王鑫，徐美玲，張起瑩，嵇冶，張昊

（長春理工大學 生命科學技術學院，長春 130022）

內毒素是革蘭氏陰性菌細胞壁上的一種成分，當細菌死亡后會大量釋放。人體內毒素含量過高會導致發(fā)熱、心跳過速、低血壓、休克甚至死亡[1]。因此人體內毒素檢測一直是臨床及醫(yī)療器械、藥物檢測的必檢指標。目前常規(guī)的檢測方法主要有：凝膠法、濁度法和比色法。但原理都是基于內毒素能與鱟試劑發(fā)生特異性反應。鱟是國家二級保護動物，隨著檢測市場需求量增加，鱟血提取過度使得資源枯竭，造成鱟試劑檢測成本增高，進而造成生態(tài)環(huán)境平衡的不可逆破壞，并且利用鱟試劑的檢測方法檢測時間長，因此研究能夠替代天然鱟試劑的檢測方法迫在眉睫[2-5]。

噬菌體展示技術就是在噬菌體表面展示出具有獨立的空間結構以及生物活性的肽或者蛋白，用于篩選出與特異分子結合的肽或者蛋白質[6]。此方法目前已廣泛用于新興疫苗的研究、酶抑制劑的篩選、醫(yī)學診斷和治療藥物的開發(fā)、蛋白質相互作用等[7-10]。

本文利用噬菌體展示技術篩選出能夠與內毒素高效特異結合的十二肽，采用生物分子相互作用系統(tǒng)對其特異親和性進行表征[11-12]；進而共價偶聯(lián)乳膠微球，建立一種特異結合多肽檢測內毒素的快速比濁定量檢測方法，當樣品中含有被測內毒素時，多肽能夠與內毒素特異性結合，經紫外可見光分光光度計測定600nm處微球-多肽與內毒素復合物的吸光度值，經標準曲線能夠計算獲得被測內毒素的含量，對該方法進行評價，為內毒素檢測提供新方法。

1 實驗部分

1.1 實驗材料

M13噬菌體隨機十二肽庫試劑盒（New England Biolabs），內毒素（0111：B4購自Sigma公司），內毒素標準品（中國食品藥品檢定研究院），鼠內毒素單克隆抗體（Abnova），PEG8000（Amresco），SA探針試劑盒（PALL），直徑60mm培養(yǎng)皿（賽默飛），熒光酶標板（Greiner bio one），F(xiàn)ortbio分子互作儀（PALL）。

1.2 實驗方法

1.2.1 噬菌體肽庫的親和篩選

將內毒素用包被液稀釋至10μg/mL，取1.5mL包被塑料培養(yǎng)皿，4℃過夜。次日棄去包被液，加入封閉液4℃孵育2h。棄去封閉液，TBST洗滌平皿7次。取10μL原始庫溶液用1M TBST稀釋，加入平皿，室溫輕輕搖動1h。移去肽庫溶液，TBST洗滌平皿10次。加入1mL洗脫液，室溫平緩搖動10min后將洗脫液收集，立即加入150μL中和液至中性。取1μL測滴度，其余加入20mL處于對數(shù)生長期的ER2738菌液中，37℃，220rpm/min孵育5h，特異性結合的噬菌體克隆得到擴增。應用PEG8000/NaCl沉淀噬菌體，在鋪有IPTG和X-gal的平板上測定擴增的噬菌體的滴度。共進行3輪親和篩選，逐步減少內毒素濃度，縮短噬菌體克隆與內毒素的結合時間，增加Tween20的濃度。

1.2.2 滴度測定

接種環(huán)挑取少量-70℃凍存的E.coli ER2738菌種，劃線接種于LB瓊脂板上，翻轉平皿，37℃孵育過夜。挑取ER2738菌落至5mL LB培養(yǎng)基中，在225rpm/min，37℃培養(yǎng)至對數(shù)中期。分別加入200μL對數(shù)中期的菌液至10個EP管中。噬菌體洗脫物用LB培養(yǎng)液作梯度稀釋，每個稀釋度各取10μL分別加入裝有菌液的EP管中，快速震蕩，室溫孵育5min。分別加入3mL頂層培養(yǎng)基至4mL EP管中，置于45℃恒溫培養(yǎng)箱，將上述噬菌體與大腸桿菌混合液轉移至其中，快速震蕩，立即倒入37℃預熱的LB/IPTG/X-gal/Tet培養(yǎng)皿中，將頂層培養(yǎng)基迅速攤開。冷卻后，將培養(yǎng)皿倒置放于37℃恒溫培養(yǎng)箱中過夜培養(yǎng)。次日觀察培養(yǎng)板，計算噬菌體滴度。1.2.3 陽性噬菌體克隆融合肽單鏈DNA的提取和測序以及十二肽合成

