劉雪紅， 宋 平， 孫進(jìn)健

（大連市獸藥飼料監(jiān)察所，遼寧大連 116037）

目前，飼料中喹乙醇與喹烯酮的檢測(cè)方法主要有酶聯(lián)免疫分析法（趙春保等，2008）、高效液相色譜法（劉發(fā)全等，2008）、高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法 （2349號(hào)公告-6，2015；2086號(hào)公告-5，2014）。免疫分析法樣品前處理簡(jiǎn)單、檢測(cè)速度快，但容易產(chǎn)生假陽(yáng)性或假陰性的結(jié)果；液相色譜法靈敏度較低，檢出限較高；液相色譜—串聯(lián)質(zhì)譜法是應(yīng)用較廣泛的檢測(cè)飼料中喹 啉類(lèi)藥物的方法。文獻(xiàn)報(bào)道較多的是采用HLB固相萃取柱凈化，樣品前處理需配制多種試劑，操作步驟多，而且凈化所用固相萃取柱使用前需活化，備用液過(guò)柱后，需淋洗。整個(gè)前處理過(guò)程較長(zhǎng)，費(fèi)時(shí)費(fèi)力。本文采用PRiME HLB固相萃取柱凈化，Atlantis T3色譜柱分離，僅需配制1種試劑，無(wú)需氮吹，且所用的固相萃取柱無(wú)需活化和淋洗，分析速度快、回收率高，能滿(mǎn)足定性、定量的要求。

1 材料與方法

1.1 儀器與設(shè)備 電子天平RD-200，德國(guó)Sartorius公司；超聲波清洗器 KQ-250B，昆山市超聲儀器有限公司；立式低溫高速離心機(jī)CF16RN，日立公司；數(shù)顯強(qiáng)力渦旋混合器 MS3，德國(guó) IKA公司；液相色譜質(zhì)譜聯(lián)用儀UPLC XEVO TQ-S，美國(guó)Waters公司；色譜柱 Atlantis T3（2.1 mm×150 mm 5μm），美國(guó)Waters公司；色譜柱 ACQUITY UPLC BEH C18 （2.1mm×50mm 1.7μm），美國(guó)Waters公司；固相萃取柱 Oasis PRiME（HLB 3 mL 60 mg）。

1.2 藥品與試劑

1.2.1 標(biāo)準(zhǔn)品 喹乙醇批號(hào)H0061103，含量99.5%；喹烯酮 批號(hào)H0561305，含量99.6%，均來(lái)自中國(guó)獸醫(yī)藥品監(jiān)察所。

1.2.2 供試品

1.2.2.1 空白樣品 乳豬配合飼料：遼寧禾豐牧業(yè)股份有限公司，經(jīng)檢測(cè)不含喹乙醇和喹烯酮。

1.2.2.2 空白添加樣品 分別按照0.2、0.4、2 mg/kg的比例在空白樣品中添加喹乙醇和喹烯酮標(biāo)準(zhǔn)品，混勻。

1.2.3 試劑 甲醇、乙腈、甲酸色譜純，水為符合GB/T 6682規(guī)定的一級(jí)水。

0.1%甲酸溶液：量取1.0 mL甲酸與1000 mL水，混勻。 0.1%甲酸-乙腈（2+8）溶液：量取200 mL 0.1%甲酸溶液與800 mL乙腈，混勻。0.1%甲酸-乙腈（8+2）溶液：量取 800 mL 0.1%甲酸中溶液與200 mL乙腈，混勻。

1.2.4 混合標(biāo)準(zhǔn)貯備液（1000 μg/mL） 分別準(zhǔn)確稱(chēng)取喹乙醇和喹烯酮對(duì)照品各10 mg，于10 mL棕色容量瓶中，加2 mL二甲亞砜溶解，并用甲醇定容。-20℃密封避光保存，有效期為3個(gè)月。

1.2.5 混合標(biāo)準(zhǔn)工作液配制（10 μg/mL） 精密量取1.2.4項(xiàng)下混合標(biāo)準(zhǔn)貯備液1 mL用乙腈稀釋定容100 mL。-20℃密封避光保存，有效期為3個(gè)月。

喹烯酮和喹乙醇均對(duì)光敏感，見(jiàn)光易分解，所以在整個(gè)實(shí)驗(yàn)過(guò)程中必須避光操作，所用的器皿應(yīng)盡可能采用棕色。

1.3 樣品檢測(cè)

1.3.1 樣品處理

1.3.1.1 提取 稱(chēng)取2.00 g試樣 （精確至0.01 g），于聚丙烯離心管中，加入0.1%甲酸-乙腈溶液（2+8）20 mL， 渦動(dòng) 1 min，40℃ 超聲波清洗儀中超聲10 min。9000 r/min下離心15 min，備用。

1.3.1.2 凈化 精密量取1 mL上清液，直接過(guò)PRiME HLB固相萃取柱，收集全部流出液，精密量取3 mL水與之混勻，過(guò)0.22 μm濾膜供上機(jī)檢測(cè)。

