劉旭東, 徐新杰, 趙壯志, 呂萍

廣西中醫(yī)藥大學附屬瑞康醫(yī)院肝病科(廣西南寧 530011)

內(nèi)毒素主要來自腸道的革蘭陰性桿菌，成分是其細胞壁上的脂多糖(lipopolysaccharide，LPS)，內(nèi)毒素血癥與肝纖維化關(guān)系密切[1]?，F(xiàn)有研究表明，LPS通過活化肝星狀細胞Toll樣受體4(Toll-like receptor 4，TLR4)通路，下調(diào)了轉(zhuǎn)化生長因子-β(TGF-β)假受體骨成形蛋白-激活素膜結(jié)合阻斷因子(BMP and the activin membrane-bound inhibitor，BAMBI，放大了TGF-β信號，促進了肝纖維化[2]。大黃蟄蟲丸是祖國醫(yī)學活血祛瘀的代表方藥，中醫(yī)認為肝纖維化主要病機是瘀血阻絡(luò)，大黃蟄蟲丸切合肝纖維化的病機，并且在中國中西醫(yī)結(jié)合學會肝纖維化診治指南中被推薦使用。2015年1月至2018年5月,為明確大黃蟄蟲丸抗肝纖維化機制，是否能阻斷LPS與TLR4的結(jié)合，我們設(shè)計了該實驗。

1 材料與方法

1.1 實驗動物 健康清潔級雄性，Wistar大鼠，250～300 g，動物合格證號SCXK(軍)-2012-0010，購于第三軍醫(yī)大學實驗動物中心。大鼠肝星狀細胞系HSC-T6，購于上海中國科學院細胞庫。

1.2 主要試劑和耗材 DMEM 培養(yǎng)基、M199培養(yǎng)基、胎牛血清、牛血清白蛋白(美國Gibco公司)；胰蛋白酶；青霉素-鏈霉素溶液、DAPI、抗熒光淬滅劑(碧云天公司)；PBS(北京中杉)；DMSO、一抗LPS(美國Amresco公司)；臺盼藍粉末(美國Sigma公司)；多聚甲醛、TritonX-100(上海生工)；山羊血清(美國Hyclone公司)；激光掃描共聚焦顯微鏡(德國Leica公司)、LPS/PE(博奧森公司 批號：bs-2351R-PE)。

1.3 方法

1.3.1 大鼠原代肝星狀細胞的分離培養(yǎng)鑒定

1.3.1.1 分離方法 將大鼠以10%水合氯醛麻醉，常規(guī)消毒后打開腹腔，經(jīng)門靜脈插管并肝素化(1 000 U/只)后，連接滴液瓶，剪斷下腔靜脈放血，快速灌注500 mL D-Hanks液至肝臟變白，流出液清亮。分離肝臟至大培養(yǎng)皿中，繼續(xù)灌注0.05%鏈酶蛋白酶液100 mL和0.025%膠原酶液100 mL，每分鐘約60滴。收集灌注液于燒杯內(nèi)，剪碎肝臟剔除肝包膜及大血管后，連同收集的酶液置于磁力攪拌器上，加入DNaseI(終濃度40 μg/mL)，調(diào)整至200 r/min，繼續(xù)消化45 min，200目鋼絲濾網(wǎng)過濾。

1.3.1.2 洗滌收集 室溫條件下濾液離心低速離心(50g，3 min)1～2次，去除未消化完全的肝細胞，然后以1 200 r/min離心7 min，吸棄上清液，加入Hanks液，小心吹打使細胞充分離散懸浮，再按上述條件離心洗滌1～2次，直至上清液較澄清，棄上清液，得到沉淀的肝NPC，加20 mL的DMEM培養(yǎng)液充分吹散懸浮細胞。

1.3.1.3 分離純化 將1份生理鹽水加入9份的Percoll細胞分離原液，然后再稀釋成30%和70% 2種濃度各10 mL。取7支5 mL的玻璃離心管，依次小心加入約1.5 mL 70%Percoll液(1.097 g/mL)、30%(1.045 g/mL)、和肝NPC懸液，低溫離心(500g，4°)30 min。分別仔細吸取肝NPC懸液和30%Percoll液、30%Percoll液和70%Percoll液界面之間的細胞，上層為HSC細胞，下面的為枯否細胞。加Hanks液按上述條件再洗滌2遍，以含20%新生小牛血清的DMEM或M199培養(yǎng)液懸浮細胞。

