劉俊菲，林 鳳，毛瑞豐*，李 凱,2，陸翠華

（1廣西大學(xué)輕工與食品工程學(xué)院，廣西南寧530004；2廣西甘蔗制糖中心，廣西南寧530004；3南寧糖業(yè)股份有限公司伶俐糖廠，廣西南寧530211）

0 引言

甘蔗的種植和制糖以印度為最早[1]，甘蔗制糖在我國(guó)也有悠久的歷史，白糖和冰糖制造技術(shù)可以追溯到唐朝。然而，甘蔗糖廠車間環(huán)境中存在著大量的微生物，主要以微生物氣溶膠形式存在，進(jìn)而傳播到成品糖造成產(chǎn)品品質(zhì)下降。微生物氣溶膠指的是氣溶膠中有生命活性的部分，囊括空氣中的病毒、細(xì)菌、真菌等具有生命活性的微小粒子[2]，按照生物學(xué)種類，可以將微生物氣溶膠劃分為真菌氣溶膠、細(xì)菌氣溶膠。微球菌和表皮葡萄球菌是室內(nèi)細(xì)菌微生物普遍存在的一種微生物[3]。煙曲霉和雜色曲霉是導(dǎo)致室內(nèi)真菌污染的主要菌株[4]，雜色曲霉能使甘蔗變質(zhì)產(chǎn)生可溶性紅色色素，使潮包變紅[5]。真菌菌株在適宜的條件下可以產(chǎn)生次級(jí)代謝產(chǎn)物，如：揮發(fā)性真菌代謝物（VFM）、（1-3）-β-D 葡聚糖、麥角甾醇及霉菌毒素。其中腸膜明串珠菌是甘蔗糖廠生產(chǎn)及加工中主要的有害菌株，其危害是產(chǎn)生葡聚糖，造成“蔗飯”，產(chǎn)生大量泡沫，嚴(yán)重影響產(chǎn)品質(zhì)量[6]。

甘蔗制糖工藝包括原料預(yù)處理、提汁、清凈、蒸發(fā)、煮糖結(jié)晶、離心、干燥、包裝等工藝。煮糖之前的微生物來源廣泛，其危害主要體現(xiàn)在對(duì)生產(chǎn)工藝及生產(chǎn)效率上；而經(jīng)過蒸發(fā)、煮糖等高溫殺菌作用后對(duì)成糖工序影響較小。甘蔗糖廠成糖潔凈區(qū)是指煮糖之后的部分，其微生物來源主要是車間環(huán)境和空氣中的微生物，研究結(jié)果顯示檢出的致病菌主要來自于成糖潔凈區(qū)[7-8]。因此，系統(tǒng)研究甘蔗糖廠成糖潔凈區(qū)微生物危害控制是必不可少的，合理的車間氣流組織分布是減少和控制成糖潔凈區(qū)微生物危害發(fā)生及傳播的主要因素之一。

本文采用傳統(tǒng)微生物學(xué)鑒定方法和分子生物學(xué)鑒定相結(jié)合的方式，實(shí)現(xiàn)甘蔗糖廠成糖潔凈區(qū)微生物鑒定，通過指標(biāo)性微生物的系統(tǒng)發(fā)育分析，找出成糖潔凈區(qū)潛在的污染途徑及污染源，從而為甘蔗制糖行業(yè)微生物危害控制技術(shù)規(guī)范研究奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

1.1.1 采樣工具

試管、小鋁盒、鑷子、平板、5 cm×5 cm采樣規(guī)格板、鐵鏟、棉拭子、酒精棉球、封口膠。

1.1.2 培養(yǎng)基

馬鈴薯葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基（PDA）：馬鈴薯200 g，蔗糖（葡萄糖）20 g，瓊脂 15～20 g，蒸餾水 1000 mL，pH自然，121℃滅菌15 min；沙氏培養(yǎng)基：葡萄糖40 g，蛋白胨10 g，瓊脂20 g，蒸餾水1000 mL，121℃滅菌15 min；牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基：蛋白胨10 g，牛肉膏3 g，氯化鈉5 g，瓊脂15 g，蒸餾水1000 mL，pH 值 7.3±0.2（25℃），121℃高壓蒸汽滅菌 20 min；胰蛋白胨大豆肉湯培養(yǎng)基（TSB）：胰蛋白胨17 g，植物蛋白胨3 g，氯化鈉5 g，磷酸氫二鉀2.5 g，葡萄糖 2.5 g，蒸餾水 1000 mL，pH 值 7.3±0.2（25℃），121℃高壓蒸汽滅菌20 min。

