歷雪，夏青，李艷，趙鳳勝，何秀霞

（1.長春理工大學(xué) 生命科學(xué)技術(shù)學(xué)院，長春 130022；2.長春理工大學(xué) 校醫(yī)院，長春 130022）

食源性疾病[1-2]已經(jīng)對人類的健康帶來了嚴(yán)重的危害[3]，而全世界所有食源性疾病暴發(fā)案例中，有60%以上為細(xì)菌性致病菌污染食物所致的，食品的細(xì)菌污染是指暴露于環(huán)境中的食品通過不同途徑被細(xì)菌污染，在細(xì)菌作用下腐敗變質(zhì)，失去其應(yīng)有的營養(yǎng)成分，從而影響其食用性和安全性的現(xiàn)象。人們在食用了被有害細(xì)菌污染的食品后，會發(fā)生各種中毒現(xiàn)象，同時細(xì)菌污染是最常見的食品污染之一。大腸桿菌[4]和金黃色葡萄球菌[5]是最容易感染食品的病原菌，當(dāng)其含量過高時會造成食物中毒，嚴(yán)重的時也可引起肺炎、偽膜性腸炎、心包炎等，甚至敗血癥，與此同時金黃色葡萄球菌和大腸桿菌也極容易感染傷口，引起局部化膿感染，嚴(yán)重的情況下會造成膿毒癥等全身感染。而沙門氏菌[6]和粘質(zhì)沙雷氏菌[7]廣泛存在于動、植物性等其他食品中，據(jù)統(tǒng)計(jì)在世界各國的細(xì)菌性食物中毒中，沙門氏菌引起的食物中毒常列榜首。沙門氏菌是會引起食物腐敗造成食物中毒，導(dǎo)致胃腸炎、傷寒和副傷寒的細(xì)菌，而人體攝入粘質(zhì)沙雷氏菌后，當(dāng)機(jī)體免疫功能降低時，則會引起肺部和尿道感染以及敗血癥，因此選取這四種病原菌作為指示菌對于實(shí)驗(yàn)研究是十分必要的。

而目前食品行業(yè)普遍采用化學(xué)防腐劑來對食品和肉類進(jìn)行抗菌與防腐，眾所周知，化學(xué)防腐劑雖然有一定的抗菌和防腐的作用，但是其誘癌性與致畸性對人類健康也存在潛在的危害[8]，因此開發(fā)出高效、安全、穩(wěn)定的天然防腐抗菌劑[9-11]已經(jīng)成為新型防腐劑研究的重要方向。我國藥典中記錄了4773種中草藥，其中研究發(fā)現(xiàn)有2000多種具有抑菌作用[12]，因此中藥成為了天然抗菌防腐劑的最佳資源。黃連[13-14]、迷迭香[15-16]、大蒜[17-18]在以往的文獻(xiàn)報道中都具有良好的抗菌效果，而獨(dú)角蓮[19]雖然有一定的毒性，但是含量較少的時候并不會造成嚴(yán)重的影響，而市面銷售的抗菌藥膏也有獨(dú)角蓮成分的添加，因此本文也選用獨(dú)角蓮作為藥物之一。但是中草藥的種類繁多，不同的中草藥對同一種微生物的抑制作用也不同，本文研究了4種中草藥對常見的致病菌的抑制作用以及抗氧化活性，并在此基礎(chǔ)上進(jìn)行兩兩混合，以研究兩種中草藥之間是否存在促進(jìn)作用，同時這也對開發(fā)天然抗菌防腐劑以及制備抗菌生態(tài)乳膏具有一定的意義。

1 實(shí)驗(yàn)

1.1 材料

中藥：黃連、迷迭香、獨(dú)角蓮（吉林大藥房）、大蒜（市售）

菌種：金黃色葡萄球菌、大腸桿菌、粘質(zhì)沙雷氏菌、沙門氏菌（來自于長春理工大學(xué)生命科學(xué)技術(shù)學(xué)院微生物實(shí)驗(yàn)室）

藥品與儀器：山梨酸鉀、苯甲酸鈉、對羥基苯甲酸丙酯（上海生工）、DPPH（美國SIGMA公司）、牛肉膏、蛋白胨（英國OXOID公司）、752型紫外可見分光光度計(jì)（上海奧析科學(xué)有限公司）、細(xì)胞超聲破碎儀（上海安亭科學(xué)儀器）

