王 松 ， 江成英 *， 鄭喜群 ， 劉曉蘭 ， 許紅麗 ， 董 楠 ， 張忠月

（1.齊齊哈爾大學(xué)食品與生物工程學(xué)院，黑龍江齊齊哈爾 161006；2.齊齊哈爾大學(xué)農(nóng)產(chǎn)品加工黑龍江省普通高校重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，黑龍江齊齊哈爾161006）

玉米蛋白粉飼料作為蛋白質(zhì)飼料中重要的一種，由于其中含有大量蛋白質(zhì)成分被廣泛應(yīng)用（林謙等，2013），但是其中的蛋白質(zhì)大部分為醇溶蛋白不能被動(dòng)物吸收與利用。通過(guò)微生物發(fā)酵的方法可降解玉米蛋白粉中的醇溶蛋白，能夠顯著提高玉米蛋白粉飼料的利用率 （江成英等，2018）。本研究通過(guò)紫外線誘變育種的方法來(lái)篩選得到產(chǎn)蛋白酶活力有明顯提高的枯草芽孢桿菌（王雅君等，2013），用以發(fā)酵玉米蛋白粉飼料，以期提高玉米蛋白粉飼料的醇溶蛋白降解率，進(jìn)而提高其動(dòng)物利用率。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌種 本試驗(yàn)采用的菌種為齊齊哈爾大學(xué)生物工程實(shí)驗(yàn)室保藏的枯草芽孢桿菌。

1.1.2 實(shí)驗(yàn)儀器 紫外可見分光光度計(jì)（日本島津儀器廠），電熱恒溫水浴鍋（上海躍進(jìn)醫(yī)療器械廠），高速離心機(jī) （北京京立離心機(jī)有限公司），PHS-25數(shù)顯pH計(jì) （上海精密科學(xué)儀器有限公司），BS224S型電子天平 （北京賽多利斯儀器廠），ZD-8801振蕩器（太倉(cāng)科教器材廠），隔水式電熱恒溫培養(yǎng)箱（上海躍進(jìn)醫(yī)療器械廠），不銹鋼壓力蒸汽滅菌器（上海申安醫(yī)療器械廠），超凈工作臺(tái)（上海智城分析儀器有限公司），旋渦混合器（北京市金北德工貿(mào)易有限公司）等。

1.1.3 培養(yǎng)基 LB培養(yǎng)基：胰蛋白胨1%，酵母粉5%，氯化鈉 1%，pH為7.0。固體培養(yǎng)基加入2%的瓊脂。121℃滅菌30 min；脫脂牛奶培養(yǎng)基：A：5 g脫脂牛奶與 50 mL蒸餾水混合；B：2 g瓊脂溶于50 mL蒸餾水。A，B分別115℃滅菌20 min，冷卻至60℃混勻后倒平板。

1.2 方法

1.2.1 菌種生長(zhǎng)曲線測(cè)定 由于菌懸液中的菌體濃度在一定范圍內(nèi)與菌懸液渾濁度成正比，所以采用比濁法測(cè)定原始菌株的生長(zhǎng)曲線 （朱艷蕾，2016）。

1.2.2 致死率曲線測(cè)定 制備菌懸液，使用紫外燈對(duì)菌懸液進(jìn)行不同時(shí)間（0～90 s）的照射，每隔5 s進(jìn)行一次取樣，稀釋之后進(jìn)行平板涂布。將平板倒扣培養(yǎng)進(jìn)行菌落計(jì)數(shù)，繪制致死率曲線。

1.2.3 突變株的篩選 將誘變處理后的菌株涂布于脫脂牛奶平板上。計(jì)算透明圈直徑與菌落直徑的比值，篩選出產(chǎn)蛋白酶活力較強(qiáng)的菌株。