1.1.3 試劑

傳統(tǒng)微生物學(xué)鑒定所需試劑：結(jié)晶紫、碘單質(zhì)、95%乙醇、番紅等，均為分析純。

核酸提取及聚合酶鏈反應(yīng)（PCR）所需試劑：細(xì)菌DNA提取試劑盒（購(gòu)于TaKaRa）；真菌DNA提取試劑盒（生工生物工程（上海）股份有限公司）；Premix TaqTM（購(gòu)于 TaKaRa）；27F/1492R 通用引物（購(gòu)于北京六合華大基因科技股份有限公司）；ITS1/ITS4通用引物（購(gòu)于北京六合華大基因科技股份有限公司）；瓊脂糖（購(gòu)于 Biowest，西班牙）；4S Red Plus核酸染色劑（生工生物工程（上海）股份有限公司）。

電泳緩沖液儲(chǔ)存液（5×TBE）：Tris 54 g，硼酸27.5 g，EDTA（0.5 mol/L，pH 8.0）20 mL，蒸餾水 1000 mL。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 樣品采樣方法、風(fēng)速、風(fēng)向、溫濕度測(cè)定方法

環(huán)境空氣采樣[9]、設(shè)備表面采樣、生產(chǎn)線采樣及糖垢采樣點(diǎn)采樣參考GB 4789.2-2016《食品微生物學(xué)檢驗(yàn) 菌落總數(shù)測(cè)定》；利用AM-4812風(fēng)速儀和飄帶法以及 AT7592指南針測(cè)定風(fēng)速、風(fēng)向；利用溫度計(jì)和濕度測(cè)定儀對(duì)溫濕度進(jìn)行測(cè)定。

1.2.2 菌落總數(shù)測(cè)定及分離純化方法

生產(chǎn)線樣品、糖垢樣品及設(shè)備表面樣品的菌落總數(shù)測(cè)定方法參考GB 4789.2-2016《食品微生物學(xué)檢驗(yàn) 菌落總數(shù)測(cè)定》，略作改動(dòng)地方為：每次取菌液時(shí)加入5 min的渦旋震蕩，用來達(dá)到混勻的目的。而關(guān)于空氣環(huán)境樣品菌落總數(shù)的測(cè)定，則是參照《甘蔗糖成品霉菌污染的微生物學(xué)分析》及《食品微生物學(xué)檢驗(yàn) 菌落總數(shù)測(cè)定》。細(xì)菌分離純化采用的是平板劃線分離法；真菌的分離純化采用的是三點(diǎn)接種法。

1.2.3 16S rRNA[10]和ITS[11]基因序列分析

利用細(xì)菌基因組 DNA提取試劑盒、真菌基因組 DNA提取試劑盒對(duì)甘蔗糖廠成糖潔凈區(qū)菌株進(jìn)行DNA提取，方法可參考試劑盒說明書。利用通用引物27F/1492R[12]、ITS1/ITS4對(duì)基因組進(jìn)行核酸聚合酶鏈反應(yīng)（Polymerase Chain Reaction，PCR）擴(kuò)增，PCR反應(yīng)體系如表1、表2所示。擴(kuò)增出16S rRNA和ITS基因片段，通過1%的瓊脂糖凝膠電泳，驗(yàn)證基因組提取結(jié)果及擴(kuò)增結(jié)果，條帶明亮的樣品送至測(cè)序公司進(jìn)行測(cè)序。通過利用美國(guó)國(guó)家生物技術(shù)信息中心（National Center For Biotechnology Information，NCBI）網(wǎng)站（http://www.ncbi.nlm.nih.gov/）進(jìn)行基因序列比對(duì)，從而確定菌株的相似性。首先利用DAMBE軟件進(jìn)行堿基替換飽和分析，進(jìn)而利用 PAUP*4.0b10軟件中的最大似然法（Maximum Likehood，ML）和 MrBayes×64 軟件中的貝葉斯法（Bayesian，BI）構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹。

