蔣蓓蕾， 陳金拳， 吳邦元

（1.淮安生物工程高等職業(yè)學(xué)校，江蘇淮安 223200；2.江蘇食品藥品職業(yè)技術(shù)學(xué)院，江蘇淮安 223200；3.西華師范大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，四川南充 637009）

蛋氨酸作為畜禽日糧中必需氨基酸，禽類的第一限制性必需氨基酸，具有較高的營(yíng)養(yǎng)價(jià)值和重要的生理功能（Oz等，2008；楊麗杰等，2004；胡杰等，2003），適量的蛋氨酸可促進(jìn)畜禽生長(zhǎng)發(fā)育，改善生產(chǎn)性能和胴體質(zhì)量（Xie等，2007），也可增強(qiáng)動(dòng)物的免疫功能 （Swain等，2000；瞿明仁等，1999）。若蛋氨酸缺乏將會(huì)影響動(dòng)物的采食，導(dǎo)致其體重降低，影響其免疫器官發(fā)育，甚至導(dǎo)致免疫器官受損（Wu等，2013），也會(huì)導(dǎo)致動(dòng)物患營(yíng)養(yǎng)性疾?。–ummins等，1986）。

免疫球蛋白是介導(dǎo)體液免疫的主要抗體，也是衡量機(jī)體免疫功能的重要指標(biāo)。蛋氨酸作為谷胱甘肽的前體氨基酸，在保護(hù)機(jī)體組織和細(xì)胞免受氧化損傷中發(fā)揮著重要的作用。本試驗(yàn)擬飼喂雛雞蛋氨酸缺乏的日糧，探討其對(duì)雛雞抗氧化功能和免疫球蛋白含量的影響，為蛋氨酸在動(dòng)物生產(chǎn)中的應(yīng)用提供理論依據(jù)。

1 材料方法

1.1 試驗(yàn)動(dòng)物及日糧組成 1日齡科寶（Cobb）肉雞健雛 120 羽，體重（41±3）g，購(gòu)于常州市廣大養(yǎng)殖有限公司。隨機(jī)分為2組，每組6個(gè)重復(fù)，每個(gè)重復(fù)10只雛雞，其中一個(gè)重復(fù)用于全程觀察記錄體重使用。各組雛雞分別飼養(yǎng)于試驗(yàn)禽籠內(nèi)，自由采食，飲用去離子水。管理方式與常規(guī)育雛一致，試驗(yàn)期42 d。日糧配方參照肉雞NRC（1994）的營(yíng)養(yǎng)標(biāo)準(zhǔn)（表1）。

表1 試驗(yàn)日糧組成及營(yíng)養(yǎng)水平

1.2 主要試劑和儀器 主要試劑：過氧化氫酶（CAT）測(cè)定試劑盒（A007-2）、總超氧化物歧化酶（T-SOD）測(cè)試盒（A001-1-1）、谷胱甘肽過氧化物酶（GSH-Px）測(cè)定試劑盒 （A005）、還原型谷胱甘肽（GSH）測(cè)定試劑盒（A006-1）、羥自由基測(cè)試試劑盒（A018）以及丙二醛（MDA）測(cè)定試劑盒（A003-1）（購(gòu)自南京建成生物工程研究所，南京，中國(guó)），IgAELISA 試劑盒 （A003403）、IgG-ELISA 試劑盒（A003421）以及 IgM-ELISA 試劑盒（A003403）（上海撫生實(shí)業(yè)有限公司），生理鹽水，PBS緩沖液，冰醋酸（AR級(jí)，乙酸含量99%以上）。

主要儀器：分光光度計(jì)/酶標(biāo)儀/半自動(dòng)生化分析儀 （比色測(cè)定波長(zhǎng)為532 nm）、恒溫水浴箱（孵育溫度為95℃以上）、臺(tái)式離心機(jī)、漩渦混勻器、微量移液器、注射器等。

