李 翔，劉 星，何 濤，周躍平，魏 毓，黃河浪

（南昌大學(xué)江西省預(yù)防醫(yī)學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，江西南昌330006）

隨著人民生活水平提高、健康狀況改善以及人口老齡化的加劇，社會(huì)各界對(duì)老年問題的關(guān)注度日益提高。女性扮演的社會(huì)角色相較男性更為復(fù)雜，易受社會(huì)和家庭等多方面的影響，其衰老征象也較明顯。迄今為止，尚少見單一性別人群的端粒長(zhǎng)度與衰老程度的研究報(bào)道。國內(nèi)有學(xué)者［1］以108份健康人外周血為研究樣本，采用SB法檢測(cè)其端粒限制性長(zhǎng)度，發(fā)現(xiàn)大多數(shù)年齡組女性端粒限制性片段（telomere restriction fragment，TRF）值大于男性；Lapham等［2］通過對(duì)“成人健康和衰老隊(duì)列的遺傳流行病學(xué)研究”隊(duì)列中10萬名研究對(duì)象的唾液端粒進(jìn)行測(cè)量，結(jié)果顯示50歲以上女性端粒較男性長(zhǎng)，而50歲以下男女之間端粒長(zhǎng)度無差異。男性和女性端粒長(zhǎng)度差異的Meta分析發(fā)現(xiàn)［3］，包括隊(duì)列研究在內(nèi)的36項(xiàng)研究（共36 230人），僅使用DNA印跡法（Southern Blot，SB）測(cè)量的結(jié)果顯示女性端粒長(zhǎng)度較男性長(zhǎng)，而使用其他測(cè)量方法得到的男性和女性端粒長(zhǎng)度未表現(xiàn)差異。諸多研究表明，女性較男性更適合作為端粒檢測(cè)對(duì)象［4-7］。到目前為止，“端粒學(xué)說”仍存在爭(zhēng)議且對(duì)其的研究并未停止。就老年人與青年人而言，其細(xì)胞端粒長(zhǎng)度有明顯縮短，從分子生物學(xué)等微觀研究角度出發(fā)，無論是適宜性和可行性上都無法將成果直接用于衡量人的衰老程度?；诖吮尘?，本研究旨在女性衰老度測(cè)量和端粒長(zhǎng)度的關(guān)系進(jìn)行探討，為分子生物學(xué)研究提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 研究對(duì)象的納入和排除標(biāo)準(zhǔn)

納入標(biāo)準(zhǔn)：① 20歲及以上女性居民（健康判斷參照WHO標(biāo)準(zhǔn)［8］，并結(jié)合健康檔案和現(xiàn)場(chǎng)調(diào)查確定無明顯器質(zhì)性病變、無意識(shí)和心理障礙及其它疾病史者）；② ≥60歲者參照2013年中華醫(yī)學(xué)會(huì)老年醫(yī)學(xué)分會(huì)制定的5條我國健康老年人標(biāo)準(zhǔn)［9］；③ 愿意合作并能提供所需信息者。排除標(biāo)準(zhǔn)：①不愿意參與調(diào)查及采血樣者；②嚴(yán)重疾病患者，無法完成全程調(diào)查項(xiàng)目者。

1.2 樣本含量

從南昌市區(qū)多家三甲醫(yī)院和部分社區(qū)衛(wèi)生服務(wù)中心健康體檢人群中按年齡分層隨機(jī)抽取20歲以上者作為研究對(duì)象。在參照Corsuch做法［10］及國家自然科學(xué)基金要求，年齡劃分采用“九段法”。結(jié)合不同年齡段健康人群的衰老狀況和分布特點(diǎn)［11-12］，以9個(gè)年齡段計(jì)，每個(gè)年齡段女性平均不少于40人?？紤]失訪和不依從等因素，增加10%的人數(shù)（396人）。本次研究實(shí)際采集血樣521份，有效血樣406份，其相應(yīng)的有效問卷406份。

