洪郭駒， 魏秋實(shí)， 韓曉蕊， 何偉， 陳鎮(zhèn)秋△

1 阿爾伯塔大學(xué)醫(yī)學(xué)院外科部(加拿大阿爾伯塔省埃德蒙頓T6G 2R3)； 2廣州中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院關(guān)節(jié)骨科(廣東廣州 510405); 3廣州市第一人民醫(yī)院(華南理工大學(xué)第二附屬醫(yī)院)放射科(廣東廣州 510180)

酒精性股骨頭壞死(alcohol-induced osteonecrosis of femoral head, AIONFH)是由于長(zhǎng)期過(guò)量飲用含酒精類(lèi)飲品所導(dǎo)致的骨組織活性降低或者死亡過(guò)程。其機(jī)制經(jīng)研究發(fā)現(xiàn)，是由于酒精誘導(dǎo)骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞(BMSC)成骨能力減弱引起代謝紊亂[1-2]。microRNA(miRNA)是一類(lèi)內(nèi)源性非編碼小RNA，miRNA通過(guò)與靶基因?qū)崿F(xiàn)特異性結(jié)合，從而抑制或激活靶基因的降解或翻譯功能，進(jìn)而對(duì)相應(yīng)的靶基因進(jìn)行調(diào)控。miRNA 參與體內(nèi)BMSC的增殖、分化和凋亡過(guò)程，決定股骨頭壞死疾病發(fā)展走向[3-5]。選擇特定的通過(guò)藥物介導(dǎo)miRNA調(diào)控骨代謝作用，將有利于AIONFH治療在未來(lái)的發(fā)展中找到新的突破口。中醫(yī)藥對(duì)股骨頭壞死具有較為良好的效果，其中以祛痰逐瘀方(QutanZhuyu Decoction, QZD)在臨床實(shí)踐中對(duì)防治AIONFH效果明顯，目前已廣泛運(yùn)用于中醫(yī)臨床當(dāng)中，特別針對(duì)過(guò)度飲酒導(dǎo)致AIONFH的“痰濕血瘀”體質(zhì)人群，可以降低組織內(nèi)脂肪含量，提高成骨能力[6]。QZD在對(duì)抗骨組織內(nèi)脂肪增加方面有較大的潛力和效力。鑒于此，本研究通過(guò)miRCURY LNATMUniversal RT microRNA PCR Panels檢測(cè)AIONFH患者血清，并使部分患者服用QZD進(jìn)而篩查和確定特異性miRNA；同時(shí)建立AIONFH大鼠模型，采用RT-qPCR、病理組織學(xué)染色、Micro-CT等檢驗(yàn)方法，觀察QZD經(jīng)特異性miRNA調(diào)控AIONFH成骨分化的機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 研究對(duì)象 研究團(tuán)隊(duì)于2017年1—3月間，選取在廣州中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院保髖病區(qū)住院接受保髖治療的AIONFH患者34例(AIONFH組)，男20例，女14例，平均年齡(43±4.2)歲。AIONFH患者且服用QZD保守治療8例(中藥治療組)，男6例，女2例，平均年齡(41.2±5.5)歲。另外有相對(duì)健康志愿者34例(相對(duì)健康組)，男18例，女16例，平均年齡(36.1±7.3)歲。所有納入對(duì)象進(jìn)行髖部MRI檢查及臨床體格檢查。

