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        高效液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜法測定乳粉中低聚半乳糖

        2019-03-04 05:49:44甄振鵬高裕鋒黃敏興龐揚海王小鵬李碩聰余構(gòu)彬
        甘蔗糖業(yè) 2019年1期
        關(guān)鍵詞:檢測

        甄振鵬,高裕鋒*,黃敏興,龐揚海,王小鵬,李碩聰,余構(gòu)彬

        (1廣東省生物工程研究所(廣州甘蔗糖業(yè)研究所) 廣東省甘蔗改良與生物煉制重點實驗室,廣東廣州510316;2國家糖業(yè)質(zhì)量監(jiān)督檢驗中心,廣東廣州510316)

        0 引言

        棉籽糖、水蘇糖、毛蕊花糖是 α-1,6-糖苷鍵連接的低聚半乳糖(Galactooligosaccharides,GOS)[1]。棉籽糖的分子結(jié)構(gòu)是蔗糖靠近葡萄糖一側(cè)以 α-1,6-糖苷鍵連接一個半乳糖,屬于三糖。水蘇糖是棉籽糖靠近半乳糖一側(cè)以α-1,6-糖苷鍵連接一個半乳糖,屬于四糖。而毛蕊花糖則是在水蘇糖末端半乳糖再以α-1,6-糖苷鍵連接一個半乳糖,屬于五糖[2]。

        棉籽糖、水蘇糖、毛蕊花糖具有促進(jìn)腸道有益菌生長,促進(jìn)消化吸收,改善脂質(zhì)代謝,降低血脂和膽固醇,促進(jìn)鈣和鎂等礦物元素的吸收,提高免疫力等生理功能,因此常被添加到各類功能性食品中[3]。尤其是在嬰幼兒乳粉中,往往人為添加低聚半乳糖,以模擬人乳中含有低聚半乳糖的狀態(tài),起到促進(jìn)嬰幼兒的消化吸收作用。棉籽糖、水蘇糖、毛蕊花糖是低聚半乳糖的重要組成品種。

        目前,國內(nèi)并沒有完善成熟的檢測乳粉中棉籽糖、水蘇糖、毛蕊花糖的標(biāo)準(zhǔn),這使得相關(guān)指標(biāo)的監(jiān)管缺失,不利于保障乳制品的質(zhì)量安全。因此,開發(fā)乳粉中棉籽糖、水蘇糖、毛蕊花糖的檢測方法,具有重要的意義。

        利用高效液相色譜配示差檢測器或蒸發(fā)光散射檢測器以及離子色譜檢測棉籽糖、水蘇糖、毛蕊花糖已有一些文獻(xiàn)報道[4-7]。如目前國內(nèi)已發(fā)布的國家標(biāo)準(zhǔn)GB/T 22491-2008《大豆低聚糖》涉及了棉籽糖和水蘇糖的檢測方法[8]。利用高效液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜法開發(fā)牛奶中低聚半乳糖及其他低聚糖是近年來研究的熱點[9-11],它可以實現(xiàn)準(zhǔn)確定性和定量的目的。本文擬利用高效液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜法結(jié)合前處理方法的研究,開發(fā)一種乳粉中棉籽糖、水蘇糖、毛蕊花糖的測定方法,并將其用于實際樣品檢測中。

        1 實驗材料和方法

        1.1 儀器與試劑

        高效液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜儀(液相:日本島津公司LC-20AD;質(zhì)譜:美國 ABI公司,4000Q trap);Milli-Q超純水器(美國Millipore公司);Vortex-Genie 2渦旋混勻器(奧然科技有限公司);電子天平(0.1 mg,日本AND公司)。

        棉籽糖、水蘇糖、毛蕊花糖標(biāo)準(zhǔn)品購自于日本W(wǎng)ako公司;甲醇(色譜純,美國默克公司);乙腈(色譜純,美國默克公司);有機相濾膜購于天津博納艾杰爾科技公司。

