張景，潘姝歷，馬良，郭婷，張宇昊

(西南大學(xué) 食品科學(xué)學(xué)院，重慶，400715)

赭曲霉毒素A(ochratoxin A， OTA)是由曲霉菌屬和青霉菌屬等絲狀真菌產(chǎn)生的次級代謝產(chǎn)物，其毒性大、分布廣，對農(nóng)產(chǎn)品污染嚴(yán)重，與人類健康密切相關(guān)[1]。OTA能對多種谷物、飼料及酒類造成不同程度的污染[2-3]，具有腎毒性、肝毒性、基因毒性、致畸性、免疫毒性和胚胎毒性等[4-6]。1993年國際癌癥研究機(jī)構(gòu)(The International Agency for Research on Cancer，IARC)將OTA確定為ⅡB類致癌物[7]。目前歐盟規(guī)定在混合果干、葡萄干中OTA的限量為10.0 μg/kg，葡萄汁及葡萄酒中最大限量為2.0 μg/kg，谷物加工食品和嬰幼兒食品中的限量為0.50 μg/kg[8]。國內(nèi)對OTA制定的限量標(biāo)準(zhǔn)為葡萄酒2.0 μg/kg[9]，其中臺灣對嬰兒食品中OTA的限量標(biāo)準(zhǔn)為不得檢出[10]。OTA日益嚴(yán)格的限量標(biāo)準(zhǔn)要求必須匹配超高靈敏度的OTA檢測方法。

當(dāng)前國內(nèi)外針對食品中OTA的檢測方法主要有依托大型精密儀器的精準(zhǔn)檢測技術(shù)，如高效液相色譜法[11-13]和液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用法[14]等。還有各種快檢技術(shù)，如熒光快檢方法[15]、膠體金免疫層析法[16]、免疫傳感器[17]、酶聯(lián)免疫分析法[18]等。其中酶聯(lián)免疫分析法結(jié)合化學(xué)發(fā)光反應(yīng)[19-20]不需外界光源、背景干擾較低，信號放大優(yōu)勢明顯且能大批量樣品同時(shí)檢測。目前化學(xué)發(fā)光免疫檢測法主要采用魯米諾發(fā)光體系(luminol-H2O2-HRP)[21-22]，但依然存在發(fā)光時(shí)間短、易受底物干擾等弊端。高效穩(wěn)定的化學(xué)發(fā)光體系是提高方法靈敏度的關(guān)鍵。除了提升抗體的質(zhì)量，尋找具有更高發(fā)光強(qiáng)度的化學(xué)發(fā)光體系以提高OTA的檢測靈敏度是一個(gè)重要突破口。

本實(shí)驗(yàn)基于發(fā)光效率更高、強(qiáng)度更大、壽命更長的新型雙[2,4,6-三氯苯基]草酸酯發(fā)光體系(TCPO-H2O2-PHPPA Dimer)，研究該體系對檢測OTA靈敏度的影響，構(gòu)建一種檢測OTA的高靈敏間接競爭化學(xué)發(fā)光酶聯(lián)免疫分析方法(indirect competitive chemiluminescence enzyme immonoassay，icCLEIA)。目前，以TCPO-H2O2-熒光物質(zhì)化學(xué)發(fā)光體系為手段的檢測方法報(bào)道較少，且主要集中在獸藥殘留[23]、葡萄球菌腸毒素C1[24]、生物胺[25]等的檢測，而因真菌毒素極性的影響，檢測方面尚無報(bào)道。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

OTA、玉米赤霉烯酮(zearalenone，ZEN)、T-2毒素(T-2 toxin，T-2)、脫氧雪腐鐮刀菌烯醇(deoxynivalenol，DON)、展青霉素(patulin，PAT)、細(xì)交鏈格孢菌酮酸(tenuazonic acid，TA)等標(biāo)準(zhǔn)品(新加坡Pribolab公司)；黃曲霉毒素B1(aflatoxinB1，AFB1)、雙[2,4,6-三氯苯基]草酸酯(TCPO)、3-(4-羥苯基)丙酸(PHPPA)、過氧化脲(CH4N2O·H2O2)(美國Sigma公司)；抗OTA單克隆抗體(5 mg/mL，株號：6E12A)、OTA-BSA抗原(6 mg/mL)(北京沫之東生物技術(shù)有限公司)；辣根過氧化物酶(horseradish peroxidase，HRP)標(biāo)記羊抗小鼠IgG-HRP(BST11C18 B50)(武漢博士德公司)；咪唑(天津市遠(yuǎn)航化學(xué)品有限公司)；乙腈、HCl、Na2CO3、NaHCO3、Na2HPO4·12H2O、KH2PO4、NaCl、KCl、Tween-20(成都科龍化工試劑公司)；脫脂奶粉、葡萄汁、葡萄干(購于重慶市北碚區(qū)永輝超市)；所有試劑均為國產(chǎn)分析純，實(shí)驗(yàn)用水為超純水。