1.2 納入與排除標(biāo)準(zhǔn) AIONFH患者納入標(biāo)準(zhǔn)：(1)符合《成人股骨頭壞死診療標(biāo)準(zhǔn)專(zhuān)家共識(shí)(2012年版)》中所列舉的股骨頭壞死診斷標(biāo)準(zhǔn)；(2)經(jīng)檢查無(wú)慢性基礎(chǔ)疾病，如糖尿病、心臟病等；(3)既往無(wú)髖部受傷導(dǎo)致骨質(zhì)破壞；無(wú)糖皮質(zhì)激素使用史，排除創(chuàng)傷性和激素性股骨頭壞死可能；(4)需具有較為明確的過(guò)度、長(zhǎng)期飲酒史；(5)未曾長(zhǎng)時(shí)間服用調(diào)節(jié)骨代謝藥物；(6)20～60歲之間；(7)患者知情同意。排除標(biāo)準(zhǔn)：(1)經(jīng)檢查存在慢性基礎(chǔ)疾?。?2)妊娠婦女；(3)20～60歲之間；(4)患者未知情同意。AIONFH且接受QZD患者的納入與排除標(biāo)準(zhǔn)和AIONFH患者一致，且必須經(jīng)過(guò)1個(gè)月QZD綜合治療。相對(duì)健康志愿者納入標(biāo)準(zhǔn)：(1)無(wú)經(jīng)影像學(xué)檢查確定無(wú)股骨頭壞死或其他髖關(guān)節(jié)疾??；(2)無(wú)慢性基礎(chǔ)疾?。粺o(wú)傳染性疾??；(3)年齡20～60歲；(4)志愿者知情同意。

1.3 采用的實(shí)驗(yàn)動(dòng)物模型 本研究采用SD大鼠共24只。性別：雄性；級(jí)別：SPF級(jí)。體重230～250 g，由廣東省醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供，合格編號(hào)為SCXK(粵)2014-0035；所有動(dòng)物實(shí)驗(yàn)在廣州中醫(yī)藥大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心執(zhí)行，編號(hào)為SCXK(粵)2013-0001，并進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)飼養(yǎng)，標(biāo)準(zhǔn)鼠糧適應(yīng)性飼養(yǎng)，室溫(23±2)℃，自由飲水，間隔光照12 h，并保持定期消毒、通風(fēng)，各組大鼠按照單籠培養(yǎng)原則執(zhí)行。

1.4 臨床和動(dòng)物倫理審查 本研究符合《赫爾辛基宣言》，并經(jīng)開(kāi)展臨床研究所在單位的倫理委員會(huì)批準(zhǔn)。每位患者在納入研究前均簽署知情同意書(shū)。所有原始數(shù)據(jù)來(lái)自廣州中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院關(guān)節(jié)骨科數(shù)據(jù)庫(kù)系統(tǒng)V1.0(登記號(hào)：2017SR274625)。動(dòng)物實(shí)驗(yàn)經(jīng)過(guò)廣州中醫(yī)藥大學(xué)動(dòng)物倫理委員會(huì)批準(zhǔn)(No. TCM4834332)

1.5 試劑與儀器 1%甲苯胺藍(lán)染色液(武漢賽維爾生物科技有限公司，中國(guó))、抗酒石酸酸性磷酸酶試劑盒(北京百奧萊博科技有限公司，中國(guó))；PCR試劑盒(ROCHE公司，美國(guó))；PCR引物(生工生物工程(上海)有限公司，中國(guó))；TP1020自動(dòng)脫水機(jī)(Leica Biosystems公司，美國(guó))、Autos全自動(dòng)染色機(jī)(Leica公司，德國(guó))；Leica RMZ126RT轉(zhuǎn)輪式石蠟切片機(jī)；EG1150H全自動(dòng)石蠟包埋機(jī)；BX53顯微鏡(Olympus公司，日本)；μCT100柜式錐形束微型CT(Scanco公司，瑞士)；image-pro plus軟件(Media Cybernetics公司，美國(guó))。QZD組成：半夏、陳皮、茯苓、甘草、熟地、芍藥、當(dāng)歸、川芎，均購(gòu)自廣州中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院中藥房。

1.6 方法

1.6.1 血清標(biāo)本收集、RNA提取與質(zhì)量檢測(cè) 對(duì)納入研究的AIONFH患者和相對(duì)健康組各5例的血清標(biāo)本進(jìn)行收集，應(yīng)用EDTA-K2抗凝管采集靜脈血8 mL。3 000 r/min離心10 min，將上層血清分裝至離心管中。應(yīng)用The miRCURYTM RNA Isolation Kit血漿miRNA抽提試劑，抽提總miRNA。隨后運(yùn)用紫外吸收測(cè)定法進(jìn)行濃度檢測(cè)。

