譯校│顧小雪 劉林青 翟新驗（中國動物疫病預防控制中心）

4 蛋殼大腸菌群的細菌學培養(yǎng)程序（細菌學檢查程序1～3見本刊2019年3期）

在采集和實驗過程中避免樣品污染環(huán)境，所采取的預防措施以及樣品收集后的正確處理都是至關重要的。參與蛋殼培養(yǎng)的每位檢驗員都必須接受相關授權實驗室提供的必要的衛(wèi)生程序、抽樣程序和樣品處理方面的指導。國家官方機構將保留一份記錄，表明該檢驗員已接收過必要的指導。

（a）樣品選擇。每次采樣時，從每個雞群中隨機抽取三個裝有消毒雞蛋雞籠頂層的四十枚雞蛋。

（b）拭子處理程序。將拭子用授權實驗室提供的無菌乳糖肉湯或其他適當的液體培養(yǎng)基潤濕后，擦拭每枚雞蛋大頭直徑為2.5厘米的圓形區(qū)域。每個拭子擦拭五個雞蛋，每四個拭子裝在一個由授權實驗室提供的無菌、加蓋的試管中。

（1）從含有四個拭子和乳糖肉湯或其他適當培養(yǎng)基的管中，轉移1毫升到含有10毫升乳糖的發(fā)酵管中。

（2）37℃孵育48小時。在孵育24和48小時后，如酸和氣體的產量為10%或更多，則推測可能存在大腸菌群。

5 確定衛(wèi)生監(jiān)督計劃現狀和有效性的程序

以下監(jiān)控程序可以依據國家官方機構的要求：

（a）監(jiān)控衛(wèi)生程序的有效性。

（1）定期對糞便污染的裝箱雞蛋的表面進行細菌培養(yǎng)。

（2）定期對每個繁殖群中死于殼內的雞蛋樣品進行大腸菌群的培養(yǎng)。這樣的蛋也應當進行沙門氏菌的培養(yǎng)。 沙門氏菌培養(yǎng)期間應包括下列步驟：（i）每1000毫升預增菌肉湯中添加35毫克硫酸亞鐵，以阻斷卵轉鐵蛋白對沙門氏菌的抑制作用；（ii）四硫酸鹽選擇性增菌液、控制競爭者平板培養(yǎng)基（XLT4、BGN等）延遲了二次增菌程序以及菌落檢測。

6 用于支原體細菌學檢查的實驗室推薦程序

（a）鼻竇、氣管、氣囊、鼻竇、鼻道、呼吸道滲出液，滑膜液、雞蛋（包括蛋黃、卵黃囊、膜和尿囊液）應采用無菌拭子。無菌技術非常重要，因為某些微生物可能不會被本方法中使用的抗菌藥物所抑制。上述部位有時會產生大量組織懸浮液，輸卵管和泄殖腔偶爾也有。組織應在10倍于其體積的支原體培養(yǎng)基（MBM）中研磨或混合充分，參見本部分（f）段。為了更好地分離支原體，提交參考實驗室的樣品應為：活禽、冷凍新鮮組織和裝有干冰的組織標本。

（b）將拭子、金屬環(huán)或0.1毫升組織懸浮液接種至5～10毫升MBM。當觀察到生長跡象（肉湯的pH或濁度降低）時，根據需要轉移每份肉湯培養(yǎng)物以維持原始分離菌。37℃孵育至少21天，再作為陰性結果進行丟棄。 當初次觀察到生長跡象或在培養(yǎng)后第4天或第5天仍不見生長時，將肉湯培養(yǎng)基接種到支原體瓊脂培養(yǎng)基（MAM）中，參見本部分（g）段。幾個培養(yǎng)物可通過金屬環(huán)或棉簽接種在一個平皿上。在高濕度培養(yǎng)箱內， 37℃培養(yǎng)3～5天。最好加入5%的二氧化碳或使用點蠟燭的廣口瓶。中央凸起的小的圓形半透明菌落極有可能是支原體。建議使用間接照明和低功率或解剖顯微鏡來觀察菌落，因為它們的直徑很少超過0.2～0.3毫米。

（c）分離株必須分型。

（1）如果運輸時間少于2～3天，則分離株可以通過含有冰袋的MBM進行運輸。如果運輸時間更長，則需要用干冰凍結MBM，或在室溫下運輸MAM斜面。分離株在運輸前必須有生長跡象。

