王英， 裴華， 貝寧， 貝箏， 楊文， 王華民， 余平△

1中南大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院免疫學(xué)系(湖南長(zhǎng)沙 410013)； 2海南醫(yī)學(xué)院病原生物學(xué)與免疫學(xué)實(shí)驗(yàn)室(海南?？?571101)； 3海南省干部療養(yǎng)院三科(海南?？?571100)

紅樹(shù)林是陸地和海洋之間轉(zhuǎn)換的高產(chǎn)生態(tài)系統(tǒng)，其土壤蘊(yùn)藏著豐富的海洋微生物資源，目前已分離鑒定的紅樹(shù)林真菌超過(guò)200種，成為海洋真菌的第二大類(lèi)群。該生態(tài)系統(tǒng)中土壤強(qiáng)酸性沼澤化、鹽漬化。紅樹(shù)林真菌為適應(yīng)鹽、有機(jī)質(zhì)含量高的特殊環(huán)境生存，其胞外多糖(exopolysaccharide, EPS)結(jié)構(gòu)較陸生真菌可能存在較大差異[1]。課題組2010年在海南演豐鎮(zhèn)紅樹(shù)林自然保護(hù)區(qū)分離獲得一株真菌，鑒定為近平滑假絲酵母菌(C.parapsilokis)。課題組2015年經(jīng)小鼠體內(nèi)實(shí)驗(yàn)初步證實(shí)，其EPS能明顯增強(qiáng)小鼠機(jī)體的免疫功能[2]。2016年3—7月，課題組為了進(jìn)一步研究該EPS更多的生物學(xué)作用，又構(gòu)建了BALB/c小鼠外陰陰道假絲酵母菌病(vulvovaginal candidiasis, VVC)模型，并應(yīng)用EPS進(jìn)行陰道局部干預(yù)，現(xiàn)將結(jié)果報(bào)告如下。

1 材料與方法

1.1 動(dòng)物 BALB/c小鼠，8～10周齡, 24～28 g，購(gòu)自湖南斯萊克景達(dá)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限公司。

1.2 試劑和菌種C.parapsilokisEPS由本課題提?。话l(fā)酵培養(yǎng)基用大豆粉玉米粉培養(yǎng)基；苯甲酸雌二醇注射液(杭州動(dòng)物藥品廠，批號(hào)111015)；白假絲酵母菌ATCC10231，購(gòu)自廣東省微生物研究所。

1.3 儀器設(shè)備 生物安全柜(中國(guó)海爾)；生化培養(yǎng)箱(上海博迅)；電子分析天平(上海精勝)；高效液相色譜儀(日本島津)；生物顯微鏡(日本奧林巴斯)；低速臺(tái)式離心機(jī)(上海天美)。

1.4 方法

1.4.1 多糖提取純化及鑒定[3-4]課題組自海南地區(qū)紅樹(shù)林分離獲得1株C.parapsilokis菌株，發(fā)酵后收集上清液中EPS成分，乙醇沉淀、并利用鏈蛋白酶+Sevag法聯(lián)合脫蛋白鑒定多糖純度，冷凍干燥后獲得EPS干粉。采用Sephacryl S-400凝膠柱層析逐級(jí)分離純化后，應(yīng)用高效凝膠滲透色譜法進(jìn)行相對(duì)分子質(zhì)量鑒定和單糖組成進(jìn)行檢測(cè)。

1.4.2 BALB/c小鼠VVC模型的構(gòu)建 參考文獻(xiàn)[5-7]構(gòu)建小鼠VVC模型。60只雌性BALB/c小鼠(8～10周齡，24～28 g)隨機(jī)均分為雌激素誘導(dǎo)的VVC組(V組，n=20)、EPS干預(yù)和雌激素誘導(dǎo)的VVC組(E組，n=20)、僅進(jìn)行雌激素化的陰性對(duì)照組(C組，n=20)和空白對(duì)照組(B組，n=20)。V組、E組和C組小鼠在接種前6 d開(kāi)始皮下注射含有0.1 mg苯甲酸雌二醇的油劑0.1 mL，每2 d 1次。B 組皮下注射同等體積的無(wú)菌橄欖油。給藥1 周后，E組和V組接種白假絲酵母菌(ATCC 10231)孢子5×107, B和C組接種等體積的PBS。