1.3 研究方法與內(nèi)容

研究方法：①對(duì)納入者采用年齡分層分層隨機(jī)抽樣的方式進(jìn)行問卷調(diào)查及衰老情況檢測(cè)，以師生組合的調(diào)查小組匯同社區(qū)衛(wèi)生服務(wù)中心有關(guān)工作人員統(tǒng)一要求、統(tǒng)一時(shí)間、統(tǒng)一行動(dòng)進(jìn)行問卷調(diào)查，答題時(shí)調(diào)查員不可提供任何暗示性語言，被調(diào)查者之間不可相互討論。調(diào)查人員負(fù)責(zé)回收問卷，同時(shí)觀察調(diào)查問卷填寫的完整性，但不觀看填寫內(nèi)容，以保證問卷的回收率和可信度，然后進(jìn)行數(shù)據(jù)編碼。在獲得調(diào)查對(duì)象同意后抽取3～5 mL外周血進(jìn)行端粒檢測(cè)，并通過南昌大學(xué)第二附屬醫(yī)院醫(yī)學(xué)研究倫理委員會(huì)批準(zhǔn)；②端粒檢測(cè)主要使用溶液鹽析法和實(shí)時(shí)熒光定量PCR法，進(jìn)行DNA提取、擴(kuò)增和檢測(cè)；③采用課題組研制并通過國家級(jí)學(xué)會(huì)認(rèn)證的《生理-心理-社會(huì)學(xué)三維人體衰老度測(cè)試量表》［13-14］，該量表由3個(gè)維度、10個(gè)方面、55個(gè)條目組成。內(nèi)部信度Cronbach α系數(shù)=0.909，總重測(cè)信度系數(shù)=0.871（P＜0.001），內(nèi)容效度指數(shù)=0.836。量表?xiàng)l目測(cè)量，正向條目采用正向計(jì)分法，反向條目采用反向計(jì)分法，滿分為100分，初始分值×不同維度的權(quán)重分=標(biāo)準(zhǔn)化分值，然后將該分值通過課題組提供的百分位數(shù)法衰老度判斷分值表（工具表）對(duì)衰老作出判斷。內(nèi)容：①分析被測(cè)對(duì)象不同年齡段的端粒相對(duì)長(zhǎng)度改變的規(guī)律；②分析端粒長(zhǎng)度和衰老分值與年齡的相關(guān)性；③闡明端粒長(zhǎng)度和衰老度分值改變的相互關(guān)系，揭示女性快速衰老階段；④探索性提出不同年齡段女性抗衰老和延緩衰老的針對(duì)性措施。

1.4 統(tǒng)計(jì)分析

采用Epidata 3.1進(jìn)行數(shù)據(jù)錄入，將實(shí)驗(yàn)所得數(shù)據(jù)采用SPSS 17.0軟件統(tǒng)計(jì)分析，如方差分析、相關(guān)性分析和線性回歸等，運(yùn)用7500 Software v2.0.6進(jìn)行端粒長(zhǎng)度分析。

2 結(jié)果

2.1 端粒長(zhǎng)度檢測(cè)結(jié)果分析

采用Real-time PCR法［15-16］對(duì)所得DNA樣本進(jìn)行檢測(cè)，其結(jié)果分別見圖1和圖2，同一個(gè)樣品的3個(gè)復(fù)孔Ct值標(biāo)準(zhǔn)差均＜0.50，且Tel、Hbg的熔解曲線峰較細(xì)尖，重合較好，說明實(shí)驗(yàn)產(chǎn)物純凈，但因?qū)嶒?yàn)過程部分血樣被污染等影響，共收集406份合格血樣。

圖1 目的基因Tel的定量結(jié)果Fig.1 Quantitative results of target gene Tel

2.2 端粒相對(duì)長(zhǎng)度與年齡的關(guān)系

圖2 內(nèi)參基因Hbg的定量結(jié)果Fig.2 Quantitative results of internal reference gene Hbg

通過算數(shù)平均數(shù)得，不同年齡段女性端粒相對(duì)長(zhǎng)度各不相同，其平均端粒長(zhǎng)度為1.34±0.38。在各個(gè)年齡組中，平均端粒相對(duì)長(zhǎng)度最大值在20～歲段，為1.65±0.33，最小值在80～歲段，為0.93±0.28。從檢測(cè)結(jié)果發(fā)現(xiàn)，端粒相對(duì)長(zhǎng)度隨著年齡增加而逐漸縮短（表1）。經(jīng)單因素ANOVA分析顯示，各年齡組的端粒相對(duì)長(zhǎng)度的差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（F=35.56，P＜0.01）。在此基礎(chǔ)上進(jìn)行了端粒相對(duì)長(zhǎng)度與年齡的相關(guān)性分析，發(fā)現(xiàn)端粒相對(duì)長(zhǎng)度與年齡呈中高度負(fù)相關(guān)（r=-0.623，P＜0.001）。筆者以年齡（X）為橫坐標(biāo)，端粒相對(duì)長(zhǎng)度（Y）為縱坐標(biāo)，繪制散點(diǎn)圖并做出線性回歸分析，結(jié)果如圖3所示。所得回歸方程為：Y=-0.012X+1.984（R2=0.400），通過回歸系數(shù)檢驗(yàn)結(jié)果，可以看出女性健康人群外周血端粒相對(duì)長(zhǎng)度隨年齡的增大而逐漸縮短，且線性關(guān)系較好。