1.2 中藥提取液的制備

將購買的黃連、獨(dú)角蓮、迷迭香，剪碎研磨，過40目篩板后，準(zhǔn)確稱取50g，置于燒杯中，加入500mL 80%乙醇浸泡24h，超聲破碎30min，在4℃、12000r/min的條件下離心20min，取上清液。將沉淀收集起來，重復(fù)上述操作。將兩次得到的液體相加。將濾液在60℃條件下蒸發(fā)，濃縮至25mL。用濾器過濾除菌，即制得黃連、獨(dú)角蓮、迷迭香的提取液，置于4℃冰箱備用。

準(zhǔn)確稱量200g大蒜，去皮，置于榨汁機(jī)，往榨汁機(jī)中加入400mL蒸餾水，壓榨成汁靜置48h。超聲破碎30min，在4℃、12000r/min的條件下離心20min，取上清液。將上清液于60℃條件下進(jìn)行蒸發(fā)，濃縮到100mL，收集濃縮液，用濾器過濾除菌即得大蒜的提取液，置于4℃冰箱備用。以上中藥提物液，濃度均為2g/mL。

1.3 濾紙片法測定抑菌圈大小

參照濾紙片法[20-22]使用打孔器制成直徑為6mm的圓形濾紙片，滅菌后備用。夾取充分浸泡后的濾紙片貼在含菌平板上（含有乙醇的濾紙片晾干后使用），每個平板均勻貼3-4片，倒置于恒溫培養(yǎng)箱中進(jìn)行培養(yǎng)，然后測量抑菌圈的大小，大腸桿菌、金黃色葡萄球菌、沙門氏菌、粘質(zhì)沙雷氏菌作為供試菌種進(jìn)行抑菌實(shí)驗(yàn)。

1.4 二倍稀釋法測定最小抑菌濃度

采用二倍稀釋法[23-24]，將中藥提物液稀釋成10個梯度，稀釋后的濃度為：1g/mL、0.5g/mL、0.25g/mL、 0.125g/mL、 0.0625g/mL、 0.03125g/mL、0.0156g/mL、0.0078g/mL、0.0039g/mL、0.00195g/mL然后方法同前，采用金黃色葡萄球菌作為指示菌進(jìn)行抑菌試驗(yàn)。

1.5 不同中草藥提取物兩兩混合后抑菌圈大小的測定

將大蒜、迷迭香、黃連和獨(dú)角蓮提取液等比例兩兩混合，得到大蒜和黃連混合物（大+黃）、大蒜和迷迭香混合物（大+迷）、大蒜和獨(dú)角蓮混合物（大+獨(dú)）、迷迭香和黃連混合物（迷+黃）、迷迭香和獨(dú)角蓮混合物（迷+獨(dú)）、黃連和獨(dú)角蓮的混合物（黃+獨(dú)），同樣采用金黃色葡萄球菌作為指示菌進(jìn)行抑菌試驗(yàn)。

1.6 與常見的防腐劑進(jìn)行比較

目前，我國食品中添加的防腐劑[25-26]主要為苯甲酸鈉、山梨酸鉀、對羥基苯甲酸丙酯。參照國家食品添加劑使用標(biāo)準(zhǔn)的相關(guān)規(guī)定配制這兩種溶液。取適量的黃連、獨(dú)角蓮、迷迭香、大蒜的提取液用濾紙片法測定對金黃色葡萄球菌的抑菌效果，方法同前，并與防腐劑的抑菌效果進(jìn)行對比。

1.7 DPPH法測定中藥提取物的抗氧化活性

DPPH[27-28]溶液的配制：準(zhǔn)確稱量0.004g DPPH粉末，用甲醇溶解并定容于10mL容量瓶中，DPPH濃度為1mmoL/mL，避光保存（4℃），現(xiàn)用現(xiàn)配。

（1）取中藥提物液1mL及濃度為0.1mmoL/mL的DPPH溶液3mL先后加入同一具塞試管中，搖勻，在3500r/min下離心20min，以甲醇為空白在517nm測定其吸光度Ai。

（2）取3mL 0.1mmoL/mL的DPPH溶液與1mL甲醇混合，搖勻，在3500r/min下離心20min，以甲醇為空白在517nm測定其吸光度Ao。

（3）取1mL大蒜水提物與3mL甲醇混合，搖勻，在3500r/min下離心20min，以甲醇為空白在517nm測定其吸光度Aj。根據(jù)下列公式計(jì)算植物提取液對DPPH的抑制率，即：