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1 臨床觀察 試驗(yàn)第 7、14、21、28、35、42 天空腹稱取對(duì)照組及蛋氨酸缺乏組雛雞體重，全程觀察、統(tǒng)計(jì)分析兩組雛雞體重增長(zhǎng)情況。

1.3.2 抗氧化指標(biāo)的檢測(cè) 試驗(yàn)第14、28、42天，對(duì)照組及蛋氨酸缺乏組每組隨機(jī)抽取5只雛雞，頸靜脈采血，分離血清（不抗凝），用于以下檢測(cè)抗氧化指標(biāo)：SOD活性的檢測(cè)——羥胺法，CAT活性的檢測(cè)——紫外分光光度法，GSH-Px活性的檢測(cè)——DTNB顯色法比色法，GSH含量性的檢測(cè)——Pseudo-end Point分光光度法；抑制羥自由基的檢測(cè)——鄰苯三酚比色法，MDA含量的檢測(cè)——硫代巴比妥酸法TBA法。

具體檢測(cè)步驟參照南京建成生物工程研究所試劑說明書進(jìn)行。

1.3.3 免疫球蛋白含量檢測(cè) 試驗(yàn)第14、28、42天，每組隨機(jī)抽取5只雛雞，頸靜脈抗凝采血并分離血清，采用雞免疫球蛋白ELISA測(cè)定試劑盒分別測(cè)定血清中IgG、IgM和IgA的含量，操作步驟如下：

各組血清樣本40 μL，分別加入抗-IgA、抗-IgG以及抗-IgM抗體10 μL、鏈霉親和素-HRP 50 μL，蓋膜混勻后于 37℃孵育 60 min；清洗后加入顯色劑A 50 μL和顯色劑B 50 μL，混勻后37℃避光顯色10 min；各孔加入終止液50 μL，終止反應(yīng)至藍(lán)色轉(zhuǎn)為黃色；以空白孔調(diào)零，450 nm波長(zhǎng)測(cè)量各孔吸光度（OD值）。

按照說明書做標(biāo)準(zhǔn)曲線，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)品的濃度及對(duì)應(yīng)的OD值計(jì)算出標(biāo)準(zhǔn)曲線回歸方程，再根據(jù)兩組中各測(cè)定血清樣品的OD值在回歸方程上計(jì)算出對(duì)應(yīng)的樣品濃度即為對(duì)應(yīng)免疫球蛋白的含量。

1.4 數(shù)據(jù)處理 數(shù)據(jù)經(jīng)SPSS 16.0及Excel軟件統(tǒng)計(jì)。各組數(shù)據(jù)均以“平均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差”表示，并用獨(dú)立樣本T檢驗(yàn)分析法比較蛋氨酸缺乏組與對(duì)照組間差異的顯著性。其中P＜0.05表示與對(duì)照組相比差異顯著，P＜0.01表示與對(duì)照組相比差異極顯著。

2 試驗(yàn)結(jié)果

2.1 臨床觀察 試驗(yàn)第6天開始，蛋氨酸缺乏組雛雞采食量與對(duì)照組比較出現(xiàn)較小程度的下降。試驗(yàn)期間對(duì)照組及蛋氨酸缺乏組雛雞均未死亡。蛋氨酸缺乏組雛雞的生長(zhǎng)發(fā)育遲緩，與對(duì)照組比較，體重降低，體形小。兩組雛雞初始體重?zé)o顯著差異。14日齡至42日齡蛋氨酸缺乏組雛雞體重均顯著或極顯著低于對(duì)照組（P＜0.05或P＜0.01），體重分別降低了 40.54、191.6、218.4 g，如圖 1。

圖1 試驗(yàn)雛雞體重增長(zhǎng)

2.2 抗氧化指標(biāo)檢測(cè)結(jié)果

2.2.1 SOD活性的變化 由圖2可見，SOD活性在14日齡時(shí)與對(duì)照組比較降低了21.73 U/mL，但不顯著（P＞0.05）；28日齡時(shí)SOD酶的活性顯著降低了55.52 U/mL （P＜0.05）；42日齡時(shí)活性極顯著降低（P＜0.01），降低了52.58 U/mL。