1.2.4 酶活力測(cè)定 蛋白酶活力采用福林酚法進(jìn)行測(cè)定。

1.2.5 傳代穩(wěn)定性試驗(yàn) 將篩選出的菌株傳代并測(cè)定其酶活，評(píng)定該突變菌株的遺傳穩(wěn)定性（劉天祎，2017）。

1.2.6 發(fā)酵驗(yàn)證試驗(yàn) 將誘變獲得的菌株11-1接入玉米蛋白粉中進(jìn)行固態(tài)發(fā)酵，以驗(yàn)證其對(duì)玉米蛋白粉飼料的發(fā)酵能力。

2 結(jié)果與分析

2.1 原始菌種的生長(zhǎng)曲線 進(jìn)行紫外誘變處理時(shí)，一般要求誘變菌種應(yīng)處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期，此時(shí)的菌種對(duì)于紫外線更敏感，更容易發(fā)生突變，而且處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的菌種代謝能力強(qiáng)，相對(duì)穩(wěn)定，生長(zhǎng)速度快繁殖旺盛，易于做重復(fù)試驗(yàn)。

由圖1所示，0～4 h期間菌體濃度幾乎無(wú)變化，此時(shí)菌種處于生長(zhǎng)適應(yīng)期。從5 h開始菌種出現(xiàn)迅速增長(zhǎng)，可知原始菌種的對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期為5～24 h，24 h后菌種生長(zhǎng)速度減緩，進(jìn)入穩(wěn)定期，進(jìn)行紫外誘變時(shí)應(yīng)選擇對(duì)數(shù)中前期的菌種進(jìn)行誘變，所以選擇經(jīng)過(guò)14 h培養(yǎng)的菌懸液進(jìn)行紫外誘變處理。

圖1 枯草芽孢桿菌生長(zhǎng)曲線

2.2 致死率曲線 進(jìn)行紫外誘變育種時(shí)應(yīng)當(dāng)選擇使菌種致死率達(dá)到80%的紫外光照射時(shí)間為最佳誘變劑量。當(dāng)菌種致死率達(dá)到80%，菌種的變異概率大，更易發(fā)生突變。

如圖2所示，隨著紫外照射時(shí)間的增加，菌種的死亡率逐漸增加，當(dāng)照射時(shí)間達(dá)到55 s時(shí)，致死率達(dá)到79.62%，當(dāng)照射時(shí)間達(dá)到70 s時(shí)菌種死亡率達(dá)到100%。因此采用55 s為最佳誘變劑量進(jìn)行下一步誘變育種試驗(yàn)。

圖2 枯草芽孢桿菌致死率曲線

2.3 高產(chǎn)蛋白酶突變菌株篩選 根據(jù)脫脂牛奶篩選培養(yǎng)基上透明圈直徑與菌落直徑的比值，篩選出5株產(chǎn)蛋白酶活力較強(qiáng)的菌株，結(jié)果見表1。

表1 高產(chǎn)蛋白酶突變菌株篩選結(jié)果

其中突變株11-1的透明圈直徑與菌落直徑比值與原始菌株相比變化最大，達(dá)到10.86，該透明圈與菌體直徑的比值表示該菌種產(chǎn)蛋白酶對(duì)蛋白質(zhì)的水解能力，透明圈與直徑比值越大則說(shuō)明該菌株產(chǎn)蛋白酶活力越大。經(jīng)過(guò)測(cè)量之后發(fā)現(xiàn)11-1的比值與原始菌株相比有明顯提高，則說(shuō)明經(jīng)過(guò)紫外誘變育種之后原始菌株的產(chǎn)蛋白酶能力得到了明顯的提高，較原始菌株透明圈與菌落直徑比值6.67相比提高了約1.63倍。

2.4 突變菌株的酶活力測(cè)定 將篩選出的突變株接入液體LB培養(yǎng)基中培養(yǎng)，取培養(yǎng)液離心取其上清液測(cè)定酶活力。

如表2所示，篩選出的5株突變株中，突變株11-1與22-4產(chǎn)蛋白酶活力相差不多，11-1相對(duì)更高，所以選用11-1進(jìn)行下一步遺傳穩(wěn)定性試驗(yàn)。11-1產(chǎn)蛋白酶活力較原始菌株21.515 U/mL提高最大，數(shù)值達(dá)到35.301 U/mL，說(shuō)明原始枯草芽孢桿菌經(jīng)過(guò)紫外誘變育種之后產(chǎn)蛋白酶能力得到了明顯的提升，較原始菌株提高了約1.66倍。

