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        祛痰逐瘀方經(jīng)miR-628/Pten/Runx2調(diào)控酒精性股骨頭壞死骨穩(wěn)態(tài)代謝機(jī)制研究*

        2019-03-06 09:22:22洪郭駒魏秋實(shí)韓曉蕊何偉陳鎮(zhèn)秋
        廣東醫(yī)學(xué) 2019年2期
        關(guān)鍵詞:血清檢測(cè)模型

        洪郭駒, 魏秋實(shí), 韓曉蕊, 何偉, 陳鎮(zhèn)秋△

        1 阿爾伯塔大學(xué)醫(yī)學(xué)院外科部(加拿大阿爾伯塔省埃德蒙頓T6G 2R3); 2廣州中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院關(guān)節(jié)骨科(廣東廣州 510405); 3廣州市第一人民醫(yī)院(華南理工大學(xué)第二附屬醫(yī)院)放射科(廣東廣州 510180)

        酒精性股骨頭壞死(alcohol-induced osteonecrosis of femoral head, AIONFH)是由于長(zhǎng)期過(guò)量飲用含酒精類(lèi)飲品所導(dǎo)致的骨組織活性降低或者死亡過(guò)程。其機(jī)制經(jīng)研究發(fā)現(xiàn),是由于酒精誘導(dǎo)骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞(BMSC)成骨能力減弱引起代謝紊亂[1-2]。microRNA(miRNA)是一類(lèi)內(nèi)源性非編碼小RNA,miRNA通過(guò)與靶基因?qū)崿F(xiàn)特異性結(jié)合,從而抑制或激活靶基因的降解或翻譯功能,進(jìn)而對(duì)相應(yīng)的靶基因進(jìn)行調(diào)控。miRNA 參與體內(nèi)BMSC的增殖、分化和凋亡過(guò)程,決定股骨頭壞死疾病發(fā)展走向[3-5]。選擇特定的通過(guò)藥物介導(dǎo)miRNA調(diào)控骨代謝作用,將有利于AIONFH治療在未來(lái)的發(fā)展中找到新的突破口。中醫(yī)藥對(duì)股骨頭壞死具有較為良好的效果,其中以祛痰逐瘀方(QutanZhuyu Decoction, QZD)在臨床實(shí)踐中對(duì)防治AIONFH效果明顯,目前已廣泛運(yùn)用于中醫(yī)臨床當(dāng)中,特別針對(duì)過(guò)度飲酒導(dǎo)致AIONFH的“痰濕血瘀”體質(zhì)人群,可以降低組織內(nèi)脂肪含量,提高成骨能力[6]。QZD在對(duì)抗骨組織內(nèi)脂肪增加方面有較大的潛力和效力。鑒于此,本研究通過(guò)miRCURY LNATMUniversal RT microRNA PCR Panels檢測(cè)AIONFH患者血清,并使部分患者服用QZD進(jìn)而篩查和確定特異性miRNA;同時(shí)建立AIONFH大鼠模型,采用RT-qPCR、病理組織學(xué)染色、Micro-CT等檢驗(yàn)方法,觀察QZD經(jīng)特異性miRNA調(diào)控AIONFH成骨分化的機(jī)制。

        1 材料與方法

        1.1 研究對(duì)象 研究團(tuán)隊(duì)于2017年1—3月間,選取在廣州中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院保髖病區(qū)住院接受保髖治療的AIONFH患者34例(AIONFH組),男20例,女14例,平均年齡(43±4.2)歲。AIONFH患者且服用QZD保守治療8例(中藥治療組),男6例,女2例,平均年齡(41.2±5.5)歲。另外有相對(duì)健康志愿者34例(相對(duì)健康組),男18例,女16例,平均年齡(36.1±7.3)歲。所有納入對(duì)象進(jìn)行髖部MRI檢查及臨床體格檢查。

