孫旭鴦， 陳 湧

(1浙江省麗水市中心醫(yī)院耳鼻喉科， 浙江 麗水 323000; 2岳陽市二人民醫(yī)院胃腸外科， 湖南 岳陽 414000)

鼻咽癌作為一種好發(fā)于鼻咽部咽隱窩和頂前壁黏膜上皮的惡性腫瘤，其病因和遺傳易感性、EB病毒及環(huán)境污染等因素密切相關。早期鼻咽癌缺乏典型臨床癥狀，同時鼻咽癌的血供極為豐富，早期就可能發(fā)生頸部淋巴結轉移或遠處轉移，從而導致鼻咽癌患者的預后較差。目前尚未鑒定出與鼻咽癌特異性較高的癌基因和抑癌基因，導致鼻咽癌發(fā)病機制仍不明確[1-2]。因此，尋找鼻咽癌特異性分子標志并從基因水平上抑制促癌基因的表達或者上調抑癌基因的表達，可能對鼻咽癌的發(fā)生發(fā)展起抑制作用。

Twist轉錄因子作為主要由胎盤和中胚層組織分泌的細胞因子，在胎兒時期呈高表達，出生后在正常組織中表達含量極低，其不僅在胚胎發(fā)育成熟過程中扮演著重要角色，同時在誘導細胞遷移和組織塑性過程中發(fā)揮重要作用[3-4]。在研究Twist與惡性腫瘤的關系中發(fā)現，Twist在鼻咽癌、食管癌、骨肉瘤、前列腺癌和結腸癌等惡性腫瘤組織中的表達較正常組織均明顯升高[5-7]；進一步分析Twist與惡性腫瘤生物學行為的關系中發(fā)現，Twist可通過調控細胞黏附因子、促血管生成因子和金屬基質蛋白酶等腫瘤相關因子的表達從而促進腫瘤細胞遷移、侵襲和脈管生成等過程，利于腫瘤發(fā)展和轉移。通過聚類分析和芯片雜交等技術研究胚胎干細胞發(fā)育與血管分化的關系中發(fā)現，Twist可能參與了血管內皮生長因子(vascular endothelial growth factor,VEGF)、ANG1、PDGF等基因的調控，從而在血管生成(angiogenesis)過程中發(fā)揮了重要調控作用[8]。既往研究已經表明Twist參與多種惡性腫瘤的惡性生物學行為，目前尚未有Twist與鼻咽癌細胞血管生成的研究見諸報道，為此，本研究通過RNA干擾技術特異性沉默Twist在鼻咽癌細胞中的表達，探討Twist對體外鼻咽癌細胞血管生成的影響及其可能作用機制，為鼻咽癌血管靶向治療提供新的臨床參考。

材 料 和 方 法

1 試劑和材料

DMEM高糖培養(yǎng)基、無血清Opti-MEMI培養(yǎng)基、胎牛血清和胰蛋白酶-EDTA消化液均購自Gibco；空載體pEGFP和Twist沉默載體pEGFP-siTwist購自北京合生基因科技有限公司；Lipofectamine 2000和TRIzol試劑購自Thermo；BCA蛋白濃度測定試劑盒購于中杉金橋生物技術有限公司；cDNA第一鏈合成試劑盒和RT Master Mix熒光定量PCR試劑盒購自TaKaRa；Twist和GAPDH的上、下游引物由上海英濰捷基公司合成；CCK-8試劑盒購自上海碧云天生物技術有限公司；Transwell小室購自Corning；Matrigel基質膠購自BD；抗Twist和β-actin抗體購自Abcam；抗p-JNK、JNK、ERK、p-ERK、p38、p-p38和VEGF抗體購自Epitomics；JNK通路抑制劑SP600125、ERK通路抑制劑PD98059和p38通路抑制劑SB203580購自Sigma。

2 細胞培養(yǎng)

人鼻咽癌細胞株CNE2和人臍靜脈血管內皮細胞(human umbilical vein endothelial cells,HUVECs)均購自中國科學院上海生命科學研究院細胞資源中心，細胞均使用含20%滅活胎牛血清的DMEM高糖培養(yǎng)基進行培養(yǎng)和傳代。細胞置于細胞培養(yǎng)箱中進行孵育，細胞培養(yǎng)箱調整溫度為37 ℃，二氧化碳濃度為5%，將細胞懸液接種于60 mL斜頸細胞培養(yǎng)瓶中，內盛10 mL完全培養(yǎng)基，內皮細胞生長方式為單層貼壁生長，細胞在細胞培養(yǎng)箱內生長3 d后即可生長至80%～90%瓶底面積，然后使用含EDTA胰酶進行消化，取對數生長期細胞用于實驗操作。