        實驗所用的 33種乳粉樣品為市場中隨機購買的產(chǎn)品。

        1.2 標(biāo)準(zhǔn)溶液配制

        分別精確稱取棉籽糖、水蘇糖、毛蕊花糖各10 mg置于100 mL容量瓶中,用蒸餾水超聲溶解定容至刻度,作為混合標(biāo)準(zhǔn)儲備液備用。將此混合標(biāo)準(zhǔn)儲備液用空白基質(zhì)提取液逐級稀釋,分別配成低聚半乳糖標(biāo)準(zhǔn)品濃度為 1500、1000、500、200、100和50 μg/L的混合標(biāo)準(zhǔn)溶液。

        1.3 提取和凈化

        稱取乳粉樣品1 g(精確至0.01 g)于50 mL比色管中,加入30 mL蒸餾水溶解(充分振蕩),再用20 mL無水乙醇定容至50 mL,渦旋振蕩,超聲20 min,移取約25 mL溶液于50 mL離心管中,以8000 r/min離心5~10 min,離心機溫度10℃,精密移取上清液過0.22 μm水相濾膜至進(jìn)樣瓶中,取濾液進(jìn)行高效液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜檢測。

        1.4 HPLC-MS/MS分析

        1.4.1 HPLC條件

        色譜柱:XBridgeTMAmide (150 mm×4.6 mm×3.5 μm);流動相 A:40/60的乙腈/水溶液含 0.10%氨水溶液,流動相B:70/30的乙腈/水溶液含0.10%氨水溶液;梯度洗脫:0~30 min 0%~40% A;30~33 min 40%~60% A;33~35 min 60% A;35~37min 60%~0% A;37~38min 0% A。

        流速:0.4 mL/min;柱溫:40℃;進(jìn)樣量:5 μL。

        1.4.2 質(zhì)譜條件

        電離模式:ESI-;儀器參數(shù):氣簾氣壓力344.5 kPa,碰撞氣壓力中檔,離子噴霧電壓 4500 V,離子源溫度550℃,霧化氣壓力344.5 kPa,輔助加熱氣壓力344.5 kPa,接口加熱器為開;采集模式:多反應(yīng)監(jiān)測MRM,具體參數(shù)如表1所示。

        2 結(jié)果與分析

        2.1 色譜和質(zhì)譜條件的選擇

        由于低聚半乳糖水解電離都能產(chǎn)生各種單糖雙糖離子,質(zhì)譜無法分離,因此對于色譜分離要求高,才不造成相互影響(見圖1)。采用檢測糖類專用的氨基柱,單純使用乙腈水流動相無法將各種低聚半乳糖有效分離。通過考察不同流動相比例對檢測分離效果的影響,發(fā)現(xiàn)以 40/60的乙腈/水溶液(水中含0.10%氨水)作為A相,以70/30的乙腈/水溶液(水中含0.10%氨水)作為B相,按照1.4.1的洗脫方式,可以實現(xiàn)有效的分離,并且提高負(fù)離子模式下的靈敏度。

        質(zhì)譜條件優(yōu)化方法是:在注射泵直接進(jìn)樣的條件下,在負(fù)離子模式下進(jìn)行母離子全掃描,確定低聚半乳糖的分子離子峰,然后以該分子離子峰為母離子,對其子離子進(jìn)行全掃描,獲得二級質(zhì)譜響應(yīng)較強的子離子,最后以多反應(yīng)監(jiān)測模式進(jìn)行采集,并獲得去簇電壓和碰撞能量等相關(guān)參數(shù),具體參數(shù)如表1所示,使所測的質(zhì)譜峰強度最優(yōu)。