式中，Ai為加抗氧化劑后DPPH溶液的吸光度；Ao為加抗氧化劑時DPPH溶液的吸光度；Aj為重要提取液在測定波長的吸光度。

（4）測度清除率并繪制清除率與樣品濃度曲線，通過曲線計(jì)算出IC50。IC50是指DPPH的抑制率為50%時的提取物溶液濃度。IC50越小，抗氧化能力越強(qiáng)。將試驗(yàn)重復(fù)3次，求得抑制率的平均值。

2 結(jié)果與討論

2.1 中藥提取液對4種常見的病原菌的抑制作用

表1 幾種藥物（2g/mL）抑菌圈直徑大小

結(jié)果如表1顯示，獨(dú)角蓮對這4種病原菌均無抑制作用，黃連、迷迭香和大蒜對大腸桿菌、金黃色葡萄球菌、沙門氏菌有一定的抑制作用，對金黃色葡萄球菌的作用明顯更強(qiáng)，只有黃連對粘質(zhì)沙雷氏菌有抑制作用。

2.2 MIC的測定

表2 幾種藥物對金黃色葡萄球菌的最小抑菌濃度（mg/mL）

由于這幾種中藥提取液都對金黃色葡萄球菌的抑制效果更明顯，且金黃色葡萄球菌非常常見，因此選取金黃色葡萄球菌作為指示菌，由表2可知，迷迭香的最小抑菌濃度為1.95mg/mL，其次為黃連3.9mg/mL、大蒜250mg/mL，因此不同的中藥提取物對金黃色葡萄球菌的敏感性不同，金黃色葡萄球菌對迷迭香更敏感。

2.3 藥物兩兩混合后對金黃色葡萄球菌的抑制作用

將中藥提取液兩兩混合后，與原液進(jìn)行抑菌圈大小的比較，由表3可知，發(fā)現(xiàn)了一個很有趣的現(xiàn)象，雖然獨(dú)角蓮沒有抑菌效果，但是加入獨(dú)角蓮提取物后，黃連和迷迭香提取物與原液相比，抑菌的效果有了一定的提高，具體機(jī)制還需要進(jìn)一步研究，而其他的則無明顯效果，大蒜和其他幾種中藥的提取物混合后，其抑菌圈明顯減小，主要原因兩者沒有促進(jìn)作用，大蒜的濃度降低造成的。

表3 藥物兩兩混合后對金黃色葡萄球菌的抑制作用

2.4 與常見的防腐劑對金黃色葡萄球菌的抑制作用進(jìn)行比較

由表4可知，除獨(dú)角蓮?fù)獾膸追N中藥提取物與常見的防腐劑比較，對金黃色葡萄菌的抑制作用均優(yōu)于防腐劑，其中大蒜和黃連的作用效果最強(qiáng)，由此可見黃連、迷迭香、大蒜均有作為天然防腐劑的潛力。

表4 幾種藥物與常見的防腐劑對金黃色葡萄球菌的抑制作用

2.5 中藥提取物抗氧化活性IC50的測定

由表5可知，迷迭香和黃連對DPPH自由基的清除能更強(qiáng)，其抗氧化活性能力從大到小依次為：迷迭香、黃連、獨(dú)角蓮、大蒜。迷迭香的抗氧化能力最強(qiáng)，其IC50值為0.325mg/mL。

表5 幾種藥物的IC50值

3 結(jié)論

不同的中藥提取液對不同的微生物有著不同的抑制作用和敏感性，研究發(fā)現(xiàn)黃連、大蒜、迷迭香對金黃色葡萄球菌均有較好的抑制作用，而其中的黃連和大蒜的抑制效果更明顯，通過與常見的防腐劑比較以及抗氧化活性試驗(yàn)的研究，進(jìn)一步確定了迷迭香、黃連、大蒜具有作為天然防腐劑的潛力，而通過兩兩混合藥物的研究，發(fā)現(xiàn)獨(dú)角蓮對迷迭香和黃連的抑菌活性具有一定促進(jìn)作用，這也為日后天然防腐劑以及抗菌的生態(tài)乳膏制備中成分的添加起到了一定作用。