        1.2 納入與排除標(biāo)準(zhǔn) AIONFH患者納入標(biāo)準(zhǔn):(1)符合《成人股骨頭壞死診療標(biāo)準(zhǔn)專(zhuān)家共識(shí)(2012年版)》中所列舉的股骨頭壞死診斷標(biāo)準(zhǔn);(2)經(jīng)檢查無(wú)慢性基礎(chǔ)疾病,如糖尿病、心臟病等;(3)既往無(wú)髖部受傷導(dǎo)致骨質(zhì)破壞;無(wú)糖皮質(zhì)激素使用史,排除創(chuàng)傷性和激素性股骨頭壞死可能;(4)需具有較為明確的過(guò)度、長(zhǎng)期飲酒史;(5)未曾長(zhǎng)時(shí)間服用調(diào)節(jié)骨代謝藥物;(6)20~60歲之間;(7)患者知情同意。排除標(biāo)準(zhǔn):(1)經(jīng)檢查存在慢性基礎(chǔ)疾?。?2)妊娠婦女;(3)20~60歲之間;(4)患者未知情同意。AIONFH且接受QZD患者的納入與排除標(biāo)準(zhǔn)和AIONFH患者一致,且必須經(jīng)過(guò)1個(gè)月QZD綜合治療。相對(duì)健康志愿者納入標(biāo)準(zhǔn):(1)無(wú)經(jīng)影像學(xué)檢查確定無(wú)股骨頭壞死或其他髖關(guān)節(jié)疾??;(2)無(wú)慢性基礎(chǔ)疾?。粺o(wú)傳染性疾??;(3)年齡20~60歲;(4)志愿者知情同意。

        1.3 采用的實(shí)驗(yàn)動(dòng)物模型 本研究采用SD大鼠共24只。性別:雄性;級(jí)別:SPF級(jí)。體重230~250 g,由廣東省醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供,合格編號(hào)為SCXK(粵)2014-0035;所有動(dòng)物實(shí)驗(yàn)在廣州中醫(yī)藥大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心執(zhí)行,編號(hào)為SCXK(粵)2013-0001,并進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)飼養(yǎng),標(biāo)準(zhǔn)鼠糧適應(yīng)性飼養(yǎng),室溫(23±2)℃,自由飲水,間隔光照12 h,并保持定期消毒、通風(fēng),各組大鼠按照單籠培養(yǎng)原則執(zhí)行。

        1.4 臨床和動(dòng)物倫理審查 本研究符合《赫爾辛基宣言》,并經(jīng)開(kāi)展臨床研究所在單位的倫理委員會(huì)批準(zhǔn)。每位患者在納入研究前均簽署知情同意書(shū)。所有原始數(shù)據(jù)來(lái)自廣州中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院關(guān)節(jié)骨科數(shù)據(jù)庫(kù)系統(tǒng)V1.0(登記號(hào):2017SR274625)。動(dòng)物實(shí)驗(yàn)經(jīng)過(guò)廣州中醫(yī)藥大學(xué)動(dòng)物倫理委員會(huì)批準(zhǔn)(No. TCM4834332)

        1.5 試劑與儀器 1%甲苯胺藍(lán)染色液(武漢賽維爾生物科技有限公司,中國(guó))、抗酒石酸酸性磷酸酶試劑盒(北京百奧萊博科技有限公司,中國(guó));PCR試劑盒(ROCHE公司,美國(guó));PCR引物(生工生物工程(上海)有限公司,中國(guó));TP1020自動(dòng)脫水機(jī)(Leica Biosystems公司,美國(guó))、Autos全自動(dòng)染色機(jī)(Leica公司,德國(guó));Leica RMZ126RT轉(zhuǎn)輪式石蠟切片機(jī);EG1150H全自動(dòng)石蠟包埋機(jī);BX53顯微鏡(Olympus公司,日本);μCT100柜式錐形束微型CT(Scanco公司,瑞士);image-pro plus軟件(Media Cybernetics公司,美國(guó))。QZD組成:半夏、陳皮、茯苓、甘草、熟地、芍藥、當(dāng)歸、川芎,均購(gòu)自廣州中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院中藥房。

