蘇 舒，唐剛?cè)A，聶大紅，熊 鸚，馬 慧，林麗萍，元龔駿，向賢宏

（中山大學(xué)附屬第一醫(yī)院影像醫(yī)學(xué)與核醫(yī)學(xué)科，廣東廣州 510080）

肝纖維化是各種慢性炎癥刺激導(dǎo)致的常見病理結(jié)果，其主要病理變化為肝星狀細(xì)胞（hepatic stellate cell，HSC）活化，并誘導(dǎo)過量細(xì)胞外基質(zhì)（extracellular matrix，ECM）在肝血竇區(qū)和肝細(xì)胞周圍積聚，逐漸形成纖維瘢痕［1］。肝纖維化持續(xù)受到炎癥因子刺激將導(dǎo)致肝硬化、肝細(xì)胞癌等終末期肝病。一般而言，肝纖維化可以逆轉(zhuǎn)，而肝硬化目前除了針對病因治療或肝移植之外，沒有可用于肝硬化的有效治療措施［2］，因此，有必要建立靈敏度和特異性高的診斷方法用于檢測肝纖維化疾病嚴(yán)重程度和評估抗纖維化療效。目前臨床上用于肝纖維化診斷所采用的病理學(xué)和影像學(xué)檢查方法主要是肝組織活檢［3］和超聲彈性成像［4］、MRI彈性成像［5］，但以上診斷方法均有不足和缺陷。近年來，正電子發(fā)射斷層掃描（positron emission tomography，PET）已被廣泛應(yīng)用于評估傳染性、炎癥性和退行性疾?。?-7］。其中18F-FDG是目前臨床上最常使用的放射性示蹤劑，在腫瘤、炎癥等代謝活性高的疾病組織中會出現(xiàn)特異性濃聚及高攝取現(xiàn)象。在一項評估肝臟脂肪變性疾病對肝臟代謝活性影響的研究中，Bural等［8］報道了彌漫性肝臟脂肪變性患者具有更大的肝臟平均SUV值和肝臟最大SUV值及更大的肝臟代謝體積，作者認(rèn)為與彌漫性肝脂肪變性有關(guān)的活動性炎癥可能是導(dǎo)致這些患者肝臟代謝活動增加的一個可能原因，肝纖維化疾病的主要病理特征是炎癥，參與肝臟炎癥進程的炎癥細(xì)胞包括庫否細(xì)胞，浸潤性巨噬細(xì)胞，T淋巴細(xì)胞，嗜中性粒細(xì)胞和樹突細(xì)胞等［9］。已有多項研究證明，18F-FDG作為非特異性示蹤劑，已經(jīng)發(fā)現(xiàn)其可在感染部位和炎癥部位累積［10］。以上結(jié)果為本實驗提供了啟示：探究18FFDG PET/CT顯像用于無創(chuàng)診斷慢性炎癥刺激引起的肝纖維化的可行性。本實驗研究旨在通過觀察并分析模型動物肝纖維化病灶處18F-FDG濃聚情況與肝組織纖維化病理變化的關(guān)系，探討18FFDG PET/CT顯像是否可無創(chuàng)應(yīng)用于肝纖維化的顯像診斷，為肝纖維化疾病進展程度和抗纖維化療效評估提供有效檢測手段。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 試劑及設(shè)備18F-FDG由中山大學(xué)附屬第一醫(yī)院核醫(yī)學(xué)科提供，2%戊巴比妥鈉、酒精、注射器購置于武漢谷歌生物科技有限公司，羥脯氨酸含量測試盒購置于Abcam公司，硫代乙酰胺（thioacetamide，TAA，98%）購置于Sigma-Aldrich公司，小動物PET/CT顯像儀器（Siemens，Knoxville，TN）購置于Siemens公司。

1.1.2 實驗動物 成年SD雄性大鼠（SPF級），體質(zhì)量為160～180 g，由中山大學(xué)實驗動物中心東校區(qū)提供［SYXK（粵）2016-0112］。

1.2 方法

1.2.1 大鼠肝纖維化模型的建立及分組 成年雄性SD大鼠在SPF級環(huán)境下飼養(yǎng)，其飼養(yǎng)在25℃室內(nèi)溫度及12 h明/暗周期更替的環(huán)境中并可自由獲得標(biāo)準(zhǔn)飼料和飲用水。動物研究實驗方案符合中山大學(xué)動物倫理委員會的相關(guān)倫理規(guī)定并通過委員會批準(zhǔn)。12只大鼠隨機分為模型組（TAA）和對照組（CTL），每組6只。模型組給予每周兩次腹腔注射4%硫代乙酰胺200 mg/kg，持續(xù)時間為6周；對照組大鼠每周兩次腹腔注射等量的滅菌生理鹽水，持續(xù)時間為6周。

