吳佳佳，王思齊，戴志遠(yuǎn)*

1(浙江工商大學(xué) 海洋食品研究院，浙江 杭州，310012) 2(中國(guó)計(jì)量大學(xué) 生命科學(xué)學(xué)院，浙江 杭州，310018)

全球大部分海產(chǎn)品消費(fèi)引發(fā)的中毒事件中，組胺中毒事件占據(jù)較高比例且發(fā)生較為頻繁[1-2]。低劑量的組胺不對(duì)人體造成傷害，但當(dāng)機(jī)體攝入超過(guò)100 mg時(shí)，即可引起過(guò)敏性食物中毒，急重患者出現(xiàn)暈厥、血壓降低，重癥可致死亡[3]。金槍魚(yú)、鯖科魚(yú)等富含組氨酸的青皮紅肉魚(yú)類組胺超標(biāo)事件最為頻發(fā)，此外，魚(yú)醬、魚(yú)肉腸、咸魚(yú)等發(fā)酵水產(chǎn)品也極易富集組胺。因此，世界各國(guó)都對(duì)水產(chǎn)品中的組胺制定了嚴(yán)格的限量標(biāo)準(zhǔn)[4]。

食品中組胺的積累來(lái)自于細(xì)菌分泌氨基酸脫羧酶對(duì)食品基質(zhì)中組氨酸的降解。水產(chǎn)品中含量豐富蛋白質(zhì)降解生成的多肽、氨基酸則為組胺生成菌的活動(dòng)提供了前體物質(zhì)，而魚(yú)體攜帶的革蘭氏陰性菌嗜溫腸道菌、海洋微生物則是主要的組胺生成菌[5]。研究表明，分離自水產(chǎn)品的摩氏摩根菌(Morganellamorganii)、產(chǎn)氣腸桿菌(Enterobacteraerogenes)、植生拉烏爾菌(Raoultellaplanticola)和發(fā)光桿菌(Photobacteriumdamselae)、蜂房哈夫尼菌(Hafniaalvei)、弗氏檸檬酸桿菌(Citrobacterfreundi)、溶藻弧菌(Vibrioalginolyticus)、大腸桿菌(Escherichiacoli)等細(xì)菌發(fā)酵液均有含量較高的組胺檢出，部分菌株發(fā)酵液組胺積累量高于1 000 μg/mL[6]。與此同時(shí)，發(fā)酵肉制品和水產(chǎn)品當(dāng)中，乳酸菌(lactic acid bacteria)、凝固酶陰性的葡萄球菌(coagulase-negative staphylococci，CNS)等發(fā)酵微生物中也存在相當(dāng)數(shù)量的組胺生成菌[7]。腌魚(yú)產(chǎn)品生產(chǎn)多數(shù)伴隨著微生物大量繁殖，因而腌魚(yú)產(chǎn)品中存在更大的生物胺超標(biāo)風(fēng)險(xiǎn)。KORAL等調(diào)查了來(lái)自土耳其和歐洲國(guó)家的78個(gè)咸魚(yú)產(chǎn)品中生物胺含量，結(jié)果表明大約10%的樣品超過(guò)FDA和EU(歐洲聯(lián)盟)規(guī)定的組胺水平[8]。MOHAMED等研究發(fā)現(xiàn)在埃及腌魚(yú)貯存過(guò)程中，其生物胺總體含量從最初的84 mg/kg上升到了1 633 mg/kg[9]。

咸鰳魚(yú)又名三抱鰳魚(yú)、鰳鲞，是流行于舟山、寧波、紹興、杭州、蕭山等浙東地區(qū)的傳統(tǒng)腌魚(yú)制品。傳統(tǒng)咸鰳魚(yú)加工是以新鮮的鰳魚(yú)為原料，不去除魚(yú)鱗、魚(yú)鰓及內(nèi)臟，經(jīng)3次加鹽腌制而成。自然發(fā)酵的水產(chǎn)品因其風(fēng)味獨(dú)特而備受消費(fèi)者青睞，其獨(dú)特的風(fēng)味與原料、工藝以及來(lái)自生產(chǎn)原料及環(huán)境的繁雜微生物群系息息相關(guān)。然而，在發(fā)酵微生物大量繁殖的同時(shí)，腐敗菌、致病菌及產(chǎn)組胺菌也會(huì)隨之滋生，進(jìn)而降低其食用安全性[11]。本研究以傳統(tǒng)工藝腌制咸鰳魚(yú)為研究對(duì)象，對(duì)其腌制過(guò)程中產(chǎn)組胺菌進(jìn)行分離鑒定，從基因水平檢測(cè)了其組氨酸脫羧酶攜帶情況，初步評(píng)估了其代謝過(guò)程中積累組胺的能力。研究結(jié)果將為科學(xué)評(píng)價(jià)自然發(fā)酵咸鰳魚(yú)發(fā)酵微生物的安全性、篩選安全的生產(chǎn)菌株提供一定的理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