        1.6 方法

        1.6.1 血清標(biāo)本收集、RNA提取與質(zhì)量檢測(cè) 對(duì)納入研究的AIONFH患者和相對(duì)健康組各5例的血清標(biāo)本進(jìn)行收集,應(yīng)用EDTA-K2抗凝管采集靜脈血8 mL。3 000 r/min離心10 min,將上層血清分裝至離心管中。應(yīng)用The miRCURYTM RNA Isolation Kit血漿miRNA抽提試劑,抽提總miRNA。隨后運(yùn)用紫外吸收測(cè)定法進(jìn)行濃度檢測(cè)。

        1.6.2 PCR芯片檢測(cè)與分析 根據(jù)Exiqon公司提供的miRCURY LNATMUniversal RT microRNA PCR Panels標(biāo)準(zhǔn)操作流程進(jìn)行cDNA 合成和實(shí)時(shí)定量PCR,利用配套軟件ExiqonGenEx qPCR analysis software 對(duì)納入研究的AIONFH患者與相對(duì)健康組的miRNA進(jìn)行差異分析,統(tǒng)計(jì)分析采用t檢驗(yàn),且取P<0.05,以及差異的倍數(shù)>2或<0.5為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

        1.6.3 生物信息學(xué)分析 隨后通過(guò)對(duì)所獲得的差異miRNA進(jìn)行GO 顯著性功能分析,對(duì)差異miRNA對(duì)應(yīng)的靶基因進(jìn)行KEGG Pathway 顯著性分析;根據(jù)數(shù)據(jù)庫(kù)Microcosm(http://www.ebi.ac.uk/enright-srv/microcosm/htdocs/targets/v5/)、Miranda(http://www.microrna.org/microrna/home.do.)、Mirdb(http://mirdb.org/miRDB/)聯(lián)合分析,及參照文獻(xiàn)檢索研究得到差異miRNA與破骨分化和成骨分化相關(guān)的靶基因,構(gòu)建和預(yù)測(cè)miRNA調(diào)控網(wǎng)絡(luò)。

        1.6.4 RT-qPCR檢測(cè) 用于人體血清、動(dòng)物血清和骨組織中定量檢測(cè)miR-628,以及動(dòng)物骨組織內(nèi)定量檢測(cè)Pten和Runx2,以β-actin為內(nèi)參。在人體試驗(yàn)中,收集各組受試對(duì)象血清。在動(dòng)物試驗(yàn)中,收集各組腹主動(dòng)脈血并分離血清,以及股骨頭骨組織。采用TRIZOL對(duì)RNA進(jìn)行提取,并進(jìn)行cDNA的合成。具體的操作按照TaqMan MicroRNA Reverse Transcription Kit(ABI)和 TaqMan MicroRNA Assays(ABI)所提供的指導(dǎo)手冊(cè)進(jìn)行。RT-qPCR的反應(yīng)條件如下:50℃ 2 min,95℃ 預(yù)變性2 min,設(shè)置的循環(huán)參數(shù)為95℃ 15 s,60℃ 60 s,總循環(huán)次數(shù)為40次。其中,每個(gè)加入的樣品共設(shè)置3個(gè)復(fù)孔,并按上述流程在PCR儀上進(jìn)行相應(yīng)的擴(kuò)增反應(yīng)。采用ΔΔCt法進(jìn)行相對(duì)定量分析。

        1.6.5 動(dòng)物實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì) 隨機(jī)對(duì)照實(shí)驗(yàn),于2017年8—10月在廣州中醫(yī)藥大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心及廣州中醫(yī)藥大學(xué)嶺南醫(yī)學(xué)中心國(guó)家重點(diǎn)學(xué)科中醫(yī)骨傷科學(xué)實(shí)驗(yàn)室完成。SD大鼠24只,共分為3組,正常對(duì)照組(正常組)、酒精組(模型組)、酒精+QZD組(實(shí)驗(yàn)組)。