1.2.218F-FDG PET/CT顯像 腹腔注射6周后，所有大鼠在進行顯像前均需禁食至少6 h。兩組大鼠以2%戊巴比妥鈉腹腔注射麻醉后經(jīng)尾靜脈注入18F-FDG生理鹽水溶解液（37 MBq/kg，1 mCi/kg）。尾靜脈注射1 h后將大鼠仰臥位置于小動物PET/CT顯像儀器進行PET/CT掃描，掃描時間為25 min，包括10 min CT掃描及15 min PET掃描。觀察兩組大鼠肝組織的18F-FDG攝取情況和測量肝臟纖維化區(qū)域18F-FDG攝取值（%ID/g）。

1.2.3 解剖形態(tài)學(xué)、HE染色、Masson染色和羥脯氨酸含量測定 經(jīng)18F-FDG PET/CT顯像后，兩組大鼠經(jīng)2%戊巴比妥鈉過量麻醉后頸椎脫臼處死，解剖大鼠打開腹腔暴露肝區(qū)，觀察模型組和對照組肝臟解剖形態(tài)學(xué)。大鼠經(jīng)生理鹽水灌注取材后分離出肝臟組織，取肝臟左葉組織樣本經(jīng)40 g/L多聚甲醛溶液固定，石蠟包埋，制成4 μm切片，行HE染色用于常規(guī)組織病理學(xué)檢查及Masson染色用于評估纖維化程度。顯微鏡下觀察兩組大鼠肝臟組織病理組織學(xué)情況和纖維、膠原增生情況。另取肝臟右葉組織樣本用于肝組織羥脯氨酸含量測定，測定方法按照試劑盒的說明進行。肝臟組織羥脯氨酸濃度與膠原蛋白密切相關(guān)，測量其含量可作為肝纖維化嚴(yán)重程度的指標(biāo)［11］。

1.3 統(tǒng)計學(xué)分析

實驗所有數(shù)據(jù)采用Graphpad Prism 6軟件進行統(tǒng)計分析，計量資料均采用平均值±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示。兩個獨立樣本比較采用Student-t檢驗。當(dāng)P＜0.05時，認(rèn)為兩組樣本的差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 大鼠肝臟纖維化的18F-FDGPET/CT顯像結(jié)果

觀察并分析18F-FDG PET/CT顯像圖，CT圖結(jié)果顯示低分辨CT不能鑒別對照組及模型組大鼠肝臟密度差異。PET與CT融合圖結(jié)果顯示對照組大鼠肝臟組織未見明顯放射性濃聚；模型組大鼠肝臟處可見較高的放射性濃聚（圖1）。模型組肝臟組織感興趣區(qū)18F-FDG的攝取值明顯高于對照組［（0.481± 0.010）vs（0.238 ± 0.007）%ID/g，t=20.46，P＜0.001；圖2］。

圖2 兩組大鼠肝組織的18F-FDG攝取值比較Fig.2 18F-FDG uptake of liver tissues in control and TAA group

圖1 兩組大鼠肝組織的18F-FDG PET/CT顯像圖Fig.1 18F-FDG PET/CT images of liver tissues in control and model group

圖3 兩組大鼠6周后肝組織的解剖形態(tài)學(xué)改變Fig.3 Anatomical morphological changes of liver tissues in control and TAA-induced rats

圖4 兩組大鼠6周后肝組織的病理組織學(xué)變化及膠原沉積情況Fig.4 Pathological changes and collagen deposition of liver tissues in control and TAA-induced rats

2.2 解剖形態(tài)學(xué)改變、病理組織學(xué)變化和羥脯氨酸含量檢測

在18F-FDG PET/CT顯像結(jié)束后，兩組大鼠經(jīng)解剖暴露肝區(qū)，對照組肝臟大小及比例正常，肝臟表面光滑平整，邊緣銳利；模型組大鼠肝臟表面則粗糙不均，呈微小細(xì)顆粒觀（圖3）。對照組大鼠肝組織鏡下HE染色及Masson染色切片觀察結(jié)構(gòu)正常，無明顯病理變化。模型組大鼠肝組織HE染色顯示肝組織結(jié)構(gòu)紊亂，肝血竇區(qū)和肝細(xì)胞周圍中性粒細(xì)胞募集；Masson染色結(jié)果顯示大鼠肝組織內(nèi)纖維增生，膠原纖維伸入肝細(xì)胞和肝血竇區(qū)（圖4）。檢測兩組大鼠肝組織的羥脯氨酸含量用以評估肝組織內(nèi)纖維增生和膠原沉積情況。結(jié)果顯示模型組大鼠肝組織羥脯氨酸含量明顯高于對照組［（3.507± 0.144）vs（0.317± 0.053）mg/L，t=20.74，P＜0.001；圖5］。

2.3 肝組織18F-FDG攝取值與纖維化程度的關(guān)系

造模6周后，模型組肝細(xì)胞周圍和肝血竇區(qū)可見明顯的纖維增生和膠原沉積。與病理結(jié)果顯示一致，兩組大鼠顯像圖在相同的放射性本底值處理下，模型組肝組織纖維化區(qū)18F-FDG可見較高濃聚，且18F-FDG攝取量明顯高于對照組。數(shù)據(jù)分析結(jié)果顯示，模型組18F-FDG攝取值與羥脯氨酸含量具有密切相關(guān)性（R2=0.9321，P=0.0018；圖6）。