（2）分離株可在-20℃ MBM中保存2～3周，或在-68℃保存數年。

（d）替代培養(yǎng)方法：一種覆蓋增菌培養(yǎng)方法，適用于挑剔和敏感的支原體，特別適用于火雞支原體。

（1）將2～3毫升MAM倒入試管中，傾斜試管，直到形成斜面（約45度）。 其他容器也可使用。

（2）采用足夠的MBM覆蓋斜面，以便使培養(yǎng)基（包括接種物）覆蓋瓊脂斜面。

（3）按本部分（b）段所述的方式對培養(yǎng)物進行孵育。

（4）按本部分（b）段所述的方式對覆蓋物進行孵育和檢驗。

（e）培養(yǎng)基的制備。

（1）應使用適用于細胞培養(yǎng)的去離子蒸餾水。

（2）所有的玻璃器皿均應采用無殘留洗滌劑（如Alcojet）仔細洗滌，并用自來水中沖洗三次，然后在去離子蒸餾水中漂洗兩次。

（3）添加10%的乙酸鉈溶液至終濃度約1∶4000；但是，高度污染的標本可能需要達到1∶2000的終濃度。除（e）（4）段所述的情況以外，應先將乙酸鉈加入去離子蒸餾水中，以防止蛋白質沉淀。

（4）如果使用高壓滅菌器，則應先將支原體肉湯基質、葡萄糖、酚紅和半胱氨酸鹽酸鹽加入到去離子蒸餾水中。

再將高壓滅菌培養(yǎng)基冷卻至45℃或更低后，先加入乙酸鉈，再無菌加入其余組分。

（5）采用無菌去離子蒸餾水配制青霉素。

（6）無菌血清加熱至56℃滅活30分鐘。豬血清可用于分離雞毒支原體、滑液囊支原體、雞霉形體和火雞支原體；而馬血清建議用于分離火雞支原體。

（7）制備1%酚紅溶液。

（8）制備1%NAD（β-煙酰胺腺嘌呤二核苷酸或輔酶I）溶液。

（9）制備1%溶液的半胱氨酸鹽酸鹽，用于減少滑液囊支原體生長的NAD。

（10）在 MAM 中使用純化的瓊脂產品，如諾布爾（特殊瓊脂）。

（11）用0.1M氫氧化鈉調節(jié)pH。

（12）滅菌可以通過兩種方法完成：（i）推薦方法是通過0.20微米濾膜進行過濾除菌，必須使用無菌技術；（ii）如條件適宜，當按照本節(jié)（e）（4）段所述的步驟進行時，則可以使用高壓滅菌器滅菌，120℃、15磅壓力（103kPa）15分鐘。

（13）培養(yǎng)火雞支原體和雞霉形體時，可忽略酚紅、葡萄糖和NAD。

（14）當從被污染的樣品中分離培養(yǎng)火雞支原體時，應在MBM中加入100單位/毫升的多黏菌素B。

（f）支原體肉湯培養(yǎng)基（Frey）制備方式。在 850～880 毫升去離子蒸餾水中加入：乙酸鉈2.5毫升（1∶4000）；可能受到污染的樣品5毫升（1∶2000）；支原體肉湯基22.5克；水性青霉素500000單位；無菌血清120～150毫升；酚紅2.5毫升；NAD12.5毫升；半胱氨酸鹽酸鹽12.5毫升；葡萄糖1.0～1.5克；調節(jié)pH至7.8 過濾除菌。肉湯可在4℃保存2周，或者在-40℃保存更長時間。

（g）支原體瓊脂培養(yǎng)基（Frey）制備方式如下：在850～880毫升去離子蒸餾水中加入：支原體肉湯培養(yǎng)基22.5克；調節(jié)pH至7.8 ；純化瓊脂12.0克；高壓滅菌后在45℃水浴中冷卻，乙酸鉈2.0毫升（1∶4000）；45℃無菌血清150毫升；水性青霉素400000單位；NAD12.5毫升；半胱氨酸鹽酸鹽12.5毫升。

（1）輕輕轉動燒瓶，將約15毫升培養(yǎng)基倒入每個平皿中。

（2）在37℃培養(yǎng)箱中堆疊培養(yǎng)皿，最多堆疊2～3個，培養(yǎng)2小時，以除去多余的水分。

（3）將倒置的平皿密封捆扎包裝，4℃儲存不超過15天。

（h）應監(jiān)測新的組分或培養(yǎng)基批次，以補償由于純度濃度、制劑等的變化而導致的制劑變化。新舊培養(yǎng)基都應針對單個培養(yǎng)物進行給定數量的系列滴定。培養(yǎng)基應根據菌落生長情況、大小和菌落數來進行比較。