表2 突變株蛋白酶活力U/mL

2.5 遺傳穩(wěn)定試驗(yàn) 對(duì)突變株11-1進(jìn)行連續(xù)傳代培養(yǎng)，驗(yàn)證其遺傳穩(wěn)定性，結(jié)果見表3。

表3 突變株11-1的遺傳穩(wěn)定性U/mL

對(duì)突變菌株11-1連續(xù)傳代8次，其蛋白酶活力基本穩(wěn)定。傳代第八次與原始菌株的酶活力相比有所降低，變化約為4.8%，變化幅度不顯著，證明連續(xù)傳代會(huì)對(duì)突變菌株11-1的產(chǎn)蛋白酶活力造成一定影響，但影響程度不大，可以認(rèn)為高產(chǎn)蛋白酶突變株11-1遺傳性能良好，可做為發(fā)酵玉米蛋白粉飼料菌株。

2.6 發(fā)酵驗(yàn)證試驗(yàn) 將誘變所得對(duì)玉米蛋白粉進(jìn)行發(fā)酵試驗(yàn)，以驗(yàn)證其發(fā)酵能力。將玉米蛋白粉和麩皮以 7∶3混合，料水比為 1∶1.2，接入 5%的11-1菌株，置于30℃發(fā)酵84 h，測(cè)定其可溶性蛋白含量，結(jié)果見表4。

表4 突變株11-1與原始菌株發(fā)酵能力比較%

由表4可知未經(jīng)發(fā)酵的原料中可溶蛋白含量為3.97%，經(jīng)過(guò)原始菌株發(fā)酵的飼料可溶蛋白含量為6.34%，可溶蛋白含量轉(zhuǎn)化率為37.39%。經(jīng)過(guò)突變菌株11-1發(fā)酵的飼料中可溶蛋白含量為7.61%，可溶蛋白含量的轉(zhuǎn)化率為47.83%。可以看出經(jīng)突變菌株11-1發(fā)酵過(guò)后的玉米蛋白粉飼料中的可溶蛋白含量較原始枯草芽孢桿菌相比有明顯提高?？梢缘贸鼋Y(jié)論突變菌株11-1經(jīng)紫外誘變后有更好的降解飼料能力，經(jīng)11-1發(fā)酵過(guò)后的飼料能夠更容易被吸收，提高了玉米蛋白粉飼料的利用率，具有良好的發(fā)展前景。

3 結(jié)論

使用枯草芽孢桿菌所產(chǎn)生的蛋白酶在各個(gè)行業(yè)均已被大量應(yīng)用（Schallmey等，2004）。本研究通過(guò)紫外誘變育種篩選出一株遺傳性狀穩(wěn)定的較原始菌株產(chǎn)蛋白酶能力有明顯提高的枯草芽孢突變菌株11-1。經(jīng)測(cè)定該菌株的透明圈直徑比值為10.86，較原始菌株擴(kuò)大1.63倍；蛋白酶活力為35.301 U/mL，較原始菌株的蛋白酶活力提高1.66倍。通過(guò)連續(xù)傳代試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)其蛋白酶活力變化率為4.8%，變化幅度不顯著，證明其遺傳性能穩(wěn)定。發(fā)酵試驗(yàn)表明，經(jīng)突變菌株11-1發(fā)酵的玉米蛋白粉中可溶蛋白轉(zhuǎn)化率為47.83%，較未誘變的原始菌株提高了10.44%。表明紫外誘變育種技術(shù)能夠有效的提高枯草芽孢桿菌的產(chǎn)蛋白酶能力，并且能夠穩(wěn)定遺傳，可用于發(fā)酵玉米蛋白粉飼料的生產(chǎn)，為微生物發(fā)酵生產(chǎn)玉米蛋白粉飼料奠定了基礎(chǔ)。