1.6.2 PCR芯片檢測(cè)與分析 根據(jù)Exiqon公司提供的miRCURY LNATMUniversal RT microRNA PCR Panels標(biāo)準(zhǔn)操作流程進(jìn)行cDNA 合成和實(shí)時(shí)定量PCR，利用配套軟件ExiqonGenEx qPCR analysis software 對(duì)納入研究的AIONFH患者與相對(duì)健康組的miRNA進(jìn)行差異分析，統(tǒng)計(jì)分析采用t檢驗(yàn)，且取P<0.05，以及差異的倍數(shù)>2或<0.5為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

1.6.3 生物信息學(xué)分析 隨后通過(guò)對(duì)所獲得的差異miRNA進(jìn)行GO 顯著性功能分析，對(duì)差異miRNA對(duì)應(yīng)的靶基因進(jìn)行KEGG Pathway 顯著性分析；根據(jù)數(shù)據(jù)庫(kù)Microcosm(http://www.ebi.ac.uk/enright-srv/microcosm/htdocs/targets/v5/)、Miranda(http://www.microrna.org/microrna/home.do.)、Mirdb(http://mirdb.org/miRDB/)聯(lián)合分析，及參照文獻(xiàn)檢索研究得到差異miRNA與破骨分化和成骨分化相關(guān)的靶基因，構(gòu)建和預(yù)測(cè)miRNA調(diào)控網(wǎng)絡(luò)。

1.6.4 RT-qPCR檢測(cè) 用于人體血清、動(dòng)物血清和骨組織中定量檢測(cè)miR-628，以及動(dòng)物骨組織內(nèi)定量檢測(cè)Pten和Runx2，以β-actin為內(nèi)參。在人體試驗(yàn)中，收集各組受試對(duì)象血清。在動(dòng)物試驗(yàn)中，收集各組腹主動(dòng)脈血并分離血清，以及股骨頭骨組織。采用TRIZOL對(duì)RNA進(jìn)行提取，并進(jìn)行cDNA的合成。具體的操作按照TaqMan MicroRNA Reverse Transcription Kit(ABI)和 TaqMan MicroRNA Assays(ABI)所提供的指導(dǎo)手冊(cè)進(jìn)行。RT-qPCR的反應(yīng)條件如下：50℃ 2 min，95℃ 預(yù)變性2 min，設(shè)置的循環(huán)參數(shù)為95℃ 15 s，60℃ 60 s，總循環(huán)次數(shù)為40次。其中，每個(gè)加入的樣品共設(shè)置3個(gè)復(fù)孔，并按上述流程在PCR儀上進(jìn)行相應(yīng)的擴(kuò)增反應(yīng)。采用ΔΔCt法進(jìn)行相對(duì)定量分析。

1.6.5 動(dòng)物實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì) 隨機(jī)對(duì)照實(shí)驗(yàn)，于2017年8—10月在廣州中醫(yī)藥大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心及廣州中醫(yī)藥大學(xué)嶺南醫(yī)學(xué)中心國(guó)家重點(diǎn)學(xué)科中醫(yī)骨傷科學(xué)實(shí)驗(yàn)室完成。SD大鼠24只，共分為3組，正常對(duì)照組(正常組)、酒精組(模型組)、酒精+QZD組(實(shí)驗(yàn)組)。