1.3.1.4 活性的鑒定 活性檢測采用臺盼藍染色法。細胞在325 nm波長紫外光的激發(fā)下自發(fā)綠色熒光。

1.3.2 原代HSC與HSC-T6細胞系培養(yǎng)傳代

1.3.2.1 原代HSC培養(yǎng)傳代 分離獲得HSC細胞以1×104cells/cm2密度接種于含15%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)液中貼壁培養(yǎng)。每隔2 d換去1/3的培養(yǎng)液，培養(yǎng)至7 d后，HSC細胞已基本融合，并開始明顯分裂增殖成團簇狀。細胞鋪滿底層時即可傳代，用0.25%胰蛋白酶37℃消化3～5 min，小牛血清終止繼續(xù)消化，收集細胞懸液，上述條件離心洗滌1～2次，以1×105cells/cm2的細胞密度接種于6孔培養(yǎng)板。貼壁培養(yǎng)12 h后，吸棄上清液，分別加入含20%藥物血清或不含藥物大鼠血清的M199培養(yǎng)液繼續(xù)培養(yǎng)。

1.3.2.2 大鼠肝星狀細胞系HSC-T6細胞培養(yǎng) 將細胞培養(yǎng)于含10%優(yōu)質(zhì)胎牛血清和1%青霉素-鏈霉素雙抗的DMEM培養(yǎng)基中，2～3 d換液1次，細胞80% 融合度時傳代，可按照1∶3傳代比例進行，于37℃，5%CO2及飽和濕度培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。

1.3.3 含藥血清制備 根據(jù)《金匱要略》記載，大黃蟄蟲丸的藥物由熟大黃、土鱉蟲(炒)、水蛭(制)、虻蟲(去翅足，炒)、蠐螬(炒)、干漆(煅)、桃仁、苦杏仁(炒)、黃芩、地黃、白芍、甘草組成，其劑量比例為3∶0.3∶0.6∶0.45∶0.45∶0.3∶1.2∶1.2∶0.6∶0.3∶1.2∶0.9。將上述12味中藥藥物粉碎成粗粉，按照臨床用藥習慣，取500 mL水浸泡1 h后煎煮，先武火煮沸15 min，后改成文火煎煮，保持微沸狀態(tài)30 min，共煎煮3次。合并后采用超聲提取法，減壓濃縮，冷凍干燥得到總提取物粉末。在使用時加生理鹽水將上述材料調(diào)至412 g/L，成為大黃蟄蟲丸提取液。正常Wistar大鼠10只，其中正常對照組與含藥血清組各5只，正常對照組給予灌胃生理鹽水0.8 mL；含藥血清組給予大黃蟄蟲丸提取液0.8 mL，每組持續(xù)灌胃7天，2次/d。各組大鼠于末次給藥后1 h腹腔注射7%水合氯醛(0.5 mL/100 g)麻醉，腹主動脈采血。血樣靜置2 h以上，待血塊收縮良好后，3 000 r/min，15 min分離血清，血清以55℃處理30 min，用0.22 μm微孔濾膜過濾除菌，置-20℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3.4 細胞造模分組 將原代HSC和HSC-T6細胞系各分為空白對照組、含藥血清組、LPS處理組、含藥血清和LPS共同處理組，每組3樣本。其中空白對照組：細胞繼續(xù)常規(guī)培養(yǎng)48 h；含藥血清組：用含20%大黃蟄蟲丸含藥血清的培養(yǎng)液作用于細胞48 h；LPS處理組：細胞先常規(guī)培養(yǎng)44 h后再加入100 ng/mL LPS作用于細胞4 h；含藥血清和LPS共同處理組：先加入含20%大黃蟄蟲丸含藥血清培養(yǎng)液作用于細胞44 h后再加入100 ng/mL LPS共同作用于細胞4 h。