        1.6.6 AIONFH造模、干預(yù)、取材方法 所有SD大鼠參照Okazaki等[7]灌胃法,予食用白酒(乙醇體積分?jǐn)?shù)為56%)8 mL/(kg·d),每天進(jìn)食后灌胃1次,連續(xù)灌胃6周。隨機(jī)抽取2只,行HE染色觀察骨陷窩變化。各組適應(yīng)性喂養(yǎng)7 d后進(jìn)入實(shí)驗(yàn)期12周。腹部注射QZD按照人的臨床等量劑量換算。正常組注射與QZD等體積生理鹽水。干預(yù)實(shí)驗(yàn)結(jié)束后,吸入麻醉各組SD大鼠,抽取腹主動(dòng)脈血液直至死亡,經(jīng)外側(cè)切口取出雙側(cè)股骨頭,左側(cè)于4%多聚甲醛保存,用于Micro CT檢測(cè)和病理組織學(xué)檢測(cè),右側(cè)股骨頭和分離后血清于-80℃超低溫冰箱儲(chǔ)存,用于RT-qPCR檢測(cè)。

        1.6.7 Micro CT檢測(cè) 本實(shí)驗(yàn)采用Scanco公司生產(chǎn)的μCT100型號(hào)錐形束Micro-CT。設(shè)備參數(shù)如下,采用5 μm焦點(diǎn)直徑射線;使用探測(cè)器:3072×400;采用分辨率:1.25 μm, 4 μm;采用圖像矩陣:511×511到8193×8193。采用Scan scale:100 mm×140 mm(?Xl)。取材方法:將AIONFH模型大鼠、實(shí)驗(yàn)組及正常組經(jīng)尾靜脈用注射器空氣注射并處死,從大鼠兩側(cè)臀肌延外側(cè)切開(kāi),剪開(kāi)關(guān)節(jié)囊,全部暴露股骨頭,取用咬骨嵌從股骨頸處咬下,取出左側(cè)整個(gè)股骨頭和轉(zhuǎn)子部。對(duì)取下的標(biāo)本給予4%多聚甲醛,固定兩周,期間定時(shí)更換固定液。掃描時(shí),將股骨近段縱軸與Micro-CT檢查床的移動(dòng)方向平行。將Micro-CT的獲得圖像經(jīng)校準(zhǔn)后股骨頭區(qū)域建立感興趣區(qū)(ROI),感興趣區(qū)是完整股骨頭區(qū)域。所采用的檢測(cè)參數(shù)包括:組織體積(TV)、骨質(zhì)體積(BV)、骨小梁數(shù)量(Tb.N)、骨小梁厚度(Tb.Th)、骨小梁分離度(Tb.Sp)。

        1.6.8 病理學(xué)染色檢查 對(duì)取下的左側(cè)股骨剔除其周?chē)M織肌肉,用組織剪刀剪下股骨頭,并循冠狀面切開(kāi),用10%甲醛溶液固定48 h,放置在10%EDTA-Tris中進(jìn)行脫鈣,定期更換脫鈣液,確定完全脫鈣,用清水沖洗,并用乙醇進(jìn)行逐級(jí)脫水,二甲苯透明處理2 h,石蠟作包埋和切片處理,厚度保持4 μm,采用HE染色,染色完畢后在光鏡下,觀察股骨頭骨髓腔中的骨細(xì)胞和骨小梁形態(tài)等;1%甲苯胺藍(lán)染色,觀察各組骨組織內(nèi)成骨細(xì)胞形態(tài)及數(shù)量變化;Trap染色,觀察各組骨組織內(nèi)破骨細(xì)胞形態(tài)及數(shù)量變化。

        2 結(jié)果

        2.1 miRNA的表達(dá)譜分析與驗(yàn)證 芯片結(jié)果提示,與5例相對(duì)健康組相比,5例AIONFH組血清檢測(cè)的miRNAs中表達(dá)差異高達(dá)2倍或低至1/5。其中10個(gè)miRNAs表達(dá)均增高,20個(gè)miRNAs表達(dá)均降低,miR-628在AIONFH組中表達(dá)下調(diào)了8倍。選取并抽取另外21例AIONFH患者和21例相對(duì)健康組的血清標(biāo)本,應(yīng)用RT-qPCR對(duì)miR-628驗(yàn)證了其表達(dá),結(jié)果與芯片表達(dá)譜基本一致(P<0.01)(圖1-A)。