組胺生成菌分離瓊脂(histamine-forming bacteria isolation agar, HBI)[11](g/L)：L-組氨酸18.5、蛋白胨5.0、酵母浸粉5.0、NaCl 5.0、CaCO31.0、溴甲酚紫0.06，瓊脂20，pH值5.3±0.2。

胰蛋白胨大豆肉湯(TSB)培養(yǎng)基(北京陸橋技術(shù)股份有限公司)，用于組胺產(chǎn)生菌的培養(yǎng)。

TSBH培養(yǎng)基(g/L)：TSB 38，L-組氨酸20；用于組胺菌的擴(kuò)大培養(yǎng)及組胺的生成。

細(xì)菌基因組提取試劑盒(北京莊盟國(guó)際生物基因科技有限公司)；組胺標(biāo)準(zhǔn)品(Sigma-Aldrich，美國(guó))；丹磺酰氯(上海生工生物技術(shù)服務(wù)有限公司)；乙腈(色譜純)、甲醇(色譜純)等其他試劑：國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司，均為分析純。

1.2 主要儀器

壓力滅菌鍋，上海三申醫(yī)療器械有限公司；超凈工作臺(tái)，蘇州凈化設(shè)備有限公司；恒溫培養(yǎng)箱，上海博訊實(shí)業(yè)有限公司；離心機(jī)，Eppendorf 5417R；電泳系統(tǒng)，Tanon EPS600；凝膠呈像系統(tǒng)，Tanon 3500；高速PCR儀，美國(guó)賽默飛世爾公司；Milli-Q Reference超純水系統(tǒng)，美國(guó)Millipore公司；C18色譜柱，Agilent，4.6 mm×150 mm，5 μm；高效液相色譜儀，waters 2695；PDA檢測(cè)器，waters 2996。

1.3 方法

1.3.1 咸鰳魚(yú)腌制及樣品采集

鰳魚(yú)腌制：冰鮮鰳魚(yú)，購(gòu)于舟山。腌制方法參考ZHANG[10]，新鮮鰳魚(yú)流水沖洗干凈，不去內(nèi)臟、魚(yú)鱗及魚(yú)鰓，分別于腌制第0、5、30天加入魚(yú)體重10%、20%、20%的食鹽進(jìn)行鰳魚(yú)腌制。

樣品采集：分別在0(鮮魚(yú))、1、6、11、41天取魚(yú)，每個(gè)時(shí)間段樣品采集3尾。無(wú)菌條件下，采鰳魚(yú)背部和腹部魚(yú)肉，剪碎后將同一時(shí)期3尾魚(yú)魚(yú)肉混勻。

1.3.2 菌株篩選及鑒定

稱取25 g魚(yú)肉樣品至含125 mL生理鹽水的錐形瓶中，振蕩混勻后制備梯度稀釋液，稀釋液涂布于HBI培養(yǎng)基平板，30 ℃培養(yǎng)72 h，挑選使培養(yǎng)基變成紫色的菌落，進(jìn)行2次劃線分離純化。純化后的菌株接種于TSB中，30 ℃培養(yǎng)48 h后，制備30%甘油菌液，-80 ℃凍藏備用。

取TSB肉湯活化好的菌液2 mL，按照試劑盒說(shuō)明書(shū)操作，提取菌株基因組DNA。參考袁開(kāi)等[12]方法，對(duì)分離菌株16S rDNA序列進(jìn)行擴(kuò)增，擴(kuò)增產(chǎn)物測(cè)序工作由南京金斯瑞生物科技有限公司完成，基因序列于GenBank中進(jìn)行BLAST比對(duì)，并采用MEGA 4.0軟件構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)。

1.3.3 產(chǎn)生物胺基因的克隆及序列分析

以分離菌株基因組DNA為模板，采用JAW等[3]設(shè)計(jì)的引物和PCR程序?qū)M氨酸脫羧酶(histidine decarboxylase gene，hdc)基因進(jìn)行擴(kuò)增，預(yù)期片段大小1 383 bp。