3 實驗方法

3.1細胞轉染 收集對數生長期的CNE2細胞，用完全培養(yǎng)基制成單細胞懸液，調整濃度為5×109/L，將細胞懸液接種至6孔板中，每孔100 μL，每組設3個復孔，將細胞分為TwistsiRNA+Lipofectamine 2000組(siTwist組)、陰性對照(negative control, NC)+Lipofectamine 2000組(NC組)和空白對照(blank control, BC)組，按照轉染試劑Lipofectamine 2000說明書進行操作。

3.2Western blot法檢測蛋白表達 CNE2細胞提取蛋白后經按BCA蛋白濃度測定試劑盒說明書提取總蛋白，每份樣品使用20 μg蛋白質，使用10% SDS-PAGE后轉移至硝酸纖維素膜上，在4 ℃下使用5%脫脂奶粉封閉過夜，硝酸纖維素膜經I抗和II抗反應后滴加新鮮配置的ECL化學發(fā)光液顯色、曝光和顯影。

3.3Real-time PCR檢測Twist mRNA的表達 CNE2細胞經TRIzol作用后提取細胞總 RNA，利用紫外分光光度儀檢測稀釋好的RNA標本的吸光度(A)值，設定波長為260 nm和280 nm，計算A260/A280比值為1.8～2.1之間。按照逆轉錄反應試劑盒說明書實施逆轉錄合成cDNA，按real-time PCR說明書配制反應體系，反應條件為： 50 ℃ 2 min； 95 ℃ 2 min； 95 ℃ 20 s、58 ℃ 30 s、72 ℃ 20 s、80 ℃ 15 s，讀板后重復44個循環(huán)。以GAPDH為內參照。Twist上游引物為5’-GGAGTCCGCAGTCTTACGAG-3’，下游引物為 5’-TCTGGAGGACCTGGTAGAGG-3’；GAPDH上游引物為5’-GAAGGTGAAGGTCGGAGTC-3’，下游引物為5’-GAAGATGGTGATGGGATTTC-3’。依照標準曲線中繪制的各個樣本的拷貝數，以測定的Twist表達量與GAPDH表達量的比值作為基準來校準表達量，實驗重復3次，取平均值。

3.4收集鼻咽癌細胞條件培養(yǎng)基(conditioned medium, CM) 將CNE2細胞接種于75 cm2培養(yǎng)瓶中，加入適量完全培養(yǎng)基，待細胞生長至80%底面積時用移液器吸去原培養(yǎng)基，用PBS緩沖液反復沖洗4次，再加入不含血清的DMEM培養(yǎng)基20 mL，放置細胞培養(yǎng)箱孵育12 h后收集上清液，以2 500 rpm速度下常溫離心5 min，將上清液用0.22 μm過濾器過濾后，保存于4 ℃冰箱中。

3.5HUVECs與CM共培養(yǎng) 將HUVECs接種于6孔培養(yǎng)瓶中，加入含20% FBS的DMEM培養(yǎng)基，待細胞生長至80%底面積時用移液器吸去原培養(yǎng)基，用PBS緩沖液反復沖洗2次，加入CM培養(yǎng)24 h。

3.6CCK-8法檢測細胞活力 將HUVECs接種于25 cm2培養(yǎng)瓶中，加入適量完全培養(yǎng)基，待細胞生長至80%底面積時用胰酶消化并收集對數生長期細胞，用含20% FBS的DMEM培養(yǎng)基制成單細胞懸液，并調整濃度為5×107/L，將細胞懸液接種至96孔板中，每孔100 μL，每組設5個復孔，將96孔板置于細胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)72 h，在結束前1 h將10 μL的CCK-8溶液加入96孔板中，放入細胞培養(yǎng)箱繼續(xù)培養(yǎng)1 h后立即用酶標儀檢測各孔A值，設定波長為490 nm，同時設空白調零組(不加細胞僅加等量培養(yǎng)基)。