表1 PCR反應(yīng)液的組成

2 結(jié)果與分析

2.1 菌落總數(shù)的測(cè)定分析

甘蔗糖廠成糖潔凈區(qū)中環(huán)境空氣、設(shè)備表面、生產(chǎn)線及糖垢等采樣點(diǎn)位置及風(fēng)速測(cè)定見圖 1，環(huán)境空氣、設(shè)備表面、生產(chǎn)線及糖垢等采樣點(diǎn)的細(xì)菌菌落數(shù)和真菌菌落數(shù)見表3、表4、表5和表6，結(jié)果顯示成糖潔凈區(qū)不同采樣點(diǎn)均存在菌落總數(shù)嚴(yán)重超標(biāo)的問題。

圖1 所有樣品取樣點(diǎn)（箭頭方向代表風(fēng)速方向）

表3 環(huán)境空氣取樣點(diǎn)的菌落總數(shù)及采樣點(diǎn)位置

表4 設(shè)備表面取樣點(diǎn)的菌落總數(shù)及采樣點(diǎn)位置

環(huán)境空氣總共選取了20個(gè)采樣點(diǎn)，在A-7、A-20采樣點(diǎn)細(xì)菌蓄積嚴(yán)重，在A-7、A-16采樣點(diǎn)真菌蓄積嚴(yán)重。設(shè)備表面總共選取了21個(gè)采樣點(diǎn)，在B-9、B-11、B-12、B-21采樣點(diǎn)細(xì)菌菌落總數(shù)分別達(dá)到了6.8×103、1.4×103、3.0×105、3.4×104CFU/cm2，最高達(dá)到了 105數(shù)量級(jí)，在 B-6、B-9、B-15、B-21采樣點(diǎn)真菌菌落總數(shù)分別達(dá)到了 5.3×104、2.5×103、2.3×103、1.0×103CFU/cm2，最高達(dá)到了 104數(shù)量級(jí)。糖垢采樣總共選取了8個(gè)采樣點(diǎn)，在C-1、C-2、C-3、C-4采樣點(diǎn)細(xì)菌菌落總數(shù)分別達(dá)到了1.8×103、1.6×103、1.5×103、3.0×102CFU/g，而在C-1、C-3、C-4采樣點(diǎn)真菌菌落總數(shù)分別為70、20、20 CFU/g。生產(chǎn)線采樣總共選取了6個(gè)采樣點(diǎn)，在D-3采樣點(diǎn)細(xì)菌菌落總數(shù)最高達(dá)1.0×102CFU/g，在D-2、D-3采樣點(diǎn)真菌菌落總數(shù)分別為2.0×102、1.0×102CFU/g。風(fēng)速測(cè)定總共選取了14個(gè)采樣點(diǎn)，通過風(fēng)速的測(cè)定，發(fā)現(xiàn)有 3個(gè)采樣點(diǎn)風(fēng)速分別為36.5、6.0、4.0 m/s，其它風(fēng)速點(diǎn)，風(fēng)速均小于 1.0 m/s。