1.2 儀器與設(shè)備

Syneng H1MG多功能酶標(biāo)儀(Gene Company Limited公司)；96孔可拆化學(xué)發(fā)光酶標(biāo)板(上海生工生物有限公司)；恒溫培養(yǎng)箱(長城科工貿(mào)有限公司)；pHS-4C酸度計(jì)(上海科學(xué)儀器公司)；JS系列電子天平(精度0. 000 1 g,上海精天電子儀器有限公司)；HJ-3恒溫?cái)?shù)顯磁力攪拌器(江蘇科析有限公司)。

1.3 方法

1.3.1 icCLEIA檢測OTA

用0.05 mol/L碳酸鹽緩沖溶液(pH值9.6)將包被原OTA-BSA稀釋至1 μg/mL，加入96孔白色酶標(biāo)板中，每孔100 μL，4 ℃過夜。每孔加入200 μL 50 mg/mL脫脂奶粉封閉液，37 ℃溫育1 h。將OTA標(biāo)準(zhǔn)品從100 ng/mL開始用PBS(0.01 mol/L磷酸鹽緩沖液，pH 7.4)10倍倍比稀釋成14個(gè)梯度，分別取50 μL各濃度稀釋液加入封閉好的板孔中，每個(gè)濃度梯度做3個(gè)重復(fù)孔，零標(biāo)準(zhǔn)品孔和空白孔用PBS代替，用PBST(含有0.05% Tween-20 的0.01 mol/L PBS緩沖液溶液)將抗OTA單克隆抗體稀釋10 000倍，每孔再加入50 μL，37 ℃溫育0.5 h。PBST稀釋的酶標(biāo)二抗(IgG-HRP)4 000倍，每孔100 μL，37 ℃溫育1 h。每次加液前先甩板且拍干，PBST洗板2次(每次3 min)，再拍干。每孔加入100 μL等體積混合的過氧化脲PBS溶液(7×10-3mol/L)與PHPPA PBS溶液(7×10-3mol/L)，37 ℃溫育10 min。從各反應(yīng)孔中移取50 μL反應(yīng)后的酶催化產(chǎn)物至另一白色酶標(biāo)板，加入含咪唑的1 mol/L過氧化脲，混勻后加入0.01 mol/L TCPO乙腈溶液，每孔25 μL。酶標(biāo)儀測定相對發(fā)光強(qiáng)度(relative light units, RLU)，作競爭抑制曲線。

1.3.2 icCLEIA工作參數(shù)研究

研究免疫反應(yīng)階段(OTA-BSA包被濃度、抗OTA單抗?jié)舛?、IgG-HRP稀釋度)、HRP酶反應(yīng)階段(緩沖液pH值、過氧化脲與PHPPA的濃度、酶反應(yīng)時(shí)間)和化學(xué)發(fā)光階段(TCPO乙腈溶液濃度、過氧化脲乙腈溶液濃度、咪唑濃度)的反應(yīng)條件對RLUmax/IC50、IC50、RLUmax的影響。按照1.3.1的實(shí)驗(yàn)過程和條件，固定其他條件不變，對上述各反應(yīng)階段對應(yīng)每個(gè)工作參數(shù)進(jìn)行調(diào)整研究。

1.3.3 icCLEIA的標(biāo)準(zhǔn)工作曲線

根據(jù)1.3.2確定的條件參數(shù)，按照1.3.1操作步驟進(jìn)行檢測。以O(shè)TA濃度的對數(shù)值lgC為橫坐標(biāo)，各標(biāo)準(zhǔn)品孔發(fā)光強(qiáng)度RLU與零標(biāo)準(zhǔn)品孔最大發(fā)光值RLUmax的比值(RLU/RLUmax)為縱坐標(biāo)，每個(gè)梯度做3個(gè)重復(fù)，繪制icCLEIA法的競爭抑制曲線，抑制率=1-RLU/RLUmax，抑制率為50%時(shí)對應(yīng)的OTA標(biāo)準(zhǔn)品濃度即為IC50。其中IC20～I(xiàn)C80對應(yīng)的OTA濃度為該方法的檢測范圍，在該范圍內(nèi)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，得到線性回歸方程。