1.6.6 AIONFH造模、干預(yù)、取材方法 所有SD大鼠參照Okazaki等[7]灌胃法，予食用白酒(乙醇體積分?jǐn)?shù)為56%)8 mL/(kg·d)，每天進(jìn)食后灌胃1次，連續(xù)灌胃6周。隨機(jī)抽取2只，行HE染色觀察骨陷窩變化。各組適應(yīng)性喂養(yǎng)7 d后進(jìn)入實(shí)驗(yàn)期12周。腹部注射QZD按照人的臨床等量劑量換算。正常組注射與QZD等體積生理鹽水。干預(yù)實(shí)驗(yàn)結(jié)束后，吸入麻醉各組SD大鼠，抽取腹主動(dòng)脈血液直至死亡，經(jīng)外側(cè)切口取出雙側(cè)股骨頭，左側(cè)于4%多聚甲醛保存，用于Micro CT檢測(cè)和病理組織學(xué)檢測(cè)，右側(cè)股骨頭和分離后血清于-80℃超低溫冰箱儲(chǔ)存，用于RT-qPCR檢測(cè)。

1.6.7 Micro CT檢測(cè) 本實(shí)驗(yàn)采用Scanco公司生產(chǎn)的μCT100型號(hào)錐形束Micro-CT。設(shè)備參數(shù)如下，采用5 μm焦點(diǎn)直徑射線；使用探測(cè)器：3072×400；采用分辨率：1.25 μm, 4 μm；采用圖像矩陣：511×511到8193×8193。采用Scan scale：100 mm×140 mm(?Xl)。取材方法：將AIONFH模型大鼠、實(shí)驗(yàn)組及正常組經(jīng)尾靜脈用注射器空氣注射并處死，從大鼠兩側(cè)臀肌延外側(cè)切開(kāi)，剪開(kāi)關(guān)節(jié)囊，全部暴露股骨頭，取用咬骨嵌從股骨頸處咬下，取出左側(cè)整個(gè)股骨頭和轉(zhuǎn)子部。對(duì)取下的標(biāo)本給予4%多聚甲醛，固定兩周，期間定時(shí)更換固定液。掃描時(shí)，將股骨近段縱軸與Micro-CT檢查床的移動(dòng)方向平行。將Micro-CT的獲得圖像經(jīng)校準(zhǔn)后股骨頭區(qū)域建立感興趣區(qū)(ROI)，感興趣區(qū)是完整股骨頭區(qū)域。所采用的檢測(cè)參數(shù)包括：組織體積(TV)、骨質(zhì)體積(BV)、骨小梁數(shù)量(Tb.N)、骨小梁厚度(Tb.Th)、骨小梁分離度(Tb.Sp)。

1.6.8 病理學(xué)染色檢查 對(duì)取下的左側(cè)股骨剔除其周?chē)M織肌肉，用組織剪刀剪下股骨頭，并循冠狀面切開(kāi)，用10%甲醛溶液固定48 h，放置在10%EDTA-Tris中進(jìn)行脫鈣，定期更換脫鈣液，確定完全脫鈣，用清水沖洗，并用乙醇進(jìn)行逐級(jí)脫水，二甲苯透明處理2 h，石蠟作包埋和切片處理，厚度保持4 μm，采用HE染色，染色完畢后在光鏡下，觀察股骨頭骨髓腔中的骨細(xì)胞和骨小梁形態(tài)等；1%甲苯胺藍(lán)染色，觀察各組骨組織內(nèi)成骨細(xì)胞形態(tài)及數(shù)量變化；Trap染色，觀察各組骨組織內(nèi)破骨細(xì)胞形態(tài)及數(shù)量變化。

2 結(jié)果

2.1 miRNA的表達(dá)譜分析與驗(yàn)證 芯片結(jié)果提示，與5例相對(duì)健康組相比，5例AIONFH組血清檢測(cè)的miRNAs中表達(dá)差異高達(dá)2倍或低至1/5。其中10個(gè)miRNAs表達(dá)均增高，20個(gè)miRNAs表達(dá)均降低，miR-628在AIONFH組中表達(dá)下調(diào)了8倍。選取并抽取另外21例AIONFH患者和21例相對(duì)健康組的血清標(biāo)本，應(yīng)用RT-qPCR對(duì)miR-628驗(yàn)證了其表達(dá)，結(jié)果與芯片表達(dá)譜基本一致(P<0.01)(圖1-A)。