取陽性克隆噬菌體上清100μL加到宿主菌中震蕩培養(yǎng)，離心后從上清提取單鏈DNA，瓊脂糖凝膠電泳顯示1條單一明亮條帶。將樣品送至上海生物工程公司進行測序，并合成十二肽和生物素標記十二肽。

1.2.4 生物分子互作表征

（1）SA探針固定十二肽

用PBS溶解合成的生物素標記十二肽至終濃度為1mg/mL做為母液，采用PBST（PBS緩沖液+0.05%Tween-20）生物素標記十二肽母液分別稀釋 至 100μg/mL、50μg/mL、25μg/mL 和 12.5μg/mL，在黑色熒光微孔板的第一列中加入200μL PBST，在第二列中分別加入稀釋的十二肽溶液200μL，37℃預熱，反應溫度30℃；SA光纖探針在第一列PBST中激活10min，然后插入到第二列與十二肽結合5min，最后插入到第一列PBST溶液中解離5min；整理分析數(shù)據(jù)，確定SA探針固定生物素標記十二肽的最佳濃度。

（2）生物素標記的十二肽與內毒素親和性

生物素標記十二肽用PBST稀釋至最佳固定濃度，采用PBST將內毒素分別稀釋至1mg/mL、500μg/mL、250μg/mL、125μg/mL、62.5μg/mL、31.25μg/mL和15.625μg/mL，在黑色熒光酶標板第一列和第三列加入200μL PBST，第二列加入200μL生物素標記十二肽溶液，第四列分別加入20μL梯度稀釋的內毒素溶液并加入陰性對照PBST緩沖液；試劑37℃預熱，反應溫度30℃，SA光纖探針首先在第一列PBST中激活10min，隨后在第二列中包被十二肽，然后在第三列PBST溶液中洗去非特異性吸附的生物素標記十二肽，隨后在第四列包被的十二肽與內毒素結合5min，最后在第三列中解離5min，數(shù)據(jù)分析，獲得十二肽與內毒素結合的動力學反應參數(shù)。

1.2.5 內毒素檢測方法的建立

將合成的十二肽采用EDC/NHS共價偶聯(lián)至乳膠微球（180nm），偶聯(lián)產物與不同濃度內毒素混合后孵育，由于十二肽與內毒素能夠發(fā)生特異性結合，能夠形成復合物，使得溶液濁度隨著內毒素濃度改變而改變，采用紫外可見光分光光度計在600nm波長下檢測不同濃度內毒素-多肽-微球復合物吸光值，內毒素標準品濃度為橫坐標，吸光值為縱坐標，建立檢測標準曲線，從而實現(xiàn)樣本中內毒素的定量檢測。

1.2.6 方法學回收率的評估

將內毒素標準品分別配制為0.05EU/mL、0.10EU/mL、0.20EU/mL、0.40EU/mL，采用上述建立的增強免疫比濁法檢測已知濃度內毒素，測定濃度與實際濃度的比值即為該方法的加標回收率，用來評價檢測方法的精密度與準確性。

1.2.7 方法學比較

461醫(yī)院提供血清89份，利用市售鱟試劑內毒素檢測試劑盒與本文建立的檢測方法同時對血清樣本進行檢測，結果進行對比。

2 結果與討論

2.1 高親和性噬菌體克隆子的篩選

以內毒素為目標分子在十二肽庫中進行親和篩選，經過3輪洗脫，得到與內毒素親和力高的噬菌體克隆子。經3輪篩選，結果如表1所示，十二肽庫回收率從3×10-4提高至6.7×10-1。

表1 篩選噬菌體隨機肽庫回收率

2.2 陽性噬菌體克隆融合肽單鏈DNA的提取及序列測定

碘化物法提取經內毒素親和性篩選獲得的8個陽性噬菌體克隆單鏈DNA，瓊脂糖凝膠電泳鑒定結果如圖1所示，將該樣本送公司測序，獲得的DNA序列經DNASTAR軟件綜合分析，融合表達的十二肽庫氨基酸序列為QVTPQVPRSTQM。