        2.2 QZD干預(yù)人體血清miR-628表達(dá) AIONFH組與相對(duì)健康組相比miR-628表達(dá)量降低,結(jié)果與表達(dá)譜分析和驗(yàn)證結(jié)果一致。中藥治療組miR-628表達(dá)量高于AIONFH組,與相對(duì)健康組之間無(wú)差別(圖1-B)。

        2.3 miR-628生物信息學(xué)分析 通過(guò)數(shù)據(jù)庫(kù)GO分析對(duì)miR-628的靶基因進(jìn)行預(yù)測(cè),在生物過(guò)程中miR-628的靶基因主要參與了細(xì)胞過(guò)程和生物調(diào)控過(guò)程。通過(guò)KEGG pathway數(shù)據(jù)庫(kù)分析,可發(fā)現(xiàn)miR-628的下游靶基因主要富集于多個(gè)通路共15個(gè),分別是細(xì)胞通訊、信號(hào)傳導(dǎo)的細(xì)胞外機(jī)制與受體相互作用等,包括MAPK、TGF信號(hào)傳導(dǎo)通路等。經(jīng)檢索獲得與之相關(guān)的靶基因共有20個(gè)(P<0.05),并結(jié)合文獻(xiàn)報(bào)告,確認(rèn)Pten和Runx2與“成骨”和“破骨”效應(yīng)相關(guān)聯(lián)。

        2.4 AIONFH造模過(guò)程事件分析與miR-628血清檢測(cè) SD大鼠24只。16只用于建立AIONFH模型的大鼠中有1只在服用酒精不明原因后48 h死亡,15只存活,存活率為95%,補(bǔ)足原計(jì)劃數(shù)量。模型組共有8只出現(xiàn)不同程度AIONFH壞死征象,壞死發(fā)生率為100%(8/8),實(shí)驗(yàn)組共有7只出現(xiàn)壞死,壞死發(fā)生率為96%(7/8)。各組SD大鼠經(jīng)抽取和分離血清,并進(jìn)行RT-qPCR檢測(cè),結(jié)果提示AIONFH模型組血清miR-628表達(dá)降低,實(shí)驗(yàn)組較模型組升高,與人體血清表達(dá)趨勢(shì)基本一致(P<0.05)(圖1-C)。

        2.5 大鼠標(biāo)本HE染色檢測(cè) 模型組:空骨陷窩率增多,出現(xiàn)核固縮,核偏移。底倍鏡下骨小梁稀疏變細(xì),出現(xiàn)骨髓細(xì)胞碎片,細(xì)胞數(shù)目及網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)較正常稀疏。正常組:骨小梁完整,骨小梁中的骨細(xì)胞清晰可見(jiàn)。骨小梁形態(tài)較好。(圖2)。

        2.6 大鼠標(biāo)本甲苯胺藍(lán)染色和Trap染色檢測(cè) 同等干預(yù)條件下,各組骨組織接受經(jīng)甲苯胺藍(lán)染色、Trap染色。QZD干預(yù)后形成的成骨細(xì)胞密度均顯著高于模型組,結(jié)果提示QZD能顯著增強(qiáng)壞死骨組織的成骨化能力。與模型組相比,QZD對(duì)破骨細(xì)胞分化有抑制作用,可顯著降低細(xì)胞Trap活性。見(jiàn)圖2。

        A:相對(duì)健康組和AIONFH組中血清的miR-628的表達(dá)情況;B:中藥治療組與相對(duì)健康組和AIONFH組進(jìn)行血清miR-628表達(dá)比較;C:正常組、模型組、實(shí)驗(yàn)組大鼠血清中miR-628表達(dá)比較

        圖1 miR-628在人和動(dòng)物血清中的表達(dá)情況

        圖2 大鼠模型組織病理學(xué)檢測(cè)