1.3.4 最低檢出限

(1)

1.3.5 準(zhǔn)確度

稱取5.0 g葡萄干樣品于50 mL離心管中，除空白組外分別加入2 000、20 000、40 000 ng OTA標(biāo)準(zhǔn)品，加入30 mL甲醇-水溶液[V(甲醇)∶V(水溶液)=1∶1(含4% NaCl)]，渦旋振蕩20 min，用快速定性濾紙過濾，用PBS緩沖液將濾液稀釋N(50)倍后，分別取 50 μL濾液進(jìn)行檢測。

移取5.0 mL葡萄汁樣品于15 mL尖底離心管中，除空白組外分別加入1 000、10 000、20 000 ng OTA標(biāo)準(zhǔn)品，加冰乙酸調(diào)節(jié)pH值為3.5，然后快速注入100 μL [C8MIM][PF6]與0.8 mL丙酮的混合溶液，渦旋振蕩3 min，形成霧狀溶液，4 000 r/min離心5 min，最后準(zhǔn)確移取30 μL離心管底部的離子液體，PBS緩沖液稀釋N(100)倍后用icCLEIA檢測。按公式(2)計(jì)算回收率。

(2)

式中：60為樣品前處理和檢測方法的既定稀釋倍數(shù)，N為根據(jù)樣品濃度預(yù)計(jì)稀釋倍數(shù)。

1.3.6 精密度

以批內(nèi)變異和批間變異衡量精密度。取6個(gè)不同批次的化學(xué)發(fā)光酶標(biāo)板，icCLEIA法測定OTA標(biāo)準(zhǔn)品0.05、0.5、5 ng/mL時(shí)各孔的RLU值，每個(gè)濃度做6次重復(fù)，計(jì)算批內(nèi)變異系數(shù)和批間變異系數(shù)。

1.3.7 特異性

以交叉反應(yīng)率來評價(jià)抗體的特異性，交叉反應(yīng)率越低特異性越好。將AFB1、DON、T-2、PAT、ZEN、和TA等真菌毒素標(biāo)準(zhǔn)品倍比稀釋為系列濃度(0.01～100 ng/mL)，在相同條件參數(shù)下進(jìn)行icCLEIA檢測，分別作分析物及其類似物的競爭抑制曲線，得出IC50值，并計(jì)算交叉反應(yīng)率。

(3)

1.3.8 icCLEIA與GB 5009.96—2016方法對比

參照GB 5009.96—2016中的免疫親和層析凈化液相色譜法[27]，以O(shè)TA標(biāo)準(zhǔn)品濃度分別為0.05、0.1、0.25、1、2.5、5、7、10、15 ng/mL為橫坐標(biāo)，峰面積為縱坐標(biāo)，作HPLC標(biāo)準(zhǔn)曲線。對葡萄干和葡萄汁樣品進(jìn)行加標(biāo)回收試驗(yàn)，加標(biāo)水平分別為0.5、1、3、5 ng/g和0.5、1、3、5 ng/mL，分別用icCLEIA和HPLC方法進(jìn)行檢測，比較2種方法檢測結(jié)果的相關(guān)性。

2 結(jié)果與分析

2.1 檢測過程及發(fā)光機(jī)理

因OTA為小分子抗原缺乏可作夾心法的2個(gè)以上位點(diǎn)，故采用間接競爭法模式，過程及機(jī)理見圖1。以酶標(biāo)板空白孔為固定材質(zhì)，將包被抗原OTA-BSA固定于酶標(biāo)板中成固相抗原，待檢樣品中的OTA和固相包被抗原OTA-BSA競爭結(jié)合一定量特異性抗OTA抗體形成免疫復(fù)合物，IgG-HRP再與免疫復(fù)合物結(jié)合。之后二抗上標(biāo)記的HRP催化過氧化脲氧化PHPPA，生成具有熒光PHPPA Dimer(圖1中(1)式)，然后過氧化氫將TCPO氧化成高能量的活性中間體，PHPPA Dimer從活性中間體吸收能量成激發(fā)態(tài)((PHPPA Dimer)*)，當(dāng)從激發(fā)態(tài)回到基態(tài)時(shí)即產(chǎn)生化學(xué)發(fā)光(圖1中(2)式)。