2.2 QZD干預(yù)人體血清miR-628表達(dá) AIONFH組與相對(duì)健康組相比miR-628表達(dá)量降低，結(jié)果與表達(dá)譜分析和驗(yàn)證結(jié)果一致。中藥治療組miR-628表達(dá)量高于AIONFH組，與相對(duì)健康組之間無(wú)差別(圖1-B)。

2.3 miR-628生物信息學(xué)分析 通過(guò)數(shù)據(jù)庫(kù)GO分析對(duì)miR-628的靶基因進(jìn)行預(yù)測(cè)，在生物過(guò)程中miR-628的靶基因主要參與了細(xì)胞過(guò)程和生物調(diào)控過(guò)程。通過(guò)KEGG pathway數(shù)據(jù)庫(kù)分析，可發(fā)現(xiàn)miR-628的下游靶基因主要富集于多個(gè)通路共15個(gè)，分別是細(xì)胞通訊、信號(hào)傳導(dǎo)的細(xì)胞外機(jī)制與受體相互作用等，包括MAPK、TGF信號(hào)傳導(dǎo)通路等。經(jīng)檢索獲得與之相關(guān)的靶基因共有20個(gè)(P<0.05)，并結(jié)合文獻(xiàn)報(bào)告，確認(rèn)Pten和Runx2與“成骨”和“破骨”效應(yīng)相關(guān)聯(lián)。

2.4 AIONFH造模過(guò)程事件分析與miR-628血清檢測(cè) SD大鼠24只。16只用于建立AIONFH模型的大鼠中有1只在服用酒精不明原因后48 h死亡，15只存活，存活率為95%，補(bǔ)足原計(jì)劃數(shù)量。模型組共有8只出現(xiàn)不同程度AIONFH壞死征象，壞死發(fā)生率為100%(8/8),實(shí)驗(yàn)組共有7只出現(xiàn)壞死，壞死發(fā)生率為96%(7/8)。各組SD大鼠經(jīng)抽取和分離血清，并進(jìn)行RT-qPCR檢測(cè)，結(jié)果提示AIONFH模型組血清miR-628表達(dá)降低，實(shí)驗(yàn)組較模型組升高，與人體血清表達(dá)趨勢(shì)基本一致(P<0.05)(圖1-C)。

2.5 大鼠標(biāo)本HE染色檢測(cè) 模型組：空骨陷窩率增多，出現(xiàn)核固縮，核偏移。底倍鏡下骨小梁稀疏變細(xì)，出現(xiàn)骨髓細(xì)胞碎片，細(xì)胞數(shù)目及網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)較正常稀疏。正常組：骨小梁完整，骨小梁中的骨細(xì)胞清晰可見(jiàn)。骨小梁形態(tài)較好。(圖2)。

2.6 大鼠標(biāo)本甲苯胺藍(lán)染色和Trap染色檢測(cè) 同等干預(yù)條件下，各組骨組織接受經(jīng)甲苯胺藍(lán)染色、Trap染色。QZD干預(yù)后形成的成骨細(xì)胞密度均顯著高于模型組，結(jié)果提示QZD能顯著增強(qiáng)壞死骨組織的成骨化能力。與模型組相比，QZD對(duì)破骨細(xì)胞分化有抑制作用，可顯著降低細(xì)胞Trap活性。見(jiàn)圖2。

A：相對(duì)健康組和AIONFH組中血清的miR-628的表達(dá)情況；B：中藥治療組與相對(duì)健康組和AIONFH組進(jìn)行血清miR-628表達(dá)比較；C：正常組、模型組、實(shí)驗(yàn)組大鼠血清中miR-628表達(dá)比較

圖1 miR-628在人和動(dòng)物血清中的表達(dá)情況

圖2 大鼠模型組織病理學(xué)檢測(cè)