        2.7 Micro-CT檢測(cè)AIONFH模型骨微結(jié)構(gòu) Micro-CT結(jié)果提示,模型組的BV/TV、Tb.N、Tb.Th值要比正常組降低,但Tb.sp值比正常組升高(P<0.05)。相反的,實(shí)驗(yàn)組的BV/TV、Tb.N、Tb.Th值比模型組更高(P<0.05),但Tb.sp值無(wú)明顯差異(P>0.05)(表1)。在Micro-CT的圖像中可見(jiàn)模型組出現(xiàn)骨小梁結(jié)構(gòu)紊亂,骨小梁呈斷裂,且股骨頭內(nèi)骨質(zhì)較少;實(shí)驗(yàn)組與模型組比較,其股骨頭內(nèi)骨質(zhì)與骨量均有改善,說(shuō)明QZD增加AIONFH大鼠模型的壞死修復(fù),促進(jìn)微觀骨性結(jié)構(gòu)改善(圖3)。

        2.8 QZD調(diào)控動(dòng)物模型骨組織miR-628和靶基因表達(dá) miR-628在模型組內(nèi)的表達(dá)低于正常組,而實(shí)驗(yàn)組高于正常組(P<0.05);Pten在模型組內(nèi)的表達(dá)水平較正常組低,實(shí)驗(yàn)組較正常組高(P<0.05);Runx2在模型組內(nèi)的表達(dá)水平較正常組低,實(shí)驗(yàn)組較正常組高(P<0.05)。見(jiàn)表2。

        3 討論

        AIONFH是好發(fā)于嗜酒人群的骨科難治性疾病,也是股骨頭壞死最常見(jiàn)類(lèi)型之一[8]。由于我國(guó)是“酒文化”大國(guó),因此合并AIONFH的病例也日益增多[9]。由于疾病的預(yù)后往往不佳,AIONFH嚴(yán)重影響著中青年(30~50歲)患者的工作學(xué)習(xí)和生活質(zhì)量,成為社會(huì)和經(jīng)濟(jì)負(fù)擔(dān)。目前,現(xiàn)代醫(yī)學(xué)AIONFH缺乏有效的早期診斷方法和針對(duì)性的治療手段?,F(xiàn)代中醫(yī)理論認(rèn)為,AIONFH屬于股骨頭壞死中的“痰瘀”證型[10]。從生化角度看,“痰瘀”證型具體表現(xiàn)為“骨形成”減弱,“骨吸收”增強(qiáng)的病理機(jī)制。

        組別BT/TV(%)TB.Th(mm)Tb.Sp(mm)Tb/N(mm)正常組12.31±0.5300.084±0.0060.35±0.0202.43±0.190模型組4.25±1.050?0.021±0.007?0.42±0.040?1.56±0.320?實(shí)驗(yàn)組8.16±0.120#0.054±0.004#0.41±0.030#1.19±0.130

        *與正常組比較P<0.05;#與模型組比較P<0.05

        組別rno-miR-628Runx2Pten正常組1.73±0.035.67±0.714.31±0.87模型組0.54±0.04?2.21±0.31?1.13±0.31?實(shí)驗(yàn)組0.89±0.06#3.86±0.19#3.51±0.11#

        *與正常組比較P<0.05;與模型組比較#P<0.05

        以QZD為代表的“祛痰逐瘀法”經(jīng)驗(yàn)證能夠抑制骨細(xì)胞死亡,改善紊亂的骨小梁關(guān)系,或?qū)π迯?fù)AIONFH壞死組織有著優(yōu)秀的骨穩(wěn)態(tài)再平衡能力[11]。隨著對(duì)AIONFH精準(zhǔn)治療的需求越來(lái)越受到臨床關(guān)注,如何明確QZD調(diào)控骨穩(wěn)態(tài)背后的分子靶向調(diào)控,確切落實(shí)中藥復(fù)方的精確、準(zhǔn)時(shí)、個(gè)體化,成為了目前QZD治療包括AIONFH的關(guān)鍵所在。