        2.2 沉淀溶劑的選擇與優(yōu)化

        表1 3種低聚半乳糖保留時間與多反應(yīng)監(jiān)測條件

        圖1 3種低聚半乳糖(1000 μg/L)標(biāo)準(zhǔn)溶液的總離子色譜圖

        由于低聚半乳糖屬于水溶性多糖,因此采用超純水進(jìn)行提取,但乳粉中易溶于水的物質(zhì)多,尤其是蛋白質(zhì)含量高,對檢測造成很大的干擾,因此需要進(jìn)行一些預(yù)處理,降低干擾。本文分別使用無水乙醇、三氯乙酸∶乙酸鉛、乙腈作為蛋白質(zhì)沉淀劑,比較其沉淀效果。結(jié)果表明,用無水乙醇沉淀蛋白質(zhì)的效果優(yōu)于用三氯乙酸∶乙酸鉛、乙腈沉淀蛋白質(zhì)的效果。通過比較6∶4、5∶5、4∶6的無水乙醇∶水溶液的提取效果,結(jié)果發(fā)現(xiàn)4∶6的無水乙醇∶水溶液的提取效果明顯優(yōu)于其他2種,因此采用此溶劑作為提取溶劑。

        2.3 方法線性范圍和檢出限

        用50~1500 μg/L標(biāo)準(zhǔn)工作溶液進(jìn)樣分析,根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)濃度(x)和峰面積(y)計算的線性方程見表2。結(jié)果表明,3種低聚半乳糖標(biāo)準(zhǔn)曲線的相關(guān)系數(shù)為0.9986~0.9997,線性良好。方法檢出限(LOD)以空白樣品基質(zhì)稀釋標(biāo)準(zhǔn)曲線上的最低濃度出峰時,取信噪比 S/N=3計算得出。定量限(LOQ)以空白樣品基質(zhì)稀釋標(biāo)準(zhǔn)曲線上的最低濃度出峰時,取信噪比S/N=10計算得出。結(jié)果如表2所示,可以滿足3種低聚半乳糖痕量分析的需要。

        2.4 回收率和精密度

        表2 3種低聚半乳糖的方法檢出限、定量限、線性范圍、線性方程和相關(guān)系數(shù)

        分別準(zhǔn)確添加3種低聚半乳糖標(biāo)準(zhǔn)溶液于空白乳粉樣品中,設(shè) 3個添加濃度,每個濃度分別做 6次重復(fù)實驗,按上述方法測定,以得到的平均回收率評價分析方法的準(zhǔn)確度,以6次測試結(jié)果的相對標(biāo)準(zhǔn)偏差評價方法的精密度。添加水平為100、500、1000 μg/kg,平均添加回收率在80.8%~86.6%之間,相對標(biāo)準(zhǔn)偏差小于 8%(見表 3),均在允許范圍內(nèi),符合殘留分析的要求。

        表3 乳粉中3種低聚半乳糖平均回收率和精密度數(shù)據(jù)表(n=6)

        2.5 實際樣品測試

        為了驗證該實驗方法在實際樣品檢測中的應(yīng)用,本文檢測了市面上33種不同乳粉的低聚半乳糖含量,結(jié)果如表4所示。實際樣品檢測結(jié)果表明,毛蕊花糖的添加量是最少的,大多低于10 mg/kg,但都會存在于各大品牌的乳粉中,棉籽糖和水蘇糖添加量相對較多,但是基本情況是棉籽糖添加量多,則水蘇糖就添加少量或者不添加。

        3 結(jié)論

        通過對前處理方法和色譜質(zhì)譜條件的優(yōu)化,建立了乳粉中低聚半乳糖的高效液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜檢測方法,該方法簡單、快速、準(zhǔn)確,可實際應(yīng)用于乳粉中低聚半乳糖的批量檢測,能有效提高工作效率、降低分析成本。實際樣品檢測結(jié)果表明,毛蕊花糖的添加量是最少的,但都會存在于各大品牌的乳粉中,棉籽糖和水蘇糖添加量相對較多,但是基本情況是棉籽糖添加量多,則水蘇糖就添加少量或者不添加。

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