UNI-L：5′-AGAGTTTGATCATGGCTCAG-3′，

UNI-R：5′-GTGTGACGGGCGGTGTGTAC-3′

PCR擴(kuò)增體系為25 μL體系：10×PCR Buffer(Mg2+plus) 2.5 μL、2.5 mmol/L dNTP mixture 2 μL、10 μmol/L上下游引物各1 μL、DNA模板1 μL、5 U/μLTaq酶0.2 μL、加無(wú)菌去離子水補(bǔ)至25 μL。

PCR程序：94 ℃預(yù)變性4 min；94 ℃變性30 s，在55 ℃下復(fù)性30 s，72 ℃延伸1 min，總計(jì)35個(gè)循環(huán)；最終72 ℃延伸7 min。

取PCR產(chǎn)物2 μL，1.5%的瓊脂糖凝膠電泳20 min后于凝膠呈相系統(tǒng)下檢測(cè)。

1.3.4 發(fā)酵液組胺含量分析

活化后的菌種在600 nm條件下調(diào)整其吸光值為1.0，量取50 μL菌液接種于5 mL TSBH培養(yǎng)基中，30 ℃培養(yǎng)48 h后，取3 mL菌液，8 000 r/min下離心10 min，取上清液2 mL，參考JEONG等[7]方法進(jìn)行衍生化處理進(jìn)行液相色譜檢測(cè)，經(jīng)PDA檢測(cè)器采集數(shù)據(jù)。同時(shí)，分別配制10、20、40、80、160、320、640 μg/mL組胺鹽酸鹽標(biāo)準(zhǔn)溶液，按上述衍生方法及色譜條件進(jìn)行測(cè)定將組胺鹽酸鹽標(biāo)準(zhǔn)品濃度和對(duì)應(yīng)的峰面積數(shù)值利用Origin(V6.0)軟件進(jìn)行線性擬合，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。依據(jù)標(biāo)準(zhǔn)品擬合的線性方程y=14.734x+2.2725，R2=0.999 8，計(jì)算分離菌株發(fā)酵液中組胺含量[7]。發(fā)酵液中組胺含量測(cè)定結(jié)果用Origin(V6.0)軟件、根據(jù)格拉布斯準(zhǔn)則剔除異常數(shù)據(jù)后，根據(jù)擬合方程求出組胺含量。

2 結(jié)果與分析

2.1 產(chǎn)組胺菌的篩選及鑒定

參考楊健等[14]的方法，將5個(gè)腌制時(shí)期(0、1、6、11和41 d)的鰳魚(yú)樣品稀釋液涂布于HBI平板，30 ℃培養(yǎng)72 h。產(chǎn)組胺微生物能夠降解培養(yǎng)基中的組氨酸生成組胺，組胺的積累導(dǎo)致環(huán)境pH值升高進(jìn)而使培養(yǎng)基中的溴甲酚紫指示劑變色，如圖1。通過(guò)肉眼觀察菌落，判定使平板變?yōu)樗{(lán)紫色的菌株為產(chǎn)組胺陽(yáng)性菌，每個(gè)樣品的篩選平板中隨機(jī)挑選10株疑似陽(yáng)性菌，合計(jì)50株菌，經(jīng)2次劃線純化后得到32株可培養(yǎng)菌株。

圖1 產(chǎn)組胺表型陰性菌與陽(yáng)性菌
Fig.1 Non-histamine producing isolate and histamine
producing isolates

分離菌株的16S rDNA測(cè)序信息提交至GeneBank，Blast比對(duì)結(jié)果顯示分離菌株序列與已知菌株同源性均達(dá)99%，部分序列提交至GeneBank獲取登錄號(hào)，MH491949～MH491966。鑒定結(jié)果顯示，共分離到3個(gè)屬8個(gè)不同種的細(xì)菌，見(jiàn)表1。除了鮮魚(yú)樣品(0 d)檢出枯草芽孢桿菌(Bacillussubtilis)和糞嗜冷桿菌(Psychrobacterfaecalis)外，1、6、11、31 d腌魚(yú)樣品分離菌株均為葡萄球菌(Staphylococcusspp.)，葡萄球菌屬細(xì)菌共計(jì)29株，占分離菌株的90.63%，推測(cè)其為腌魚(yú)中產(chǎn)組胺的優(yōu)勢(shì)菌屬。腐生葡萄球菌(S.saprophyticus)是咸鰳魚(yú)中數(shù)量最多的疑似產(chǎn)組胺菌，研究顯示，腐生葡萄球菌也是許多自然發(fā)酵肉制品中的優(yōu)勢(shì)固有菌[15]。