圖1 檢測過程及化學(xué)發(fā)光機(jī)理示意圖
Fig.1 Detection process and chemiluminescence mechanism

待測樣品中OTA抗原含量與IgG-HRP、PHPPA Dimer的量密切相關(guān)，同時(shí)發(fā)光強(qiáng)度依賴于具有更高發(fā)光量子產(chǎn)率的TCPO，此增強(qiáng)化學(xué)發(fā)光體系可更靈敏地檢測OTA抗原。

2.2 免疫反應(yīng)階段對發(fā)光強(qiáng)度和增敏效果的影響研究

2.2.1 OTA-BSA包被濃度

不同OTA-BSA包被濃度結(jié)果如圖2所示。

IC50隨OTA-BSA包被濃度的增加而上升，RLUmax/IC50在包被濃度為1.0 μg/mL時(shí)最大。OTA-BSA包被濃度越小，OTA標(biāo)準(zhǔn)品競爭結(jié)合特異性抗體越多，洗板后殘留的抗體越少，發(fā)光強(qiáng)度越低。而OTA-BSA包被原濃度過高，不僅浪費(fèi)而且容易產(chǎn)生多層抗原吸附，在操作過程中易脫落從而降低方法的敏感性和重復(fù)性。RLUmax/IC50越大、IC50越低，說明方法的檢測效果越好，故確定OTA-BSA包被濃度為1.0 μg/mL。

圖2 不同包被原濃度對icCLEIA的影響
Fig.2 Effect of different concentration of coating
antigen on icCLEIA

2.2.2 抗OTA單抗稀釋倍數(shù)

抗OTA單抗?jié)舛戎苯佑绊慖gG-HRP的結(jié)合量，對發(fā)光強(qiáng)度和檢測靈敏度造成影響，單抗?jié)舛认♂尡稊?shù)越高，其與IgG-HRP特異性結(jié)合量越少，TCPO發(fā)光體系信號越低，故圖3顯示RLUmax隨單抗稀釋倍數(shù)增加而下降。但當(dāng)抗OTA單抗稀釋倍數(shù)較低時(shí)，競爭反應(yīng)效果會受到一定程度的影響，因而表現(xiàn)為IC50值在稀釋倍數(shù)低于10 000倍時(shí)明顯偏大。RLUmax/IC50在稀釋倍數(shù)為10 000倍時(shí)最高，故在后續(xù)實(shí)驗(yàn)中抗OTA單抗稀釋倍數(shù)采用10 000倍，此時(shí)檢測靈敏度較高。

圖3 抗OTA單抗?jié)舛葘cCLEIA的影響
Fig.3 Effect of different concentration of anti-OTA on
icCLEIA

2.2.3 IgG-HRP稀釋度

IgG-HRP的品質(zhì)和用量與發(fā)光強(qiáng)度及檢測靈敏度存在著極為緊密的聯(lián)系，因IgG-HRP標(biāo)記的HRP的催化能力決定著PHPPA被氧化成為PHPPA Dimer的量，從而對后續(xù)化學(xué)發(fā)光反應(yīng)效果造成影響。IgG-HRP稀釋倍數(shù)越高，HRP的濃度越低，圖4顯示RLUmax逐漸減小，整體發(fā)光信號減弱，競爭反應(yīng)效果受影響。而隨著IgG-HRP稀釋倍數(shù)的增加，IC50先降低后上升。當(dāng)IgG-HRP稀釋4000倍時(shí)RLUmax/IC50值高于其他稀釋度，說明在此濃度下檢測方法的靈敏度相對較高，故確定IgG-HRP稀釋倍數(shù)為4 000。

圖4 IgG-HRP稀釋度對icCLEIA的影響
Fig.4 Effect of different concentration of IgG-HRP on
icCLEIA

2.3 HRP酶反應(yīng)階段對發(fā)光強(qiáng)度和增敏效果的影響研究

2.3.1 過氧化脲與PHPPA的濃度

在二抗反應(yīng)結(jié)束后，標(biāo)記于二抗的HRP催化H2O2氧化PHPPA，此時(shí)每2個(gè)PHPPA的苯環(huán)上分別脫去1個(gè)氫原子，結(jié)合形成具有熒光的PHPPA二聚體，H2O2和PHPPA的濃度對PHPPA二聚體的產(chǎn)量有直接影響。結(jié)果如圖5所示。

a-過氧化脲;b-PHPPA圖5 HRP酶反應(yīng)試劑濃度對icCLEIA的影響Fig.5 Effect of HRP enzyme concentration on icCLEIA