1.3.2 液相色譜條件 色譜柱：Atlantis T3，柱溫：30℃，進(jìn)樣量：5 μL，梯度洗脫程序見(jiàn)表 1。

表1 梯度洗脫程序

1.3.3 質(zhì)譜條件 離子掃描方式：正離子，檢測(cè)方式：多反應(yīng)監(jiān)測(cè)，霧化器壓力：7.0 Bar，干燥氣流量：650 L/h，干燥氣溫度：400℃，毛細(xì)管電壓：3000 V定性、定量離子對(duì)和錐孔電壓及碰撞能量見(jiàn)表2。

表2 定性、定量離子對(duì)和錐孔電壓及碰撞能量

1.3.4 標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)繪制 精密量取1.2.5混合標(biāo)準(zhǔn)工作液逐級(jí)稀釋?zhuān)?.2.3.3稀釋液定容配制成濃度分別為 5、20、80、200、500 ng/mL 標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)溶液，混勻后上機(jī)測(cè)定。

2 結(jié)果

2.1 標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn) 以特征離子質(zhì)量色譜峰面積為縱坐標(biāo)，標(biāo)準(zhǔn)溶液濃度（ng/mL）為橫坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)。2種藥物在5～500 ng/mL時(shí)線(xiàn)性關(guān)系良好，相關(guān)系數(shù)均在0.996以上（表3）。

表3 2種藥物的標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)及相關(guān)系數(shù)

2.2 檢測(cè)限和定量限 添加適量混合標(biāo)準(zhǔn)工作液于空白飼料中，經(jīng)提取后測(cè)定。根據(jù)特征質(zhì)量色譜峰的信躁比S/N＞3為檢測(cè)限，信躁比S/N＞10為定量限，檢測(cè)到2種藥物的檢測(cè)限為0.06 mg/kg，定量限為0.2 mg/kg?？瞻罪暳现刑砑?.2 mg/kg的2種藥物特征離子質(zhì)量色譜圖見(jiàn)圖1。

圖1 空白飼料中添加0.2 mg/kg的2種藥物特征離子質(zhì)量色譜圖

2.3 回收率及重復(fù)性實(shí)驗(yàn) 在空白飼料中添加3個(gè)不同濃度（0.2、0.4、2 mg/kg）2 種藥物，進(jìn)行回收率實(shí)驗(yàn)，每個(gè)添加濃度做5個(gè)平行，連續(xù)測(cè)定3批，其平均回收率、相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差見(jiàn)表4。從表中實(shí)驗(yàn)結(jié)果可以看出2種藥物的添加回收率為80%～95.5%，批內(nèi)批間相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差均小于10%。

3 討論

3.1 選用Atlantis T3色譜柱分離，2種藥物峰形均良好。見(jiàn)圖1。采用C18色譜柱分離，喹烯酮峰形良好，喹乙醇受基質(zhì)干擾，峰形很差，見(jiàn)圖2。

3.2 采用目前的方法進(jìn)行檢測(cè)，與文獻(xiàn)中報(bào)道的液相色譜質(zhì)譜法比較，減少試劑的使用及操作步驟，節(jié)省試劑和時(shí)間，提高了檢測(cè)效率。前處理方法比較見(jiàn)表5。

表4 2種藥物回收率及重復(fù)性實(shí)驗(yàn)結(jié)果（n=5）

圖2 2種藥物（添加0.2 mg/kg）采用BEH C18色譜柱分離特征離子質(zhì)量色譜圖

3.3 基質(zhì)效應(yīng)研究 由于液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜存在基質(zhì)效應(yīng)，而且飼料樣品基質(zhì)復(fù)雜，因此對(duì)樣品基質(zhì)效應(yīng)進(jìn)行研究。比較3個(gè)不同條件下的信號(hào)峰面積：純的標(biāo)準(zhǔn)品溶液，樣品基質(zhì)提取后添加，樣品基質(zhì)提取前添加。在優(yōu)化實(shí)驗(yàn)條件下，用空白樣品按“1.3.1”方法制作空白基質(zhì)，加入一定量標(biāo)準(zhǔn)溶液，制成基質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)溶液；在空白樣品中加入一定量標(biāo)準(zhǔn)溶液，按“1.3.1”方法制成基質(zhì)匹配標(biāo)準(zhǔn)溶液；與相應(yīng)濃度的純標(biāo)準(zhǔn)溶液比較。實(shí)驗(yàn)結(jié)果發(fā)現(xiàn)，無(wú)明顯基質(zhì)效應(yīng)，因此定量時(shí)采用純的標(biāo)準(zhǔn)品曲線(xiàn)。

表5 2種前處理方法比較

4 結(jié)論

該檢測(cè)方法，定量限為0.2 mg/kg，在0.2、0.4、2 mg/kg添加水平下，喹乙醇和喹烯酮平均回收率為80%～95.5%，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差均小于10%。實(shí)驗(yàn)流程更簡(jiǎn)單、更快速、更有效，適合大批量日常分析檢測(cè)。