3.7Transwell小室侵襲實驗 將Matrigel均勻鋪被到Transwell上室底部，待Matrigel完全凝固后，小心取出上室中殘余液體，再加入50 μL無血清DMEM培養(yǎng)基。調整HUVECs濃度1×108/L，將200 μL細胞懸液加入Transwell上室中，同時在Transwell下室中添加500 μL含20%胎牛血清的細胞培養(yǎng)基，然后將Transwell小室放置于細胞培養(yǎng)箱中繼續(xù)孵育24 h，實驗重復3次，每組設5個復孔。將放置培養(yǎng)箱中孵育24 h的Transwell小室取出，去除上室及下室中的培養(yǎng)基，用棉棒小心擦去小室底膜上的細胞，將Transwell上室放置在10%甲醇溶液中固定20 min，用PBS液清洗3遍后再用結晶紫溶液染色15 min。將Transwell上室自結晶紫溶液中取出后，使用PBS溶液清洗3遍，將Transwell上室置于載物片上，放置于倒置顯微鏡下觀察并拍照，在高倍鏡下隨機選擇10個視野拍照并采集圖像。

3.8小管形成實驗 將不含胎牛血清的培養(yǎng)基和Matrigel放置4℃冰箱過夜預冷，待其變成膠凍狀，以1∶2的比例混合培養(yǎng)基和Matrigel，將250 μL稀釋后的Matrigel加入24孔板中，再放入細胞培養(yǎng)箱中孵育1 h，至Matrigel凝固。調整HUVECs濃度為2×105/L，將0.1 mL細胞懸液接種于預先鋪好基質膠的24孔板中，再放置細胞培養(yǎng)箱中孵育過夜，最后在倒置顯微鏡下觀察小管形成狀況，利用ImageJ 1.51f軟件對管腔樣結構的數量進行定量分析[9]。

3.9JNK、ERK和p38信號通路抑制劑對HUVECs小管形成的影響 實驗設置NC組、siTwist組、siTwist+SP600125組、siTwist+PD98059組和siTwist+SB203580組，NC組和siTwist組CNE2細胞添加PBS作用2 h，后3組分別用10 μmol/L的JNK通路抑制劑SP600125、ERK通路抑制劑PD98059和p38通路抑制劑SB203580作用CNE2細胞2 h，提取各組細胞CM，按照3.8方法檢測HUVECs小管形成，實驗重復3次，取平均值。

4 統(tǒng)計學處理

采用SPSS 16.0統(tǒng)計分析軟件進行統(tǒng)計學分析，所有本次實驗所得的計量數據均以均數±標準差(mean±SD)表示，率的比較用卡方檢驗，采用SNK-q法分析總體及總體中兩樣本均數之間差異，以P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

結 果

1 Real-time PCR和Western blot檢測Twist siRNA的干擾效率

將空載體和Twist沉默載體轉染鼻咽癌CNE2細胞48 h后，提取各組CNE2細胞總RNA進行real-time PCR以檢測Twist mRNA的相對表達量，NC組和BC組CNE2細胞中Twist mRNA相對表達量為0.84±0.07和0.87±0.08，與siTwist組(0.17±0.02)相比較顯著升高(P<0.01)，而NC組和BC組之間相比較無統(tǒng)計學差異。Western blot檢測Twist蛋白在siTwist組CNE2細胞中的相對表達量為2.32±0.16，與僅轉染空載體的CNE2細胞(6.51±0.52)和BC組細胞(6.94±0.65)相比較顯著降低(P<0.01)，NC組和BC組之間相比較無統(tǒng)計學差異，見圖1。

2 沉默Twist基因對HUVECs體外活力的影響

為評估干擾Twist在鼻咽癌細胞中的表達后對體外HUVECs活力的影響，分別提取NC組、BC組和siTwist組CNE2細胞CM，通過CCK-8法對HUVECs活力進行檢測，結果表明，HUVECs經siTwist組CNE2細胞所提取的CM作用24 h后，A值為0.53±0.13，而HUVECs經NC組和BC組CNE2細胞所提取的CM作用24 h后A值分別為1.49±0.35和1.37±0.24，siTwist組與NC組和BC組相比較顯著降低(P<0.01)，表明沉默Twist在鼻咽癌細胞中的表達可顯著抑制HUVECs活力。

Figure 1.Knockdown ofTwistwas analyzed by Western blot assay. Mean±SD.n=3.**P<0.01vssiTwist group.