過氧化脲濃度低于5.0×10-3mol/L時(shí)，該方法的發(fā)光強(qiáng)度低，無法達(dá)到增強(qiáng)檢測靈敏度的效果。而當(dāng)過氧化脲濃度高于7.0×10-3mol/L時(shí)，體系發(fā)光強(qiáng)度增加不明顯，且IC50值略有上升。隨著PHPPA濃度的增加，發(fā)光強(qiáng)度逐漸增大，IC50呈現(xiàn)先降低后增加的趨勢。因此，當(dāng)CH4N2O·H2O2濃度為7.0×10-3mol/L，PHPPA濃度為7.0×10-3mol/L時(shí)，能獲得最大的發(fā)光信噪比。

2.3.2 酶反應(yīng)時(shí)間

HRP是一種利用過氧化氫可以氧化大多數(shù)有機(jī)物和無機(jī)物的血紅素酶，其最適反應(yīng)溫度為37 ℃[28]，且HRP催化H2O2氧化PHPPA的反應(yīng)發(fā)生較快[29]。故研究20 min內(nèi)此體系的反應(yīng)情況，結(jié)果如圖6，在酶催化反應(yīng)的前10 min，PHPPA Dimer大量生成，導(dǎo)致最終的發(fā)光強(qiáng)度不斷上升，而10 min后，化學(xué)發(fā)光的增加緩慢，且IC50值明顯增大，說明延長酶反應(yīng)的時(shí)間，不利于降低檢測方法的靈敏度。在反應(yīng)進(jìn)行到10 min時(shí)，RLUmax/IC50達(dá)到最大值，此時(shí)方法的檢測靈敏度最佳，因此，確定酶反應(yīng)時(shí)間為10 min。

圖6 酶反應(yīng)時(shí)間對icCLEIA的影響
Fig.6 Effect of different enzyme reaction time on
icCLEIA

2.4 化學(xué)發(fā)光階段對發(fā)光強(qiáng)度和增敏效果的影響研究

2.4.1 TCPO乙腈溶液濃度

因OTA在乙腈溶液中有較好的溶解度，為了實(shí)現(xiàn)OTA檢測的高靈敏度，將TCPO溶于乙腈溶液中，并考察TCPO乙腈溶液的濃度對體系發(fā)光強(qiáng)度和檢測靈敏度的影響如圖7所示。

圖7 TCPO濃度對icCLEIA的影響
Fig.7 Effect of different concentration of TCPO on icCLEIA

TCPO添加量過多或過少，均會導(dǎo)致不同標(biāo)準(zhǔn)品濃度孔產(chǎn)生的發(fā)光信號減小，競爭抑制曲線下降趨勢減緩，IC50增大。TCPO濃度越大，體系發(fā)光強(qiáng)度越大，但背景值也隨之增加，掩蓋目標(biāo)物發(fā)光信號，影響檢測靈敏度。IC50在TCPO濃度為1×10-2mol/L降到最低值后開始上升，可能因?yàn)殡S著TCPO濃度的增大過氧化氫被迅速消耗，影響了高能量活性中間體的及時(shí)產(chǎn)生。RLUmax/IC50值在1×10-2mol/L時(shí)最大，此時(shí)具有最大的發(fā)光信噪比，可達(dá)到最佳的檢測靈敏度。故確定TCPO乙腈溶液濃度為0.01 mol/L。

2.4.2 過氧化脲乙腈溶液濃度

H2O2濃度直接影響能向PHPPA Dimer提供能量使其產(chǎn)生化學(xué)發(fā)光的活性中間體的量。圖8顯示，當(dāng)H2O2乙腈溶液濃度低于1 mol/L時(shí)，IC50變化明顯，當(dāng)H2O2乙腈溶液濃度高于1 mol/L，RLUmax隨過氧化脲乙腈溶液濃度的增加而上升，但I(xiàn)C50值也緩慢上升?？赡転榇罅康倪^氧化氫消耗TCPO導(dǎo)致活性中間體的產(chǎn)生緩慢，這與2.4.1現(xiàn)象一致。故最終確定過氧化脲乙腈溶液濃度為1 mol/L。

圖8 過氧化脲乙腈溶液濃度對icCLEIA的影響
Fig.8 Effect of different concentration of CH4N2O·H2O2
on icCLEIA