3 討論

圖5 兩組大鼠肝組織中羥脯氨酸含量的測定Fig.5 Hydroxyproline content of liver in two groups

圖6 肝組織18F-FDG攝取值與羥脯氨酸含量的相關(guān)性分析Fig.6 Correlation between18F-FDG uptake and hydroxyproline content in liver tissues

肝纖維化是各種慢性肝病進展中由于肝內(nèi)細(xì)胞外基質(zhì)合成與降解失衡，致使過多的膠原在肝內(nèi)沉積，并逐漸形成纖維性瘢痕，常伴有炎癥并可進展為肝硬化甚至肝癌［1，12］。肝硬化是全球肝病相關(guān)發(fā)病率和死亡率的主要原因，慢性肝病在我國是常見病、多發(fā)病，在中國約3億人受肝病困擾［13］。因此非侵入性、準(zhǔn)確的診斷方法對于診斷早期肝纖維化疾病，監(jiān)測肝纖維化疾病進展和評估抗纖維化治療療效具有重要意義。目前，肝組織活檢是臨床肝纖維化診斷和分期的金標(biāo)準(zhǔn)［3］。抗纖維化藥物的所有臨床試驗都需要肝活檢來評估治療前后的纖維化病情分期。但由于活檢的侵入性、抽樣隨機性、高價格等性質(zhì)對臨床試驗設(shè)計施加了若干限制［14］。超聲瞬時彈性成像和磁共振彈性成像可應(yīng)用于測量與纖維化相關(guān)的肝硬度檢查。這兩種檢查方法能可靠地診斷中度和重度纖維化，但在早期纖維化時期，具有腹水或病態(tài)肥胖的患者中測試性能較低［15］。與超聲瞬時彈性成像和磁共振彈性成像相比，18F-FDG PET/CT顯像技術(shù)能夠分析評估局部及整體肝臟的功能代謝情況并提供準(zhǔn)確的解剖定位信息，應(yīng)用于無創(chuàng)診斷早期肝纖維化疾病并監(jiān)測纖維化活動度具備一定可行性。近年來研究表明，18F-FDG PET/CT顯像診斷肝脂肪變性疾病具有一定的特異性，肝脂肪變性患者肝病灶處呈現(xiàn)明顯的18F-FDG放射性濃聚［16］。炎癥因子介導(dǎo)、炎性細(xì)胞浸潤等炎癥反應(yīng)的參與在肝纖維化形成的機制中起到重要作用［17］。在存在肝臟炎癥的情況下，由于炎性細(xì)胞中不可逆的18F-FDG積聚，肝臟18F-FDG攝取可增加，這表明18F-FDG PET/CT也可作為肝纖維化的潛在成像方法。

本實驗結(jié)果顯示，兩組大鼠進行18F-FDG PET/CT顯像后，對照組大鼠肝組織無異常放射性濃聚，呈低攝取顯像；模型組大鼠肝組織內(nèi)可見18F-FDG放射性濃聚增高。解剖兩組大鼠發(fā)現(xiàn)兩組大鼠解剖形態(tài)學(xué)可見差異，模型組觀察到肝臟表面粗糙不均呈細(xì)顆粒感，邊界不均勻；對照組肝臟大小及比例正常，表面光滑平整。為了確定肝組織18F-FDG的攝取水平是否和肝纖維化疾病具備相關(guān)性，本實驗研究對兩組大鼠肝組織進行病理檢查和羥脯氨酸含量測定。病理結(jié)果表現(xiàn)為模型組大鼠HE染色顯示組織病理學(xué)改變即肝臟正常結(jié)構(gòu)破壞，肝小葉結(jié)構(gòu)紊亂，中性粒細(xì)胞在肝細(xì)胞周圍及肝血竇區(qū)大量募集；Masson染色顯示模型組大鼠肝細(xì)胞及肝血竇周圍大量纖維間隔包繞，出現(xiàn)明顯的纖維增生、膠原沉積等表現(xiàn)；對照組大鼠肝組織結(jié)構(gòu)無明顯異常，也未見纖維、膠原沉積。模型組大鼠肝組織內(nèi)羥脯氨酸含量明顯增高，進一步證實模型組肝組織內(nèi)纖維化活動明顯。從實驗獲得的顯像數(shù)據(jù)和病理數(shù)據(jù)分析，肝纖維化18F-FDG濃聚情況與肝組織纖維化病理改變結(jié)果表現(xiàn)出一致性，肝臟18F-FDG攝取值與肝組織纖維化程度相關(guān)，證實了18F-FDG PET/CT顯像在肝纖維化的診斷具有一定的特異性。

綜上，本實驗研究通過模型組大鼠肝纖維化疾病進展時肝臟組織18F-FDG攝取增加，表明18FFDG PET/CT技術(shù)有可能發(fā)展為無創(chuàng)診斷肝纖維化的潛在成像方法，并應(yīng)用于監(jiān)測肝纖維化疾病進展及評估抗纖維化療效。