2.7 Micro-CT檢測(cè)AIONFH模型骨微結(jié)構(gòu) Micro-CT結(jié)果提示，模型組的BV/TV、Tb.N、Tb.Th值要比正常組降低，但Tb.sp值比正常組升高(P<0.05)。相反的，實(shí)驗(yàn)組的BV/TV、Tb.N、Tb.Th值比模型組更高(P<0.05)，但Tb.sp值無(wú)明顯差異(P>0.05)(表1)。在Micro-CT的圖像中可見(jiàn)模型組出現(xiàn)骨小梁結(jié)構(gòu)紊亂，骨小梁呈斷裂，且股骨頭內(nèi)骨質(zhì)較少；實(shí)驗(yàn)組與模型組比較，其股骨頭內(nèi)骨質(zhì)與骨量均有改善，說(shuō)明QZD增加AIONFH大鼠模型的壞死修復(fù)，促進(jìn)微觀骨性結(jié)構(gòu)改善(圖3)。

2.8 QZD調(diào)控動(dòng)物模型骨組織miR-628和靶基因表達(dá) miR-628在模型組內(nèi)的表達(dá)低于正常組，而實(shí)驗(yàn)組高于正常組(P<0.05)；Pten在模型組內(nèi)的表達(dá)水平較正常組低，實(shí)驗(yàn)組較正常組高(P<0.05)；Runx2在模型組內(nèi)的表達(dá)水平較正常組低，實(shí)驗(yàn)組較正常組高(P<0.05)。見(jiàn)表2。

3 討論

AIONFH是好發(fā)于嗜酒人群的骨科難治性疾病，也是股骨頭壞死最常見(jiàn)類(lèi)型之一[8]。由于我國(guó)是“酒文化”大國(guó)，因此合并AIONFH的病例也日益增多[9]。由于疾病的預(yù)后往往不佳，AIONFH嚴(yán)重影響著中青年(30～50歲)患者的工作學(xué)習(xí)和生活質(zhì)量，成為社會(huì)和經(jīng)濟(jì)負(fù)擔(dān)。目前，現(xiàn)代醫(yī)學(xué)AIONFH缺乏有效的早期診斷方法和針對(duì)性的治療手段?，F(xiàn)代中醫(yī)理論認(rèn)為，AIONFH屬于股骨頭壞死中的“痰瘀”證型[10]。從生化角度看，“痰瘀”證型具體表現(xiàn)為“骨形成”減弱，“骨吸收”增強(qiáng)的病理機(jī)制。

組別BT/TV(%)TB.Th(mm)Tb.Sp(mm)Tb/N(mm)正常組12.31±0.5300.084±0.0060.35±0.0202.43±0.190模型組4.25±1.050?0.021±0.007?0.42±0.040?1.56±0.320?實(shí)驗(yàn)組8.16±0.120#0.054±0.004#0.41±0.030#1.19±0.130

*與正常組比較P<0.05；#與模型組比較P<0.05

組別rno-miR-628Runx2Pten正常組1.73±0.035.67±0.714.31±0.87模型組0.54±0.04?2.21±0.31?1.13±0.31?實(shí)驗(yàn)組0.89±0.06#3.86±0.19#3.51±0.11#

*與正常組比較P<0.05；與模型組比較#P<0.05

以QZD為代表的“祛痰逐瘀法”經(jīng)驗(yàn)證能夠抑制骨細(xì)胞死亡，改善紊亂的骨小梁關(guān)系，或?qū)π迯?fù)AIONFH壞死組織有著優(yōu)秀的骨穩(wěn)態(tài)再平衡能力[11]。隨著對(duì)AIONFH精準(zhǔn)治療的需求越來(lái)越受到臨床關(guān)注，如何明確QZD調(diào)控骨穩(wěn)態(tài)背后的分子靶向調(diào)控，確切落實(shí)中藥復(fù)方的精確、準(zhǔn)時(shí)、個(gè)體化，成為了目前QZD治療包括AIONFH的關(guān)鍵所在。