1.3.5 免疫熒光染色 在培養(yǎng)板中將已爬好細胞的玻片用 PBS(0.01 mol/L)浸洗3次，3 min/次；用4%的多聚甲醛固定爬片15 min，浸洗玻片同前；在玻片上滴加0.5% TritonX-100室溫打孔15 min，浸洗玻片同前；在玻片上滴加正常山羊血清，室溫封閉60 min；吸水紙吸掉封閉液，不洗，每張玻片滴加足夠量的稀釋好的一抗LPS并放入濕盒，4℃孵育過夜；取出濕盒，37℃復溫30 min，PBS(0.01 mol/L)浸洗3次，3 min/次，吸水紙吸干爬片上多余液體后滴加LPS-PE，濕盒中37℃孵育30 min；從加LPS-PE起，后面所有步驟都盡量在暗處進行。復染核：滴加DAPI避光孵育15 min，對標本進行染核，PBS 5 min×4次洗去多余的DAPI；用吸水紙吸干爬片上的液體，用含抗熒光淬滅劑的封片液封片，然后在激光掃描共聚焦顯微鏡下觀察采集圖像。免疫熒光圖片采用ImageJ2x(Rawak Software Inc.,Stuttgart,Germany)計算ROI值。

1.3.6 激光共聚焦檢測LPS與TLR4交聯(lián)在肝星狀細胞中熒光強度變化 每張玻片滴加正常山羊血清，溫室封閉60 min，然后滴加足夠量的一抗LPS，4℃孵育過夜，然后滴加LPS-PE，濕盒37℃孵育30 min，用含抗熒光淬滅劑的封片液封片，然后在激光掃描共聚焦顯微鏡下觀察采集圖像。

2 結(jié)果

2.1 自發(fā)熒光觀察肝星狀細胞的純度 分離7 d的HSC呈星狀細胞，細胞變長，胞體較大，胞漿內(nèi)折光顆粒減少，部分細胞融合成片狀。在激發(fā)波長325 nm 熒光顯微鏡下呈藍綠色熒光，純度>85%。見圖1。

圖1 原代肝星狀細胞(×100)

2.2 LPS與TLR4交聯(lián)在星狀細胞中熒光強度變化 原代HSC中空白對照組、含藥血清組、LPS處理組、含藥血清和LPS共同處理組的ROI值分別是：9.48±0.05、4.07±0.68、18.44±2.61、14.20±2.21；HSC-T6空白對照組、含藥血清組、LPS處理組、含藥血清和LPS共同處理組的ROI值分別是：6.75±1.99、4.63±2.97、18.40±1.01、9.35±2.14。與空白對照組比較，LPS處理組的熒光強度增強(P<0.001)；與LPS處理組比較，大黃蟄蟲丸和LPS共同處理組的熒光強度減弱(P<0.05)。說明大黃蟄蟲丸減少LPS與HSC TLR4結(jié)合。見圖2、3，表1。

A:空白對照組；B:含藥血清組；C:LPS處理組；D:含藥血清組和LPS共同處理組

圖2 LPS與TLR4交聯(lián)后在HSC中熒光強度變化(×800)

A:空白對照組；B:含藥血清組；C:LPS處理組；D:含藥血清組和LPS共同處理組

圖3 LPS與TLR4交聯(lián)后在HSC-T6細胞中熒光強度變化(×800)

項目HSC ROI值HSC-T6 ROI值空白對照組9.48±0.056.75±1.99含藥血清組4.07±0.684.63±2.97LPS處理組18.44±2.61?18.40±1.01?含藥血清和LPS共同處理組14.20±2.21△9.35±2.14△△F值76.35247.835P值0.0000.000

*與空白對照組比較P<0.001；與LPS處理組比較△P<0.05，△△P<0.001

3 討論

腸源性內(nèi)毒血癥對肝纖維化啟動有重要作用，LPS 是革蘭陰性桿菌細胞壁的主要成分。而肝星狀細胞的活化是肝纖維化發(fā)生、發(fā)展的中心環(huán)節(jié)。肝星狀細胞活化，使其轉(zhuǎn)化為肌成纖維細胞，通過旁分泌與自分泌作用，使HSC增殖，合成大量膠原和蛋白多糖等細胞外基質(zhì)，沉積于肝臟，肝纖維化逐漸形成。