7 通過體內生物試驗（濃縮）評估支原體檢測程序

該程序已被證明，在合適的條件下其靈敏度足以檢測少于100個支原體。本部分將對適當條件加以規(guī)定。

（a）獲取至少3周齡且不含雞毒支原體、 滑液囊支原體和火雞支原體的雞或火雞（試驗禽），并且以能防止其被任何禽類疾病感染的方式加以運輸。

（1）將試驗禽飼養(yǎng)在經有效清潔和消毒的區(qū)域內。

（2）該區(qū)域應與其他禽類或動物隔離。

（3）照顧試驗禽的人員應采取必要的預防措施，以防止其他來源傳染性禽病的傳播。

（b）用于接種污染組織的試驗禽在血清板凝集試驗中應呈現陰性。

（1）接種后的試驗禽類在整個實驗期間均必須與非接種的對照組禽類進行隔離。

（c）應從至少四只疑似供體禽中以無菌方式采集氣管、鼻甲和鼻竇黏膜、肺和竇滲出液、子宮頸、胸部和腹部氣囊組織（包括病變部位）以及部分輸卵管和滑膜液。 在無菌裝置中，加入四倍組織體積的支原肉湯培養(yǎng)基（Frey），將其與組織混合充分。 可從組織池中制得懸浮液。將所制備的懸浮液在30分鐘內接種試驗禽。

（1）每個懸浮液池至少通過腹部氣囊和眶下竇接種四只試驗禽，每個部位最多接種0.5毫升接種物。

（2）在35天中，應每7天采血一次，以鑒定血清轉化酶。

（3）35天時，應當對試驗禽進行剖殺，并進行細菌學分離和支原體鑒定。應當特別注意接種部位由支原體損傷引起的典型大體或微觀病變。特別應注意典型的總體或微觀支原體病變的接種部位。

（d）當出現以下情況時，供體禽被認為受到感染：

（1）當檢測供體禽時無論血凝抑制檢測結果如何，試驗禽支原體血清平板抗體陽性，且對照禽保持血清學陰性。

（2）試驗禽分離到支原體，供體禽支原體血清學陽性，對照禽血清學和細菌分離培養(yǎng)陰性。

（e）實驗室檢查結果可以通過以下方式驗證：對患病禽材料直接進行培養(yǎng)或從疑似禽群接種血清陰性的禽，并將血清學檢測結果與來自試驗禽的結果進行比較。

8 對淘汰的雛雞和雛火雞進行沙門氏菌細菌學檢查的實驗室推薦程序

本部分所述的實驗室程序推薦用于下列淘汰禽的沙門氏菌細菌學檢查：蛋雞、肉雞、水禽、觀賞禽和野禽中的雛雞，以及火雞群中的雛火雞。

（a）對于淘汰雛雞，從未安置在育雛房的25只中隨機選擇1～5日齡的雛雞，按如下方式制備5份器官池、5份卵黃池和5份腸組織池。對于雛火雞，從孵出后10天內死亡的10只雛火雞樣本中，按如下方式制備器官池、蛋黃池和腸組織池。

（1）器官池：從五只雛雞或兩只雛火雞中分別取1～2克，心、肺、肝、脾組織樣品，充分混合并碾碎。雛雞還應包括法氏囊的底壁組織。

（2）卵黃池：從五只雛雞或兩只雛火雞中分別取1～2克未被吸收的卵黃囊樣品，充分混合并碾碎。如果卵黃囊基本上不存在的話，則取整個卵黃囊蒂的殘余部分。

（3）腸組織池：從五只雛雞或兩只雛火雞中分別取0.5平方厘米的嗉囊壁和5毫米長的十二指腸、盲腸和回盲連接部，充分混合并碾碎。

（b）以1份組織池與10份肉湯的比例將每個池轉移到四硫酸鹽選擇性培養(yǎng)基（Hajna 或 Mueller-Kauffmann）中。

（c）對于淘汰雛雞，以5只雞為一組重復本部分（a）和（b）段的步驟，直到所有25只雞都完成檢查，共產生15個池（5份器官、5份卵黃和5份腸組織）。對于雛火雞，以2只為一組重復本部分（a）和（b）段的步驟，直到所有雛火雞都接受了檢查。

（d）對四硫酸鹽液進行孵育。將器官和卵黃池37℃孵育24小時，腸組織池在41.5℃孵育。在孵育24和48小時后分別進行檢查。按照描述確認疑似菌落。對所有沙門氏菌陰性的四硫酸鹽肉湯進行進一步培養(yǎng)。也可以使用菌落轉移試驗，作為對可疑菌落三糖鐵和賴氨酸鐵瓊脂篩選物的補充。