2.3 不同年齡被測(cè)人群的端粒長(zhǎng)度和衰老分值的關(guān)系

筆者以各年齡段分組為橫坐標(biāo)，端粒相對(duì)長(zhǎng)度的均值和三維度分值及衰老總分的均值為縱坐標(biāo)分別繪制曲線圖（圖4、圖5），發(fā)現(xiàn)不同年齡段女性健康人群的衰老總分和生理維度得分與端粒相對(duì)長(zhǎng)度均值的曲線圖變化趨勢(shì)有一定的契合性，即生理得分和衰老總分隨年齡增大而增大，相應(yīng)的端粒相對(duì)長(zhǎng)度隨年齡增大而逐漸縮短。在40～和60～歲段，端粒相對(duì)長(zhǎng)度曲線有明顯下降趨勢(shì)，表明在該年齡段女性端粒長(zhǎng)度縮短速度加快，其相應(yīng)的生理得分和衰老總分也有明顯上升趨勢(shì)，提示在40～、60～歲段女性人群衰老速度明顯加快，例如：30～歲組端粒相對(duì)長(zhǎng)度縮短比例（2.55%）明顯小于40～歲組（15.75%）。此外在50～歲段女性端粒相對(duì)長(zhǎng)度出現(xiàn)縮短趨勢(shì)明顯減緩的現(xiàn)象。通過Pearson雙側(cè)相關(guān)性分析，衰老總分和生理維度得分與端粒相對(duì)長(zhǎng)度呈負(fù)相關(guān)（r=-0.533，P＜0.001；r=-0.542，P＜0.001）。

表1 不同年齡段被測(cè)對(duì)象端粒相對(duì)長(zhǎng)度檢測(cè)結(jié)果Table 1 Detection results of telomere relative length in different age groups

圖3 不同年齡段端粒相對(duì)長(zhǎng)度-年齡回歸直線關(guān)系圖Fig.3 Relative length of telomere-age regression in different age groups

圖4 不同年齡段女性端粒相對(duì)長(zhǎng)度曲線圖Fig.4 curves of telomere relative length in different age groups

圖5 各年齡段女性健康人群衰老總分及三維度得分變化趨勢(shì)圖Fig.5 Aging score and three-dimension score of female healthy population in different age groups

3 討論

衰老本身是個(gè)復(fù)雜的過程，具有不確定性，人體衰老與老年慢性病的發(fā)生、發(fā)展有密切關(guān)系，了解衰老的生物學(xué)機(jī)制及其標(biāo)志物在某種程度上不僅有利于人體抗衰老活動(dòng)的開展，而且對(duì)降低老年病發(fā)生、提高生命質(zhì)量有著積極的現(xiàn)實(shí)意義。

3.1 關(guān)于端粒相對(duì)長(zhǎng)度與年齡的關(guān)系及快速衰老年齡段

本研究結(jié)果顯示端粒長(zhǎng)度改變與年齡呈中高度負(fù)相關(guān)（r=-0.623，P＜0.001），端粒長(zhǎng)度隨年齡增加而縮短，這與Nielsen等［17］的研究結(jié)果一致。端粒長(zhǎng)度改變?cè)凇熬哦问健蹦挲g劃分曲線中出現(xiàn)了兩段（40～歲段和60～歲段）較陡的曲線，提示40～和60～歲年齡段為女性快速衰老階段，這比較符合女性衰老的規(guī)律。女性在40～歲年齡段從生理因素上，由于更年期，雌二醇及生長(zhǎng)激素不斷下降，而從40歲起血清促性腺素等激素則明顯升高，內(nèi)分泌的急劇變化致使女性衰老征象較為明顯［18］。心理因素上，女性相較男性，面對(duì)負(fù)情緒事件感受性更強(qiáng)，更容易產(chǎn)生焦慮、抑郁等負(fù)面情緒［19］。社會(huì)因素上，如退休、社會(huì)或家庭角色的改變，造成一定心理負(fù)擔(dān)，這也會(huì)加速女性衰老進(jìn)程［20］。而在60～歲段，女性開始進(jìn)入老年期，身體各機(jī)能明顯衰減，進(jìn)而端粒長(zhǎng)度縮短速度加快，這也較符合劉冬巖等研究中女性的衰老進(jìn)程［12］，但在50～歲組，整體呈現(xiàn)一個(gè)平臺(tái)期，端粒長(zhǎng)度變化不明顯，可能與該年齡段生理層面上女性更年期結(jié)束，內(nèi)分泌調(diào)節(jié)趨于穩(wěn)定有關(guān)，在心理和社會(huì)層面，這與女性面臨退休、工作減輕和壓力減輕等有關(guān)。此外，75～歲組出現(xiàn)較明顯上升趨勢(shì)，這也比較符合WHO老中青劃分標(biāo)準(zhǔn)中75歲以上人群為老年人，其衰老速度加快，筆者認(rèn)為這也可能與女性依賴家庭感增強(qiáng)等有關(guān)?？傮w來說，結(jié)果比較理想。