表5 糖垢取樣點(diǎn)及采樣點(diǎn)位置

表6 生產(chǎn)線取樣點(diǎn)的菌落總數(shù)及采樣點(diǎn)位置

從菌落總數(shù)測(cè)定結(jié)果可知，甘蔗糖廠成糖潔凈區(qū)微生物污染嚴(yán)重的地方主要集中于一級(jí)振篩、9號(hào)分蜜機(jī)落糖口（位于一級(jí)振篩）、二級(jí)振篩及三級(jí)振篩周圍，且設(shè)備表面采樣點(diǎn)的菌落總數(shù)高于生產(chǎn)線及糖垢采樣點(diǎn)的菌落總數(shù)，其主要原因是由于落糖口區(qū)域溫濕度較大，帶有大量水分的成品糖使此區(qū)域的溫濕度增大，如最高溫度達(dá)28℃，最高相對(duì)濕度達(dá) 71%，又發(fā)現(xiàn)糖粉分布于整個(gè)成糖潔凈區(qū)，再加之測(cè)得的一級(jí)振篩區(qū)域氣流分布成交叉狀態(tài)，所以增加了環(huán)境微生物及設(shè)備表面微生物的蓄積及傳播。而生產(chǎn)線及糖垢采樣點(diǎn)菌落總數(shù)測(cè)得結(jié)果較少的原因有可能是進(jìn)入到成糖工序造成真菌污染產(chǎn)生真菌孢子，但隨著成糖工序輸送帶的輸送作用，蔗糖的水分含量也逐漸減少，從而不適宜真菌孢子的生長(zhǎng)，進(jìn)而檢測(cè)不出成品糖受到的微生物危害。

2.2 傳統(tǒng)微生物學(xué)鑒定及系統(tǒng)發(fā)育分析

為確定甘蔗糖廠成糖潔凈區(qū)中污染微生物的種類，結(jié)合菌落形態(tài)觀察、顯微結(jié)構(gòu)觀察以及生理生化實(shí)驗(yàn)、對(duì)所獲得的未知菌株進(jìn)行了初步鑒定。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，細(xì)菌菌株多數(shù)為革蘭氏陽(yáng)性的芽孢桿菌（Bacillus）、球菌[3]，而真菌菌株多數(shù)為青霉屬（Pencillicun）、曲霉屬（Asperigillus），還有少數(shù)的紅酵母屬（Rhodotorula）。

同時(shí)，利用分子生物學(xué)技術(shù)對(duì)甘蔗糖廠成糖潔凈區(qū)鑒定出163株細(xì)菌，主要有克氏庫(kù)克菌（Kocuria kristinae）[13]、蠟樣芽胞桿菌（Bacillus cereus）、高地衣芽孢桿菌（Bacillus altitudinis）、鮑曼不動(dòng)桿菌（Acinetobacter baumannii）[14]、 腐 生 葡 萄 球 菌（Staphylococcus saprophyticus Subsp.）等；鑒定出 97株真菌，主要包括粗糙脈孢菌（Neurospora crassa）、米 根 霉 （Rhizopus oryzae）、 煙 曲 霉 （Aspergillus fumigatus）[15]、聚多曲霉（Aspergillus sydowii）、黃曲霉 （Aspergillus flavus）[16]、 黑 曲 霉 （Aspergillus puniceus）、桔青霉（Penicillium citrinum）[17]、離生青霉 （Penicillium solitum）、 枝 孢 霉 （Cladosporium halotolerans）、木霉（Trichoderma harzianum）等。

此外，利用部分真菌菌株鑒定結(jié)果構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹（圖2）。從系統(tǒng)發(fā)育樹鑒定結(jié)果可知，系統(tǒng)樹分為2大類分支。第一大類分支能夠?qū)?株供試菌株鑒定到種水平，且供試菌株與模式菌株的后驗(yàn)概率值在0.90以上，說明供試菌株鑒定結(jié)果的可信度較高，菌株親緣關(guān)系較近；第二大類分支較復(fù)雜且有很多拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)及分支，可將13株供式菌株鑒定到種水平，菌株之間的親緣關(guān)系也是由后驗(yàn)概率值大小的變化轉(zhuǎn)換成菌株親緣遠(yuǎn)近的關(guān)系。通過利用指標(biāo)性微生物菌株構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹，找出菌株的親緣關(guān)系，通過菌株的親緣關(guān)系確定菌株的進(jìn)化關(guān)系，從而判斷菌株的直系親屬關(guān)系。最后，通過菌株的直系關(guān)系及進(jìn)化途徑可以確定菌株的污染傳播途徑，結(jié)果如圖3所示。