2.5 icCLEIA的標(biāo)準(zhǔn)工作曲線

標(biāo)準(zhǔn)曲線如圖9所示，其線性回歸方程為C=100.03RLU/RLUmax-1.28，R2=0.995 5。經(jīng)計(jì)算得該方法檢測的線性范圍為0.05～6.08 ng/mL，IC50為0.55 ng/mL，LOD為0.01 ng/mL。

圖9 icCLEIA標(biāo)準(zhǔn)工作曲線
Fig.9 Standard curve of icCLEIA

2.6 準(zhǔn)確度和精密度

采用確定的工作參數(shù)對加標(biāo)樣品進(jìn)行檢測，每個(gè)添加水平做3次重復(fù)，每次做7個(gè)重復(fù)孔。結(jié)果如表1所示，葡萄干和葡萄汁樣品的平均回收率分別為84.55%～91.36%和73.32%～87.64%。以批內(nèi)變異系數(shù)和批間變異系數(shù)衡量該方法的精密度，選取6個(gè)不同批次，檢測不同OTA標(biāo)準(zhǔn)品孔的RLU值，同批次同濃度做6個(gè)重復(fù)孔。結(jié)果顯示平均批內(nèi)和批間變異系數(shù)分別為4.40%和7.37%，均小于10%，表明該方法的精密度較好。

表1 葡萄干、葡萄汁樣品添加回收試驗(yàn)Table 1 Recovery test of OTA added to differentsamples by icCLEIA

2.7 特異性

按照icCLEIA操作程序，繪制AFB1、DON、T-2、PAT、ZEN以及TA等毒素在濃度為0.01～100 ng/mL范圍內(nèi)的競爭抑制曲線。結(jié)果顯示，IC50均大于100 ng/mL，除了OTA以外的真菌毒素均未產(chǎn)生競爭抑制現(xiàn)象，經(jīng)式(3)計(jì)算OTA與其他真菌毒素的交叉反應(yīng)率均小于1%。說明該icCLEIA方法能特異性檢測OTA，其他毒素對OTA檢測的干擾程度很小。

2.8 icCLEIA與GB 5009.96—2016方法對比

分別用HPLC和icCLEIA 2種方法檢測相同加標(biāo)水平的加標(biāo)樣品，以HPLC檢測結(jié)果為橫坐標(biāo)(x)，icCLEIA檢測結(jié)果為縱坐標(biāo)(y)做相關(guān)性分析，結(jié)果如表2。

表2 兩種方法的相關(guān)性分析Table 2 Correlation analysis of the two methods

說明icCLEIA與HPLC方法具有良好的一致性，進(jìn)一步證明icCLEIA方法的準(zhǔn)確度。

3 結(jié)論

本研究采用具有更高發(fā)光強(qiáng)度的草酸酯化學(xué)發(fā)光體系提高OTA化學(xué)發(fā)光免疫檢測法的靈敏度，建立了基于TCPO-H2O2-PHPPA Dimer化學(xué)發(fā)光體系的icCLEIA法檢測葡萄制品中的OTA含量。在最佳工作條件下，該方法的線性回歸方程為C=100.03RLU/RLUmax-1.28，線性范圍為0.05～6.08 ng/mL，IC50為0.55 ng/mL，LOD為0.01 ng/mL。葡萄干和葡萄汁的平均加標(biāo)回收率分別為84.55%～91.36%和73.32%～87.64%。該方法的平均批內(nèi)和批間變異系數(shù)均小于10%，有較好的精密度。將此法與HPLC方法進(jìn)行相關(guān)性分析，結(jié)果表明icCLEIA與HPLC具有良好的一致性，進(jìn)一步證明icCLEIA方法的準(zhǔn)確度良好。傳統(tǒng)酶聯(lián)免疫方法的OD值在2.0左右，Luminol-H2O2-HRP發(fā)光體系的發(fā)光信號通常在5個(gè)量級，而本法的發(fā)光信號最高可達(dá)7個(gè)量級，發(fā)光信號強(qiáng)度大且發(fā)光時(shí)間長，檢測效果更靈敏，適用于痕量分析。該發(fā)光體系的成功構(gòu)建和應(yīng)用為研究OTA毒素限量標(biāo)準(zhǔn)、OTA污染水平檢測及風(fēng)險(xiǎn)分析提供依據(jù)和檢測技術(shù)支持。