        本研究發(fā)現(xiàn),以mRNA為主的轉(zhuǎn)錄組編碼的不穩(wěn)定,導(dǎo)致了AIONFH的復(fù)雜多樣性,miR-628是其中差異性較大的一個(gè)。這為藥物靶向干預(yù)提供了契機(jī),而成為調(diào)控骨穩(wěn)態(tài)的關(guān)鍵所在。在已有研究中,已揭示了miRNA和藥物敏感性、有效性密切關(guān)系。miRNA是一類(lèi)內(nèi)源性非編碼小RNA,能夠通過(guò)與靶基因mRNA特異性結(jié)合而導(dǎo)致靶基因mRNA降解或翻譯抑制,從而對(duì)基因進(jìn)行轉(zhuǎn)錄后調(diào)控[12]。miRNA參與成骨細(xì)胞的增殖、分化和凋亡過(guò)程,同樣在包括AIONFH疾病的發(fā)生過(guò)程中發(fā)揮重要的調(diào)控作用[13-15]。本研究表明,QZD通過(guò)介導(dǎo)AIONFH中的miR-628的轉(zhuǎn)錄后調(diào)控,最終促成靶向基因的表達(dá)與效用蛋白的活化,進(jìn)而再平衡破骨能力和成骨能力,這也是AIONFH轉(zhuǎn)錄后調(diào)控骨穩(wěn)態(tài)的基本骨架。

        本研究提示,QZD可調(diào)控骨組織Runx2的表達(dá)變化。Runx2是調(diào)控成骨效應(yīng)最關(guān)鍵的因子之一[16]。研究發(fā)現(xiàn),BMSCs成骨分化可受到高濃度酒精的干預(yù)而減弱,并最終促成成脂分化的進(jìn)一步加強(qiáng)。其內(nèi)在機(jī)制與PI3K/Akt/mTOR信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路激活有關(guān)。該通路激活可造成骨特異性轉(zhuǎn)錄因子Runx2表達(dá)下調(diào),并激活p70S6K進(jìn)而提高PPAR表達(dá),造成成脂分化的增加[17]。將QZD干預(yù)下的Runx2的表達(dá)與病理組織變化相結(jié)合,可提示QZD對(duì)改善AIONFH骨穩(wěn)態(tài),促進(jìn)成骨效應(yīng)的巨大作用。

        本研究結(jié)果同時(shí)提示,QZD可降低AIONFH骨組織中Pten的表達(dá),進(jìn)而抑制破骨細(xì)胞的增加。Pten脂質(zhì)磷酸酶的活性對(duì)介導(dǎo)細(xì)胞的分化與凋亡發(fā)揮極為關(guān)鍵性的作用[18-19]。其生物機(jī)制或包括有以下情況:脂質(zhì)磷酸酶在G1期內(nèi)促成了細(xì)胞周期的快速阻滯,另外多種刺激誘導(dǎo)下促進(jìn)了細(xì)胞的凋亡。研究發(fā)現(xiàn),Pten可使PIP3處于較低水平,可阻斷PI3K的AKT通路,進(jìn)而誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡及細(xì)胞周期的阻滯。抑制PTEN活性導(dǎo)致Akt磷酸化水平增加和細(xì)胞增殖增強(qiáng)[20]。另外,Pten過(guò)度表達(dá)可抑制RANKL激活的Akt和破骨細(xì)胞分化,以及骨橋蛋白所激活的細(xì)胞遷移[21]。

        綜上所述,本研究從人體實(shí)驗(yàn)和動(dòng)物模型兩個(gè)層面觀察QZD對(duì)AIONFH的防治作用,篩選AIONFH中特異性表達(dá)miR-628,明確了QZD在人體血清中對(duì)miR-628表達(dá)的作用,以及在動(dòng)物模型中對(duì)miR-628以及成骨和破骨相關(guān)基因Runx2和Pten的表達(dá),驗(yàn)證QZD經(jīng)miR-628/Runx2/Pten通路對(duì)成骨、破骨功能進(jìn)行調(diào)控,為臨床防治AIONFH 的合理用藥提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

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