圖1 碘化物法提取陽性噬菌體克隆單鏈DNA的鑒定結果

2.3 生物分子互作系統(tǒng)表征十二肽與內毒素親和性

在SA探針表面包被不同濃度生物素標記十二肽，包被過程曲線如圖2所示，曲線4為12.5μg/mL生物素標記十二肽，結合曲線上升速度均勻，且信號強度較高，因此為最適包被濃度。

包被有十二肽的SA探針在梯度稀釋內毒素標準品溶液中進行結合與解離檢測，測定曲線如圖3所示，解離平衡常數(shù)KD即二者親和力能夠達到3.52×10-9，該數(shù)值越小，證明篩選出的十二肽與內毒素親和力越強。利用上述方法分別對50mg/L的（1，3）-β-D-葡聚糖，海藻糖，葡萄糖與十二肽的結合/解離平衡常數(shù)進行測定，結果表明，篩選出的十二肽與（1，3）-β-D-葡聚糖，海藻糖，葡萄糖無親和力。因此，篩選出的十二肽與內毒素的結合是高度專一的。

圖2 SA探針表面包被不同濃度生物素標記十二肽過程曲線ρ十二肽（μg/ml）：A1：100.B1：50.C1：25.D1：12.5.

圖3 十二肽與不同濃度內毒素標準品的結合與解離曲線ρ內毒素EU/mL：A4：0.48.；B4：0.24；C4：0.12.；D4：0.06；E4：0.03；F4：PBS；G4：空；H4：空

2.4 增強免疫比濁法內毒素檢測標準曲線

分別配制內毒素標準品濃度為0.48EU/mL、0.24EU/mL、0.12EU/mL、0.06EU/mL、0.03EU/mL，用注射用水作為空白對照，分別向比色皿內加入300μL不同濃度內毒素標準品和3mL濃度為100μg/mL十二肽（PB緩沖液稀釋），混勻，37℃反應5min。采用紫外-可見光分光光度計，在600nm波長下測定其吸光度，以內毒素標準品濃度為橫坐標，以吸光度值為縱坐標，繪制檢測標準曲線，如圖4所示，內毒素在0.03～0.48EU/mL濃度范圍內，內毒素標準品濃度與吸光度值呈正線性相關，線性方程為（y=0.0465ln(x)+0.1721），相關系數(shù)R2=0.9925，檢測下限為0.03EU/mL，檢測時間短，僅需5min。

圖4 增強免疫比濁法內毒素定量檢測標準曲線

2.5 方法回收率評價

如表2所示，取300μL配制的已知濃度內毒素標準品加入到3ml濃度為100μg/mL的十二肽溶液中，混勻，37℃反應5min，同一濃度內毒素反復測定5次?；厥章使浇Y果表明，該檢測方法回收率為96%～110%。

表2 回收率評估結果

2.6 方法學比較

采用市售鱟試劑內毒素檢測試劑盒與本文建立的檢測方法同時對50例患者血清和39例健康病人血清中內毒素含量進行測定，檢測結果如表3所示，兩種檢測方法的陽性結果符合率為98%（49/50），陰性結果符合率為100%（39/39）。

表3 兩種內毒素的檢測方法對比

3 結論

本文成功利用噬菌體展示技術篩選出能夠與內毒素結合的十二肽，并通過分子互作技術驗證了該十二肽與內毒素具有高度親和性，解離平衡常數(shù)KD=3.52×10-9mol/L。將十二肽與乳膠微球偶聯(lián)后建立了增強免疫增強免疫比濁法檢測內毒素的新方法，內毒素標準品在0.03～0.48EU/mL濃度范圍內，其濃度與吸光度值呈正線性相關，相關系數(shù)R2＞0.99，檢測下限達到0.03EU/mL，該方法的批間和批內的變異系數(shù)小于5%，該方法回收率為96%～110%，與市售鱟試劑內毒素檢測試劑盒同時測定血清樣本，測定結果陽性符合率為98%，陰性符合率為100%。

增強免疫比濁法內毒素檢測方法采用噬菌體展示技術篩選出與內毒素具有高結合性的十二肽，無需利用天然鱟試劑，能夠降低檢測成本，保護自然環(huán)境生態(tài)平衡；并且該方法步驟簡單，檢測時間短，僅需5min即可完成樣本測定，符合臨床快速檢測需求，乳膠微球在免疫比濁中起到增強效應，提高了檢測靈敏度，同時該方法容易實現(xiàn)高通量，彌補了國內外檢測方法的不足，預期能夠在醫(yī)療器械，食品藥品，醫(yī)療診斷等領域發(fā)揮重要作用。