本研究發(fā)現(xiàn)，以mRNA為主的轉(zhuǎn)錄組編碼的不穩(wěn)定，導(dǎo)致了AIONFH的復(fù)雜多樣性，miR-628是其中差異性較大的一個(gè)。這為藥物靶向干預(yù)提供了契機(jī)，而成為調(diào)控骨穩(wěn)態(tài)的關(guān)鍵所在。在已有研究中，已揭示了miRNA和藥物敏感性、有效性密切關(guān)系。miRNA是一類(lèi)內(nèi)源性非編碼小RNA，能夠通過(guò)與靶基因mRNA特異性結(jié)合而導(dǎo)致靶基因mRNA降解或翻譯抑制，從而對(duì)基因進(jìn)行轉(zhuǎn)錄后調(diào)控[12]。miRNA參與成骨細(xì)胞的增殖、分化和凋亡過(guò)程，同樣在包括AIONFH疾病的發(fā)生過(guò)程中發(fā)揮重要的調(diào)控作用[13-15]。本研究表明，QZD通過(guò)介導(dǎo)AIONFH中的miR-628的轉(zhuǎn)錄后調(diào)控，最終促成靶向基因的表達(dá)與效用蛋白的活化，進(jìn)而再平衡破骨能力和成骨能力，這也是AIONFH轉(zhuǎn)錄后調(diào)控骨穩(wěn)態(tài)的基本骨架。

本研究提示，QZD可調(diào)控骨組織Runx2的表達(dá)變化。Runx2是調(diào)控成骨效應(yīng)最關(guān)鍵的因子之一[16]。研究發(fā)現(xiàn)，BMSCs成骨分化可受到高濃度酒精的干預(yù)而減弱，并最終促成成脂分化的進(jìn)一步加強(qiáng)。其內(nèi)在機(jī)制與PI3K/Akt/mTOR信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路激活有關(guān)。該通路激活可造成骨特異性轉(zhuǎn)錄因子Runx2表達(dá)下調(diào)，并激活p70S6K進(jìn)而提高PPAR表達(dá)，造成成脂分化的增加[17]。將QZD干預(yù)下的Runx2的表達(dá)與病理組織變化相結(jié)合，可提示QZD對(duì)改善AIONFH骨穩(wěn)態(tài)，促進(jìn)成骨效應(yīng)的巨大作用。

本研究結(jié)果同時(shí)提示，QZD可降低AIONFH骨組織中Pten的表達(dá)，進(jìn)而抑制破骨細(xì)胞的增加。Pten脂質(zhì)磷酸酶的活性對(duì)介導(dǎo)細(xì)胞的分化與凋亡發(fā)揮極為關(guān)鍵性的作用[18-19]。其生物機(jī)制或包括有以下情況：脂質(zhì)磷酸酶在G1期內(nèi)促成了細(xì)胞周期的快速阻滯，另外多種刺激誘導(dǎo)下促進(jìn)了細(xì)胞的凋亡。研究發(fā)現(xiàn)，Pten可使PIP3處于較低水平，可阻斷PI3K的AKT通路，進(jìn)而誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡及細(xì)胞周期的阻滯。抑制PTEN活性導(dǎo)致Akt磷酸化水平增加和細(xì)胞增殖增強(qiáng)[20]。另外，Pten過(guò)度表達(dá)可抑制RANKL激活的Akt和破骨細(xì)胞分化，以及骨橋蛋白所激活的細(xì)胞遷移[21]。

綜上所述，本研究從人體實(shí)驗(yàn)和動(dòng)物模型兩個(gè)層面觀察QZD對(duì)AIONFH的防治作用，篩選AIONFH中特異性表達(dá)miR-628，明確了QZD在人體血清中對(duì)miR-628表達(dá)的作用，以及在動(dòng)物模型中對(duì)miR-628以及成骨和破骨相關(guān)基因Runx2和Pten的表達(dá)，驗(yàn)證QZD經(jīng)miR-628/Runx2/Pten通路對(duì)成骨、破骨功能進(jìn)行調(diào)控，為臨床防治AIONFH 的合理用藥提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。