3.2 關(guān)于不同年齡段女性衰老分值變化規(guī)律和衰老的關(guān)系

通過不同年齡段人群三維衰老總分曲線圖可知，各維度的得分呈現(xiàn)隨著年齡的增長(zhǎng)而逐漸升高的趨勢(shì)，在40～歲組和60～歲組的生理維度分值和衰老總分曲線有明顯上升趨勢(shì)，不難發(fā)現(xiàn)，衰老總分和生理得分均值在40～到50～歲組組間分值差距最大，分別為5.14分、4.19分；其次為60～到65～歲組組間分值。筆者認(rèn)為這提示生理維度和衰老分值與端粒相對(duì)長(zhǎng)度的改變有一定契合性，進(jìn)一步印證端粒相對(duì)長(zhǎng)度與衰老的關(guān)系。筆者也發(fā)現(xiàn)心理維度分值，在30～歲組和60～歲組有較明顯減緩的上升趨勢(shì)，中國文化中有“三十而立”的說法，女性在20歲到30歲開始步入社會(huì)，心理逐漸成熟；50歲到60歲的變化情況可能與退休，工作壓力減小，生活趨向穩(wěn)定有關(guān)，但社會(huì)維度分值在40～歲組有略低于周圍年齡組得分的現(xiàn)象，似乎說明40～歲組人群社會(huì)衰老程度反而較低，可能與工作和家庭生活已經(jīng)基本穩(wěn)定有關(guān)，出現(xiàn)這種情況有待進(jìn)一步探索。

3.3 端粒評(píng)判衰老存在的不足以及大規(guī)模人群端粒測(cè)量的必要性

目前人們對(duì)端粒的基本結(jié)構(gòu)和功能已經(jīng)有了諸多的了解［21］，端粒長(zhǎng)度在反映衰老程度這方面的優(yōu)勢(shì)已初見端倪，其可綜合反映端粒長(zhǎng)度的遺傳情況、修復(fù)能力、機(jī)體氧化應(yīng)激水平，甚至記錄機(jī)體細(xì)胞的整個(gè)生命歷程，但筆者認(rèn)為以端粒為衰老標(biāo)志物研究衰老、評(píng)判衰老還存在以下不足：其一，目前關(guān)于衰老評(píng)價(jià)尚未有統(tǒng)一標(biāo)準(zhǔn)，專家們從微觀角度提出多個(gè)衰老相關(guān)生物標(biāo)志物，端粒作為較成熟的生物標(biāo)志盡管有些爭(zhēng)議，但認(rèn)同度相對(duì)高，應(yīng)用其對(duì)衰老評(píng)判只能作為部分參考；其二，目前公認(rèn)的端粒檢測(cè)方法不止一種，不同檢測(cè)方法適用性合其優(yōu)缺點(diǎn)各異，因此，選擇合適研究的檢測(cè)方法顯得尤為重要；其三，隨著時(shí)序年齡的增長(zhǎng)，端?？s短存在于人體的所有體細(xì)胞中，選擇哪種體細(xì)胞作為端粒檢測(cè)標(biāo)本較易被研究對(duì)象接受并能較準(zhǔn)確反映其與年齡變化、性別差異的內(nèi)在聯(lián)系有待進(jìn)一步考慮。目前端粒研究主要集中在端粒改變、端粒酶活性與疾病的分子機(jī)制方面，從發(fā)展趨勢(shì)看，端粒程度改變能否更準(zhǔn)確地反映人體衰老，通過大規(guī)模人群流行病學(xué)研究是十分必要的，只有通過一定數(shù)量的重復(fù)，才能反映事物的普遍規(guī)律，獲得可靠的結(jié)果。就本文來看，仍存在些缺陷，除了年齡之外，其他因素比如飲食結(jié)構(gòu)、吸煙等或多或少會(huì)干預(yù)衰老的進(jìn)程進(jìn)一步影響端粒，故仍需進(jìn)一步進(jìn)行調(diào)查。