圖2 血清SOD活性變化

2.2.2 CAT活性的變化 如圖3所示，14日齡和28日齡時(shí)蛋氨酸缺乏組CAT酶活性與對(duì)照比較分別顯著降低 （P ＜ 0.05）14.54、17.31 U/g Hb；42日齡時(shí)，蛋氨酸缺乏組CAT酶的活性降低了 29.35 U/gHb（P ＜ 0.01）。

圖3 血清CAT活性變化

2.2.3 GSH-Px活性的變化 如圖4所示，GSH-Px活性在14日齡時(shí)與對(duì)照組比較均無(wú)顯著變化（P＞0.05），降低了79.71 U，28日齡和42日齡時(shí)蛋氨酸缺乏組GSH-Px活性顯著降低（P＜0.05），分別減少了 102、132.75 U。

圖4 血清GSH-Px活性變化

2.2.4 GSH含量性的變化 如圖5所示，GSH的含量變化較顯著，14日齡時(shí)蛋氨酸缺乏組GSH含量無(wú)顯著變化，僅降低了0.12 mg GSH/L（P＞0.05），28日齡和42日齡時(shí)GSH含量與對(duì)照組相比分別降低了 0.71、0.88 mg GSH/L（P ＜ 0.01）。

圖5 血清GSH含量性變化

2.2.5 抑制羥自由基的變化 如圖6所示，14日齡時(shí)蛋氨酸缺乏組抑制羥自由基能力與對(duì)照組相比無(wú)顯著的變化（P＞0.05），僅降低了1.1 U/mL；28日齡和42日齡時(shí)缺乏組抑制羥自由基能力顯著或極顯著降低 （P＜0.05或P＜0.01），分別降低了46.5、91.5 U/mL。

圖6 血清抑制羥自由基能力變化

2.2.6 MDA含量的變化 如圖7所示，MDA的含量在14日齡時(shí)蛋氨酸缺乏組與對(duì)照組相比升高了0.26 nmol/mL（P ＜ 0.05），28日齡和 42日齡時(shí)缺乏組MDA的含量分別升高了1.11、1.28 nmol/mL（P＜0.05或P＜0.01）。

圖7 血清MDA含量變化

2.3 免疫球蛋白含量檢測(cè)結(jié)果

2.3.1 IgA含量的變化 由圖8可見，14日齡時(shí)，蛋氨酸缺乏組IgA含量與對(duì)照組比較無(wú)顯著變化 （P＞0.05），28日齡和42日齡時(shí)，IgA含量與對(duì)照組比較差異極顯著（P＜0.01），分別降低2.22、3.07μg/mL。

圖8 血清IgA含量變化

2.3.2 IgG含量的變化 由圖9可見，14日齡和28日齡時(shí)，蛋氨酸缺乏組IgG含量與對(duì)照組相比分別顯著降低了 3.46和 3.55 μg/mL （P＜0.05），42日齡時(shí)，IgG含量極顯著低于對(duì)照組 （P＜0.01），降低了 7.16 μg/mL。

圖9 血清IgG含量變化

2.3.3 IgM含量的變化 由圖10可見，14日齡至42日齡時(shí)，蛋氨酸缺乏組IgM含量與對(duì)照組相比均顯著或極顯著低于對(duì)照組 （P＜0.05或P＜0.01），分別降低了 1.71、2.7、2.85 μg/mL。

圖10 血清IgM含量變化

3 討論

本試驗(yàn)臨床研究發(fā)現(xiàn)，雛雞飼料中蛋氨酸缺乏會(huì)導(dǎo)致雛雞生長(zhǎng)受到抑制，食欲減退等臨床癥狀，這與 Carew 等（2003）及 Konashi等（2000）研究報(bào)道的臨床癥狀相似。雛雞出現(xiàn)生長(zhǎng)抑制可能主要是蛋白質(zhì)沉積能力受到影響，即蛋氨酸對(duì)蛋白質(zhì)的合成率和分解率起作用（容庭等，2008），蛋氨酸攝入不足就會(huì)影響蛋白質(zhì)的合成，繼而導(dǎo)致雛雞生長(zhǎng)受到抑制。