圖1Westernblot檢測Twist蛋白在CNE2細胞中的表達水平

3 干擾Twist基因的鼻咽癌細胞CM對體外HUVECs侵襲能力的影響

在體外CNE2細胞中分別轉染siTwist和空載體后，提取各組細胞CM，HUVECs經CM作用24 h后進行Transwell小室侵襲實驗。細胞侵襲實驗結果表明，HUVECs經siTwist組CNE2細胞所提取的CM作用24 h后侵襲出Matrigel的細胞數較NC組和BC組顯著降低(P<0.01)，見圖2。

4 干擾Twist基因的鼻咽癌細胞CM對體外HUVECs小管形成的影響

利用小管形成實驗檢驗干擾Twist基因的鼻咽癌細胞CM對體外HUVECs的體外血管生成能力，結果顯示，HUVECs在體外Matrigel基質環(huán)境中生長12 h后，細胞逐漸向兩端延長呈梭形，同時細胞延長端開始在Matrigel膠中伸展，相鄰細胞開始出現聯接并出現管腔樣結構。HUVECs經siTwist組CNE2細胞所提取的CM作用24 h后體外小管形成數較NC組和BC組顯著降低(P<0.01)，見圖3。

Figure 2.The effect ofTwistsilencing on the invasive ability of HUVECsinvitro(×200). Mean±SD.n=3.**P<0.01vssiTwist group.

圖2Transwell小室實驗檢測沉默Twist對HUVECs侵襲能力的影響

Figure 3.The effect ofTwistsilencing on the tube formation of HUVECsinvitro(×200). Mean±SD.n=3.**P<0.01vssiTwist group.

圖3小管形成實驗觀察沉默Twist對HUVECs小管形成的影響

5 Twist對CNE2細胞中p-ERK、p-p38、p-JNK和VEGF表達的影響

分別轉染空載體和siTwist至CNE2細胞后，通過Western blot檢測p-ERK、p-p38、p-JNK和VEGF在鼻咽癌CNE2細胞中的表達，結果顯示，siTwist組CNE2細胞的ERK磷酸化水平明顯高于NC組和BC組，而VEGF蛋白水平明顯低于NC組和BC組(P<0.01)；下調Twist在CNE2細胞中的表達對p-p38和p-JNK的表達無明顯影響，見圖4。

Figure 4.The protein levels of p-ERK, p-p38, p-JNK and VEGF were assessed by Western blot analysis in the CNE2 cells after transfected with negative control (NC), blank control (BC) and siTwist. Mean±SD.n=3.**P<0.01vssiTwist group.

圖4Westernblot檢測轉染siTwist對CNE2細胞中p-ERK、p-p38、p-JNK和VEGF表達的影響

6 ERK、JNK和p38信號通路抑制劑對HUVECs體外小管形成的影響

NC組、siTwist組、siTwist+PD98059組、siTwist+SP600125組和siTwist+SB203580組CNE2細胞所提取CM作用HUVECs后，HUVECs體外小管形成數分別為48.3±4.2、22.7±3.6、39.1±4.7、25.6±3.3和27.5±2.8。與NC組相比，siTwist組HUVECs體外小管形成數顯著減少(P<0.01)；與siTwist組相比，siTwist+PD98059組顯著升高(P<0.05)；而siTwist組與siTwist+SP600125組或siTwist+SB203580組相比較，差異無統(tǒng)計學意義，見圖5。

討 論

Twist作為定位于人類7號染色體的基因，編碼由202個氨基酸組成的Twist蛋白。Twist蛋白屬于堿性螺旋-環(huán)-螺旋結構家族成員，首先在果蠅中被發(fā)現，這種蛋白在果蠅中胚層的發(fā)育和誘導細胞遷移運動中發(fā)揮了重要作用。進一步研究發(fā)現Twist在多種實體瘤中表達上調，Twist可通過誘導上皮細胞向間質細胞發(fā)生轉換，從而在細胞凋亡、轉移和血管新生中起到重要調控作用。目前關于Twist在實體瘤中的表達以及與腫瘤轉移的相關研究已有較多見諸報道，但Twist與腫瘤血管新生的相關性研究較少，尤其是在鼻咽癌中[6-8]。