在慢性肝病中，由于腸黏膜結(jié)構(gòu)發(fā)生改變，比如緊密連接受損、細胞間隙變寬、血管阻塞促使屏障功能喪失，導致腸道細菌釋放的內(nèi)毒素進入肝臟，通過腸肝循環(huán)，使肝臟不斷暴露于腸道來源的內(nèi)毒素，肝臟對內(nèi)毒素的清除不足，形成腸源性內(nèi)毒素血癥[3]。Toll樣受體(TLR)作為天然免疫系統(tǒng)重要部分，是識別微生物(細菌、病毒等)的模式受體[4]。TLR4主要是LPS的配體，主要表達于肝細胞、枯否細胞、星狀細胞[4]。正?？莘窦毎槐磉_TLR4，受到LPS刺激的枯否細胞表達TLR4增多。LPS與TLR4交聯(lián)，激活枯否細胞使其合成并釋放轉(zhuǎn)化生長因子、血小板衍生生長因子、腫瘤壞死因子、干擾素等多種細胞因子，誘導HSC轉(zhuǎn)化為肌成纖維母細胞，細胞外基質(zhì)沉積增加，促進肝纖維化形成[5]。肝細胞表面低表達TLR4 mRNA和蛋白，在LPS刺激下，肝細胞表達TLR4增加，肝細胞通過產(chǎn)生LPS結(jié)合蛋白來增強肝非實質(zhì)細胞對LPS的反應(yīng)[6]?？莘窦毎透渭毎际情g接刺激肝星狀細胞，從而促進肝纖維化。而肝星狀細胞是發(fā)生肝纖維化的直接細胞、活化肝纖維化的中心環(huán)節(jié)。目前已經(jīng)發(fā)現(xiàn)[3]，LPS是TLR4的外源性配體，通過肝星狀細胞TLR4受體活化HSC，促進核轉(zhuǎn)錄因子NF-κB活化，下調(diào)了星狀細胞TGF-β假受體BAMBI的表達，使HSC對TGF-β的刺激更加敏感，而促使纖維化發(fā)生。臨床上慢性肝病患者常伴隨腸道菌群移位，產(chǎn)生腸源性內(nèi)毒素血癥，導致血中LPS增加[7]。我們前期實驗[8]發(fā)現(xiàn)大黃蟄蟲丸可明顯減輕大鼠肝纖維化，并降低血清中內(nèi)毒素水平。LPS與HSC表面TLR4交聯(lián)活化TLR4通路促進慢性肝病向肝硬化進展，因此阻斷LPS與TLR4交聯(lián)對于控制病情進展或逆轉(zhuǎn)病情有重要作用。

大黃蟄蟲丸[9]出自漢代醫(yī)家張仲景的《金匱要略》：“五勞虛極羸瘦，腹?jié)M不能飲食，食傷、憂傷、飲傷、房室傷，經(jīng)絡(luò)營衛(wèi)氣傷，內(nèi)有干血，肌膚甲錯，兩目黯黑。緩中補虛，大黃蟄蟲丸主之?！逼渌幬镉墒齑簏S、土鱉蟲(炒)、水蛭(制)、虻蟲(去翅足，炒)、蠐螬(炒)、干漆(煅)、桃仁、苦杏仁(炒)、黃芩、地黃、白芍、甘草組成。諸藥合用活血祛瘀、益氣養(yǎng)陰、清熱祛濕、瀉下通腑，達到攻補兼施、扶正不留瘀、祛瘀不傷正的作用。大黃蟄蟲丸是中國中西醫(yī)結(jié)合學會肝病專業(yè)委員會制定的“肝纖維化中西醫(yī)結(jié)合診療指南”推薦的防治肝纖維化的中成藥。大量的臨床研究結(jié)果表示[10-11]，大黃蟄蟲丸聯(lián)合核苷酸類似物治療慢性乙型肝炎不僅改善HA 、LN、PCⅢ等纖維化指標，也在改善ALT方面優(yōu)于單用核苷酸類似物，目前大黃蟄蟲丸在臨床上廣泛應(yīng)用于肝纖維化的治療。

本實驗研究表明LPS處理組的熒光強度強于正常組，表明肝纖維化模型中LPS與TLR4交聯(lián)增強；大黃蟄蟲丸與LPS共同處理組的熒光強度明顯弱于LPS處理組，表明這可能是大黃蟄蟲丸能阻斷LPS與TLR4的交聯(lián)。這可能是大黃蟄蟲丸抗肝纖維化機制之一。