1.4.3 BALB/c小鼠VVC模型的EPS治療干預(yù) 白假絲酵母菌接種后第1天E組開(kāi)始陰道內(nèi)給予含30 μg EPS的PBS 100 μL，連續(xù)給予6 d，V、B、C各組給予等體積PBS。接種后第4、7、14天每天隨機(jī)抽選各組小鼠5只，收集各組小鼠陰道灌洗液進(jìn)行菌落計(jì)數(shù)。收集完成后處死小鼠，分離陰道組織，部分陰道組織用4%多聚甲醛固定。制成石蠟切片，進(jìn)行HE染色[7-9]。

1.5 EPS治療干預(yù)后基因芯片檢測(cè) 取EPS干預(yù)后第4天的V組小鼠和E組小鼠，處死后分離陰道組織，取近陰道壁約1 mm厚度的組織切割下來(lái)后液氮保存，用于總RNA提取和后續(xù)芯片檢測(cè)。芯片檢測(cè)采用Agilent Whole Mouse Genome Oligo Microarray(4×44K)。

2 結(jié)果

2.1 EPS的富集純化及組分鑒定 課題組獲得的EPS相對(duì)分子質(zhì)量約530 kD。經(jīng)薄層色譜分析，主要是由葡萄糖、半乳糖、鼠李糖、阿拉伯糖、葡萄糖醛酸等單糖組成的雜多糖。

2.2 BALB/c小鼠VVC模型的構(gòu)建 E組和V組小鼠于接種白假絲酵母菌3～5 d后出現(xiàn)外陰紅腫，陰道灌洗液可見(jiàn)豆渣樣分泌物。C組和B組小鼠未見(jiàn)明顯異常改變。顯示BALB/c小鼠VVC感染模型建模成功。見(jiàn)表1，圖1。

2.3 BALB/c小鼠VVC模型的EPS治療干預(yù) 小鼠陰道局部白假絲酵母菌載量并未因EPS的干預(yù)發(fā)生明顯改變，但是陰道局部組織石蠟切片觀察發(fā)現(xiàn)，中性粒細(xì)胞計(jì)數(shù)(PMN)的浸潤(rùn)程度明顯減輕。見(jiàn)圖2-A、2-B、2-C。

2.4 EPS-1治療干預(yù)后基因芯片檢測(cè) 應(yīng)用EPS干預(yù)后，陰道組織局部多種趨化因子表達(dá)水平明顯下調(diào)，S100A8、S100A9等表達(dá)水平下調(diào)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)。見(jiàn)表2。

表1各組小鼠不同時(shí)間點(diǎn)陰道的載菌量

組別干預(yù)后4 d干預(yù)后7 d干預(yù)后14 dV組15.32±0.67?9.46±0.31?1.58±0.27E組7.01±0.21△2.25±0.11△0.00△C組0.00 ?△0.00 ?△0.00△B組0.00 ?△0.00 ?△0.00△

*與E組同時(shí)間比較P<0.05；△與V組同時(shí)間比較P<0.05

圖1 小鼠VVC模型大體觀

3 討論

近年學(xué)者們對(duì)紅樹(shù)林內(nèi)生菌的資源和所產(chǎn)生的代謝產(chǎn)物的研究發(fā)現(xiàn)，紅樹(shù)林來(lái)源的微生物群是新的生物活性天然產(chǎn)物的豐富資源[10]。文獻(xiàn)有報(bào)道真菌多糖具有免疫調(diào)節(jié)作用、抗腫瘤活性等多種的生物學(xué)活性[11-14]。多篇文獻(xiàn)研究表明來(lái)自紅樹(shù)林的真菌產(chǎn)物對(duì)白假絲酵母菌具有一定的生物學(xué)活性[10,15-16]。這些研究說(shuō)明這類(lèi)真菌是潛在的微生物藥物開(kāi)發(fā)資源。

A：VVC小鼠陰道內(nèi)PMNs浸潤(rùn)情況(HE，10×40)；B：EPS作用后VVC小鼠陰道內(nèi)PMNs浸潤(rùn)情況(HE，10×40)；C：陰道灌洗液中白假絲酵母菌CFU計(jì)數(shù)

圖2小鼠VVC模型

組別S100A8S100A9V組1.00±0.001.00±0.00E組0.25±0.05?0.19±0.04?