機(jī)體一直處于自由基產(chǎn)生和清除的平衡過程，若平衡失調(diào)，機(jī)體細(xì)胞就會(huì)有過多的氧化脂質(zhì)類物質(zhì)積聚，自由基的持續(xù)產(chǎn)生會(huì)超過細(xì)胞內(nèi)的抗氧化防御機(jī)制，導(dǎo)致氧化應(yīng)激（Halliwell，2007）?？寡趸烙鶛C(jī)制最主要的即是抗氧化劑，它主要包括抗氧化酶類和非抗氧化酶類?？寡趸割愑蠸OD和CAT，它們是組織細(xì)胞抗氧化的第一道防線，可以清除細(xì)胞產(chǎn)生的H2O2（Adedara等，2010）。本試驗(yàn)研究發(fā)現(xiàn)，蛋氨酸缺乏組雛雞抗氧化酶SOD、CAT和GSH-Px活性均降低，最終導(dǎo)致羥自由基的產(chǎn)生而引起脂質(zhì)過氧化作用。在非酶類抗氧化劑中GSH發(fā)揮著主要作用，它是機(jī)體氧化應(yīng)激的早期生物學(xué)標(biāo)志 （Gagliano等，2006）。本試驗(yàn)中GSH-Px活性的降低可能也由于GSH活性的降低導(dǎo)致的。本試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)蛋氨酸缺乏組MDA含量均顯著升高。MDA是通過某些初級(jí)或次級(jí)脂質(zhì)過氧化產(chǎn)物的分解產(chǎn)生的終產(chǎn)物。它的產(chǎn)生可以導(dǎo)致膜流動(dòng)性的改變，并使膜的脆性增加（Chen等，1994），并產(chǎn)生許多生物分子，包括DNA、脂質(zhì)、蛋白質(zhì)、碳水化合物或任何相近的分子，最終一連串的連鎖反應(yīng)導(dǎo)致機(jī)體組織細(xì)胞的損傷。而蛋氨酸缺乏導(dǎo)致氧化損傷可能是因?yàn)樗鳛楣入赘孰牡那绑w氨基酸，在保護(hù)細(xì)胞免受氧化損傷和抗氧化中發(fā)揮著十分重要的作用（Reed，1990；Reed 等，1977），其缺乏可導(dǎo)致自由基產(chǎn)生，最終因蛋氨酸缺乏誘導(dǎo)了雛雞機(jī)體的抗氧化功能降低。

免疫球蛋白尤其是血清中的免疫球蛋白是介導(dǎo)體液免疫的主要抗體，也是反映全身免疫水平或免疫應(yīng)答水平的重要指標(biāo)。本研究發(fā)現(xiàn)，蛋氨酸缺乏組雛雞血清IgA、IgG和IgM含量與對(duì)照組相比顯著或極顯著降低，其原因可能是與法氏囊結(jié)構(gòu)受損后B淋巴細(xì)胞數(shù)量的減少有著密切的關(guān)系（Wu 等，2013），此結(jié)果也與張永翠等（2009）和侯永清等（2001）在新西蘭肉兔和斷奶仔豬上研究結(jié)果一致。由此推測(cè)蛋氨酸缺乏會(huì)導(dǎo)致雛雞漿細(xì)胞抗體產(chǎn)生過程受到抑制，從而使免疫球蛋白（I-gA、IgG和IgM）生成量減少，表明機(jī)體體液免疫功能受損。

4 結(jié)論

蛋氨酸缺乏可導(dǎo)致雛雞抗氧化功能和體液免疫功能下降，從而造成機(jī)體損傷和抵抗力降低。