圖2 運(yùn)用BI在MrBayes×64中對(duì)供試菌株的ITS構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育進(jìn)化樹

圖3 甘蔗糖廠成糖潔凈區(qū)微生物危害分析流程圖

分子系統(tǒng)發(fā)生是利用各種分子性狀構(gòu)建的生物實(shí)體之間起源和演化關(guān)系。采用的分子數(shù)據(jù)主要是DNA和蛋白質(zhì)序列。DNA和蛋白質(zhì)序列數(shù)據(jù)作為生物信息分子具有線性數(shù)字編碼特征，并且能夠建立位點(diǎn)之間的同源關(guān)系，逐漸成為系統(tǒng)發(fā)生分析的主要數(shù)據(jù)來源[18]。結(jié)果如圖 4[19]所示，以分布在不同采樣點(diǎn)的枯草芽孢桿菌為指標(biāo)性菌株，通過系統(tǒng)發(fā)育分析，發(fā)現(xiàn)分支點(diǎn)c與d的親緣關(guān)系較近，也

就意味著具有相同的直系菌株即菌株的來源相同，而分支點(diǎn)b的親緣關(guān)系逐漸較遠(yuǎn)。從而可以判斷菌株的進(jìn)化發(fā)育次序是從節(jié)點(diǎn) A到節(jié)點(diǎn) F的進(jìn)化發(fā)育，即溯源環(huán)境菌株是否進(jìn)入到成品糖中并具有直系關(guān)系，再結(jié)合車間氣流組織分布，論證了氣流組織分析獲得的污染傳播途徑與菌株進(jìn)化發(fā)育次序獲得的污染傳播途徑相一致。

2.3 甘蔗糖廠成糖潔凈區(qū)微生物危害初步分析

圖4 運(yùn)用BI在MrBayes×64中對(duì)枯草芽孢桿菌的16S rRNA序列構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育進(jìn)化樹[19]

對(duì)甘蔗成糖潔凈區(qū)微生物危害分析，首先是從指標(biāo)性微生物的污染源及污染途徑分析，其次是從檢出菌株的危害分析及污染源的判斷分析。指標(biāo)性微生物是指分布在甘蔗糖廠成糖潔凈區(qū)各個(gè)生產(chǎn)線采樣點(diǎn)且同時(shí)分布在其它各個(gè)采樣點(diǎn)中最多的同一種菌株。游彪[19]研究結(jié)果選擇枯草芽孢桿菌（Bacillus subtilis）、煙曲霉（Aspergillus fumigatus）作為細(xì)菌和真菌菌株的指標(biāo)性微生物。

通過指標(biāo)性微生物構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹，可以找出菌株間的親緣關(guān)系和直系菌株。通過系統(tǒng)發(fā)育分析，圖4發(fā)現(xiàn)分支點(diǎn)c與d的親緣關(guān)系較近，也就意味著具有相同的直系菌株即菌株的來源相同，而分支點(diǎn)b的親緣關(guān)系逐漸較遠(yuǎn)。從而判斷菌株的進(jìn)化發(fā)育次序是從節(jié)點(diǎn)A到節(jié)點(diǎn)F的進(jìn)化發(fā)育，再結(jié)合車間氣流組織分布，發(fā)現(xiàn)枯草芽孢桿菌進(jìn)化發(fā)育過程和成糖潔凈區(qū)不同工序枯草芽孢桿菌菌株的污染傳播途徑相一致，從而為甘蔗糖廠成糖潔凈區(qū)車間環(huán)境菌株進(jìn)入到成品糖的污染傳播途徑得到證明。結(jié)合檢出菌株，發(fā)現(xiàn)成糖潔凈區(qū)檢出黃曲霉分布于B-4、B-12、B-15、B-18、B-21等采樣點(diǎn)，根據(jù)甘蔗糖廠成糖潔凈區(qū)物料流動(dòng)方向及物料特性，蓄積在生產(chǎn)線上的糖垢為生產(chǎn)線上的微生物繁殖提供了一定的生存環(huán)境，隨著物料的流動(dòng)，從成糖工序傳播到下一成糖工序，并造成二次污染，隨著帶有大量水分的成品糖不斷的沖擊落糖口積垢處，為微生物傳播提供動(dòng)力。另一方面，通過氣流組織測(cè)定，三級(jí)振篩中端測(cè)定的進(jìn)氣管口風(fēng)速較大，達(dá) 36.5 m/s，且測(cè)定的此處區(qū)域的氣流成交叉狀態(tài)，其他不同采樣點(diǎn)區(qū)域也存在氣流分布紊亂。因此，將發(fā)現(xiàn)的2條主要污染途徑歸為生產(chǎn)線上物料的流動(dòng)和車間氣流組織的流動(dòng)。