表1 產(chǎn)組胺菌16S rDNA測(cè)序結(jié)果Table 1 Sequencing and identification results of the histamine producing isolates

注：黑體標(biāo)注菌株未檢出hdc基因，下劃線標(biāo)注菌株發(fā)酵液中未檢測(cè)出組胺。

盡管研究證實(shí)具備腐生葡萄球菌較高SOD和過(guò)氧化氫酶活性，在肉制品發(fā)酵和后熟過(guò)程中能夠有效抑制脂肪氧化異味的產(chǎn)生，但因其與表皮葡萄球菌(S.epidermidis)、科氏葡萄球菌(S.cohnii)在臨床上均被列為條件致病菌，所以發(fā)酵肉制品生產(chǎn)中不建議使用該菌種[16]。馬胃葡萄球菌(S.equorum)是自然發(fā)酵魚(yú)肉制品中固有優(yōu)勢(shì)菌的主要成員之一，發(fā)酵過(guò)程中水解脂肪、蛋白質(zhì)，進(jìn)而促進(jìn)產(chǎn)品風(fēng)味的形成，其中一些菌株也被開(kāi)發(fā)為商品化發(fā)酵劑[17]。尼泊爾葡萄球菌(S.nepalensis)和松鼠葡萄球菌(S.sciuri)也是許多自然發(fā)酵水產(chǎn)品中分離到的菌種，前者用作日本魚(yú)醬生產(chǎn)時(shí)能夠有效改善產(chǎn)品的風(fēng)味[18]。

基于葡萄球菌分離菌株的16S rDNA信息，以NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)中已有的相應(yīng)模式菌株序列做參照，同時(shí)，以與葡萄球菌屬親緣關(guān)系較近的溶酪大球菌(Macrococcuscaseolyticus)作為外圍參照，采用Mega 6.0軟件、選擇Neighbor-Joining法構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)，見(jiàn)圖2。分離菌株均與模式菌株能夠較好地聚為一群，外圍參照菌株獨(dú)立為一群。

圖2 葡萄球菌分離菌株基于16S rDNA序列的進(jìn)化樹(shù)
Fig.2 Phylogenetic tree of the staphylococci based on
16S rDNA gene

2.2 hdc基因擴(kuò)增及部分測(cè)序結(jié)果

圖3為分離菌株hdc基因PCR擴(kuò)增結(jié)果，32株分離菌株中，24株(占分離菌株的75%)擴(kuò)增出長(zhǎng)度1 380 bp左右的hdc基因片段，與預(yù)期目標(biāo)條帶大小一致。共8株分離菌株未檢測(cè)到hdc基因，其中包括5株腐生葡萄球菌、2株松鼠葡萄球菌和1株馬胃葡萄球菌，見(jiàn)表1。隸屬于同一個(gè)種的分離菌株攜帶hdc基因情況存在較大差異。

1-3: 1-5、1-6、1-9；4-7: 2-1、2-3、2-4、2-5；8-12: 3-2、3-3、3-8、3-9、3-10；13-20: 4-1、4-2、4-4、4-5、4-6、4-7、4-8、4-10；21-24: 5-3、5-4、5-5、5-6；M-DL-2000 DNA ladder圖3 分離菌株hdc基因擴(kuò)增子結(jié)果電泳圖Fig.3 Electrophoresis results of hdc amplicons

2.3 分離菌株發(fā)酵液組胺含量測(cè)定結(jié)果

采用高效液相色譜法對(duì)分離菌株發(fā)酵液中組胺含量進(jìn)行了測(cè)定，結(jié)果顯示，23株分離菌株的發(fā)酵液中均測(cè)出了不同濃度的組胺含量，產(chǎn)組胺菌發(fā)酵液組胺平均含量達(dá)38.10 μg/mL。產(chǎn)組胺量超過(guò)40 μg/mL的菌株共10株，其中4株發(fā)酵液組胺含量超過(guò)了50 μg/mL。腐生葡萄球菌分離菌株3-8發(fā)酵液中組胺濃度高達(dá)100.21 μg/mL，是分離菌株中組胺積累能力最強(qiáng)的菌株(圖4)。