*與V組比較P<0.01

有多樣性次級(jí)代謝產(chǎn)物美譽(yù)的酵母菌廣泛存在于自然生態(tài)環(huán)境中，種類(lèi)豐富，代謝產(chǎn)物多樣, 具有重要的經(jīng)濟(jì)效益和實(shí)用價(jià)值。課題組2010年在海南演豐鎮(zhèn)紅樹(shù)林自然保護(hù)區(qū)分離獲得一株C.parapsilokis，2015年經(jīng)小鼠體內(nèi)實(shí)驗(yàn)已初步證實(shí)，其EPS被證實(shí)能增強(qiáng)小鼠機(jī)體的免疫功能[2]。多糖可能攜帶豐富的生物學(xué)信息。3個(gè)核苷酸或氨基酸所組成的所有可能序列數(shù)僅為6種，而3個(gè)單糖最多可以有27 648種可能的排列方式，加上寡糖鏈的連接方式和分支結(jié)構(gòu)的不同，多糖勢(shì)必承載著巨大的生物信息量，其中可能存在多種獨(dú)特的生物學(xué)活性。即使基本組成如單糖成份、寡糖鏈連接方式和分支結(jié)構(gòu)完全相同的多糖，由于分子量大小的不同，其生物學(xué)功能也可能存在巨大差異[17]。

微生物胞外多糖在食品、醫(yī)藥、化工等眾多領(lǐng)域廣泛應(yīng)用。在臨床醫(yī)學(xué)中，EPS有增強(qiáng)機(jī)體抗腫瘤、抗細(xì)菌、抗病毒、抗寄生蟲(chóng)等的性能。細(xì)胞工廠及其廣泛應(yīng)用如分子治療等正在蓬勃發(fā)展，讓微生物為發(fā)現(xiàn)最安全、最有效的藥物途徑具有廣闊的前景[18]。

假絲酵母屬真菌是最常見(jiàn)的人類(lèi)條件致病性真菌，影響人群廣泛。以其引發(fā)的VVC為例，75%的育齡婦女罹患過(guò)此疾病，且其中每年約有3 000萬(wàn)人復(fù)發(fā)[9,19]?？拐婢幬镏委熾m然對(duì)假絲酵母菌感染有效，但耐藥性增加成為日益關(guān)注的問(wèn)題，并且這些藥物的應(yīng)用對(duì)于預(yù)防感染復(fù)發(fā)并無(wú)效果。在這一形勢(shì)下，尋找抗假絲酵母菌屬真菌感染的其他途徑顯得十分緊迫和重要。

尋找真菌獨(dú)特的抗原表位并引發(fā)強(qiáng)度適當(dāng)?shù)捏w液免疫應(yīng)答，即人為的免疫干預(yù)是否可在這一領(lǐng)域獲得成功，長(zhǎng)期以來(lái)備受關(guān)注。然而迄今為止，陰道黏膜局部免疫應(yīng)答和假絲酵母菌屬真菌相互作用的關(guān)系并未完全明確，各種類(lèi)型的免疫應(yīng)答在假絲酵母菌感染致病中的作用一直存有爭(zhēng)議[20]。

課題組于2016年3—7月構(gòu)建了BALB/c小鼠VVC模型，并應(yīng)用分離自紅樹(shù)林的C.parapsilokisEPS進(jìn)行了陰道局部干預(yù)。結(jié)果發(fā)現(xiàn)小鼠陰道局部白假絲酵母菌載量并未因EPS的干預(yù)發(fā)生明顯改變，但是陰道局部組織石蠟切片觀察發(fā)現(xiàn)PMNs的浸潤(rùn)程度明顯減輕。根據(jù)結(jié)果分析推測(cè)，該多糖引發(fā)的這一保護(hù)性效應(yīng)可能與局部的體液免疫應(yīng)答引發(fā)有關(guān)。為了進(jìn)一步明確發(fā)生機(jī)制，課題組收集陰道組織經(jīng)總RNA提取后進(jìn)行了后續(xù)芯片檢測(cè)。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，應(yīng)用EPS干預(yù)后，陰道組織局部多種趨化因子表達(dá)水平明顯下調(diào)， S100A8、S100A9等表達(dá)水平下調(diào)，TGF-β表達(dá)水平明顯上調(diào)。

C.parapsilokis所分泌EPS在小鼠VVC感染模型中，對(duì)陰道局部真菌負(fù)荷并無(wú)明顯影響；但該EPS的應(yīng)用可在 VVC模型中具有較好的抗炎效應(yīng)。這一作用與EPS對(duì) S100A8/A9的劑量依賴阻礙表達(dá)相關(guān)。目前資料尚不完整，該EPS對(duì)其他趨化因子 CCL4、CCL5、CXCL10 的表達(dá)阻礙效應(yīng)，有待于在后續(xù)研究中繼續(xù)探索。但本次研究給予作者提示EPS干預(yù)后有可能引發(fā)的特異性體液免疫應(yīng)答有助于改善BALB/c小鼠VVC模型相關(guān)癥狀體征。