檢出菌株的危害分析是依據(jù)檢出菌株本身的微生物危害及對(duì)甘蔗糖廠成糖潔凈區(qū)成品糖的危害進(jìn)行分析。根據(jù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果，檢出大量具有致病性菌株及具有產(chǎn)色素能力的污染傳播菌株，致病性菌株分為疑似常見致病菌株和疑似條件致病菌，它們能夠產(chǎn)生金黃色葡萄球菌毒素、黃曲霉毒素和桔霉素等，而且產(chǎn)色素能力的菌株也會(huì)對(duì)成品糖的色澤和品質(zhì)造成影響，而通過致病菌微生物的傳播也會(huì)造成甘蔗糖的安全性隱患。

根據(jù)污染菌株的風(fēng)險(xiǎn)等級(jí)如致病性、產(chǎn)色素能力及普遍性可將污染菌株進(jìn)行危害等級(jí)劃分，分為高度風(fēng)險(xiǎn)菌株、中度風(fēng)險(xiǎn)菌株、低風(fēng)險(xiǎn)菌株、可能性高風(fēng)險(xiǎn)污染菌株、可能性中度風(fēng)險(xiǎn)菌株及可能性低度污染菌株等6類。如高風(fēng)險(xiǎn)菌株有蠟樣芽胞桿菌（Bacillus cereus）、黃曲霉（Aspergillus flavus）、桔青霉（Penicillium citrinum）、枯草芽孢桿菌（Bacillus subtilis）、煙曲霉（Aspergillus fumigatus）；根據(jù)結(jié)合取樣點(diǎn)信息、菌落總數(shù)及污染菌株風(fēng)險(xiǎn)等級(jí)，將污染源危害等級(jí)劃分為高度風(fēng)險(xiǎn)污染源、中度風(fēng)險(xiǎn)污染源、低風(fēng)險(xiǎn)污染源、可能性高風(fēng)險(xiǎn)污染源、可能性中度風(fēng)險(xiǎn)污染源及可能性污染源。高風(fēng)險(xiǎn)污染源有B-4、B-12、A-19、A-16、B-21等。

3 結(jié)論

通過對(duì)甘蔗糖廠成糖潔凈區(qū)微生物危害分析，結(jié)合菌落總數(shù)測(cè)定結(jié)果，發(fā)現(xiàn)潔凈區(qū)微生物污染嚴(yán)重的地方主要集中于一級(jí)振篩、9號(hào)分蜜機(jī)落糖口（位于一級(jí)振篩）、二級(jí)振篩及三級(jí)振篩周圍，且設(shè)備表面采樣點(diǎn)的菌落總數(shù)高于生產(chǎn)線及糖垢采樣點(diǎn)的菌落總數(shù)。

通過系統(tǒng)發(fā)育分析，可以找出菌株間的親緣關(guān)系和直系菌株及菌株的進(jìn)化發(fā)育次序，再結(jié)合車間氣流組織分布，論證了氣流組織分析獲得的污染傳播途徑與菌株進(jìn)化發(fā)育次序獲得的污染傳播途徑相一致。最后，將生產(chǎn)線上物料的流動(dòng)和車間氣流組織的變化作為甘蔗糖廠成糖潔凈區(qū)微生物污染的主要途徑和普遍性規(guī)律，從而為甘蔗糖廠成糖潔凈區(qū)微生物危害分析奠定了理論基礎(chǔ)。