圖4 產(chǎn)組胺菌株發(fā)酵液中組胺含量
Fig.4 Average histamine production of the isolates

結(jié)合基因檢測(cè)結(jié)果分析，19株(59.3%)攜帶產(chǎn)生物胺基因的分離菌株其發(fā)酵液組胺檢測(cè)結(jié)果為陽(yáng)性，其基因型和表型相一致，涵蓋了除表皮葡萄球菌、枯草芽孢桿菌以外所有種屬的多數(shù)分離菌株。4株分離菌株既未攜帶組胺脫羧酶基因，其發(fā)酵液也未檢出組胺。然而，在初篩過(guò)程中，上述菌株均能使HBI平板變色，推測(cè)其能代謝產(chǎn)生組胺以外的堿性物質(zhì)。5株分離菌株攜帶產(chǎn)組胺基因但其發(fā)酵液中卻未檢出組胺。4株腐生葡萄球菌分離菌株(3-6、5-1、5-7、5-8)未擴(kuò)增出組氨酸脫羧酶基因，但其發(fā)酵液中卻存在組胺的積累，推測(cè)該菌株的組胺脫羧酶基因可能位于細(xì)菌質(zhì)粒DNA中。本研究以細(xì)菌基因組DNA為模板進(jìn)行hdc基因擴(kuò)增，遺漏了可能存在于質(zhì)粒DNA當(dāng)中的hdc基因。

3 討論

HBI培養(yǎng)基是由美國(guó)學(xué)者NIVEN等研制產(chǎn)組胺菌的篩選培養(yǎng)基，最早用來(lái)篩選和分離產(chǎn)組胺細(xì)菌，但后續(xù)研究發(fā)現(xiàn)，HBI培養(yǎng)基也可篩選出其他生物胺產(chǎn)生菌，因此，篩選出來(lái)的菌株中可能不僅存在產(chǎn)組胺菌，還存在其他的生物胺產(chǎn)生菌[19-20]。本研究中，從HBI平板上篩選的陽(yáng)性菌株中，23株分離菌株發(fā)酵液中有組胺檢出，其中，19株分離菌株產(chǎn)組胺的基因型和發(fā)酵液組胺積累表型一致；4株分離菌株既未檢出hdc基因，其發(fā)酵液中也未檢出組胺。因而，后續(xù)研究中，需要對(duì)HBI分離菌株產(chǎn)酪胺、尸胺、腐胺、苯乙胺等其他種類生物胺的能力進(jìn)行更加全面的評(píng)估。

與人工接種發(fā)酵劑、工業(yè)化生產(chǎn)的肉制品相比較，沿襲傳統(tǒng)工藝、手工制作的自然發(fā)酵魚(yú)肉制品更具獨(dú)特的風(fēng)味品質(zhì)[15]。然而，自然發(fā)酵肉類發(fā)酵菌株通常會(huì)存在某些安全隱患，諸如雜菌滋生、產(chǎn)生物胺微生物滋生或病原微生物滋生等。本研究從不同腌制階段咸鰳魚(yú)中分離到32株產(chǎn)組胺細(xì)菌，盡管其中優(yōu)勢(shì)葡萄球菌屬菌株大多是自然發(fā)酵水產(chǎn)品的固有菌，但其產(chǎn)組胺潛在危害卻應(yīng)引起重視。23株分離菌株發(fā)酵液檢出組胺，其平均含量達(dá)38.10 μg/mL，1株腐生葡萄球菌發(fā)酵液組胺積累量高達(dá)100.21 μg/mL。

盡管許多凝固酶陰性的葡萄球菌如木糖葡萄球菌、馬胃葡萄球菌、琥珀葡萄球菌(S.succinus)已被廣泛應(yīng)用于發(fā)酵肉制品生產(chǎn)[10]，然而，由于編碼氨基酸脫羧酶基因的質(zhì)粒不穩(wěn)定，微生物的氨基酸脫羧酶的種類和效力差異很大。本研究分離到的3株馬胃葡萄球菌中，2株既攜帶hdc基因，同時(shí)其發(fā)酵液組胺含量也均超過(guò)了40 μg/mL。因此，微生物產(chǎn)生生物胺的能力是菌株特異性而非種屬特異性[21]。由此可見(jiàn)，抑制發(fā)酵過(guò)程中腐敗菌滋生的同時(shí)，準(zhǔn)確掌握發(fā)酵微生物的遺傳背景信息，篩選不產(chǎn)生物胺的發(fā)酵菌株應(yīng)用于生產(chǎn)，或通過(guò)控制生產(chǎn)條件抑制產(chǎn)生物胺微生物的活動(dòng)，對(duì)有效降低腌魚(yú)產(chǎn)品中生物胺含量、保障腌魚(yú)產(chǎn)品食用安全具有重要現(xiàn)實(shí)意義。