胞和巨噬細(xì)胞的發(fā)育、分化、活化、增殖及其穩(wěn)態(tài)的維持[18-20]，而自身免疫性疾病均存在著抗原提呈細(xì)胞(antigen presenting cells，APCs)活化和抗原提呈，以及T和B細(xì)胞的活化、增殖、分化等過程[21-22]。迄今為止，綜合全球文獻(xiàn)發(fā)現(xiàn)在已知的miRNAs中，miR-155是與腫瘤性疾病和炎癥性疾病最相關(guān)的miRNAs之一。miR-155對COPD患者有何影響，及其與COPD患者中IL-35的相關(guān)性，目前無相關(guān)文獻(xiàn)報(bào)道，是本研究的目的。

我們的研究結(jié)果表明，健康對照組miR-155的表達(dá)量最低，AECOPD組miR-155表達(dá)量最高，COPD穩(wěn)定組miR-155表達(dá)較AECOPD組表達(dá)少，但較重度吸煙組表達(dá)增多，各組間比較，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)。隨著病情的進(jìn)展，miR-155的表達(dá)量逐漸升高。根據(jù)Spearman相關(guān)分析，血清中mir-155-5p的水平與PO2的水平、FEV1%的水平、IL-35的表達(dá)水平均呈負(fù)相關(guān)(r=-0.739 7，-0.706 2、-0.652 2；P<0.01)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。說明miR-155參與了COPD的發(fā)病過程，是導(dǎo)致肺損傷的重要物質(zhì)，對COPD產(chǎn)生負(fù)性效應(yīng)，而IL-35是一種保護(hù)性細(xì)胞因子，兩者之間呈現(xiàn)明顯的負(fù)相關(guān)，具體的信號通路及傳導(dǎo)過程是我們下一步課題的研究目標(biāo)。