血管內皮細胞作為血管內側的一層扁平上皮細胞，在機體各臟器中分布廣泛，血管內皮細胞作為組織和血液間的第一道屏障，在細胞炎癥信號、切應力和激素水平等信號的作用下，可分泌多種血管活性物質，從而調節(jié)血液穩(wěn)態(tài)、新生血管形成和組織再生等作用。血管內皮細胞已成為在機體多種病理生理過程中起關鍵調控作用的重要器官。腫瘤組織中的血管內皮細胞在組織形態(tài)、增生方式和免疫學特征等方面和正常組織血管內皮細胞存在較大差異，腫瘤組織內血管內皮細胞增生為順應腫瘤生長的需要，在腫瘤細胞分泌的多種促血管生長因子的作用下，腫瘤血管內皮細胞的活力、侵襲能力以及新生血管能力均得到不同程度增強，以適應腫瘤發(fā)展和轉移的需要。為此，根據腫瘤內皮細胞的特點，靶向腫瘤血管內皮細胞治療應運而生，有效抑制包括鼻咽癌在內的腫瘤新生血管形成，可有效抑制惡性腫瘤的發(fā)展和轉移，從而改善惡性腫瘤患者預后[10-11]。在本研究中，將Twist沉默載體轉染至體外CNE2細胞,并通過RT-PCR和Western blot檢測證實Twist沉默載體可顯著下調Twist mRNA和蛋白在鼻咽癌細胞中的表達，并獲取干擾Twist基因后鼻咽癌細胞特定培養(yǎng)基，并用該特定培養(yǎng)基作用體外HUVECs，對血管內皮細胞活力、侵襲能力和血管新生能力進行了進一步研究。首先，我們利用CCK-8實驗分析干擾Twist在鼻咽癌細胞中的表達后對體外HUVECs活力的影響，結果表明，沉默CNE2細胞中Twist的表達后可有效抑制體外HUVECs活力，從而表明Twist在HUVECs體外生長中發(fā)揮了一定作用。Transwell小室實驗結果表明，沉默Twist的表達后可有效抑制體外HUVECs侵襲行為。另外通過小管形成實驗模擬HUVECs體外血管形成，在體外Matrigel基質環(huán)境中生長12 h后，細胞逐漸向兩端延長呈梭形，同時細胞延長端開始在Matrigel中伸展，相鄰細胞開始出現聯接并出現管腔樣結構，低表達Twist基因的CNE2細胞上清液可明顯抑制體外HUVECs體外小管形成，從而表明Twist在鼻咽癌細胞中的表達水平在體外鼻咽癌細胞促進血管新生行為中也發(fā)揮了一定作用，提示Twist可能在鼻咽癌體外血管新生的發(fā)展過程中發(fā)揮促進功能，應該被視為鼻咽癌潛在的一個新的靶向作用位點。

Figure 5.Analysis of the tube formation of HUVECs treated with CM from CNE2 cells in siTwist, siTwist+PD98059, siTwist+SP600125 and siTwist+SB203580 groups (×200). Mean±SD.n=3.**P<0.01vssiTwist group.

圖5小管形成實驗觀察ERK、p38和JNK信號通路抑制劑對HUVECs體外小管形成的影響

ERK作為一種脯氨酸導向的絲氨酸/蘇氨酸激酶，主要位于細胞漿中，在諸如生長因子、激素、細胞因子、高糖和缺氧等刺激后作用下被激活，激活后ERK可進入細胞核中，進一步激活NF-κB及P70核蛋白體S6激酶，使得相鄰脯氨酸的絲氨酸/蘇氨酸發(fā)生磷酸化。磷酸化ERK在介導信號從細胞膜表面受體傳導至細胞核過程中發(fā)揮關鍵調控作用，p-ERK可激活STATs、c-Myc、Jun、ELK-1、ATF2和Max等轉錄因子，進而對這些轉錄因子各自靶基因的轉錄和翻譯過程產生影響，最終對內皮細胞的遷移、分化和増殖等多種生理學功能發(fā)揮調控作用[12-14]。SP600125作為ERK信號轉導的特異性抑制劑，可通過阻斷Raf 對ERK的磷酸化從而進一步阻斷下游信號通路。血管內皮細胞生長因子作為一種在可由正常細胞和腫瘤細胞合成分泌的細胞因子，VEGF在正常組織細胞中呈低水平表達，且表達水平較為恒定，但其在許多腫瘤細胞中表達上調，是促進腫瘤細胞新生的最重要調節(jié)因子。有研究表明，VEGF在惡性腫瘤細胞中的異常表達與腫瘤肝轉移存在正相關性，同時與惡性腫瘤患者的預后呈明顯負相關。VEGF在腫瘤細胞中的表達與ERK磷酸化水平關系密切，重組人肝細胞生長因子可通過ERK信號通路上調腫瘤細胞中VEGF的表達，從而促進腫瘤組織中血管生長[15]。在本研究中，下調Twist在鼻咽癌細胞中的表達可促進CNE2細胞中ERK的磷酸化水平，同時下調VEGF的表達，但對JNK和p38的表達無明顯影響，而進一步使用ERK信號通路特異性抑制劑作用后發(fā)現，SP600125可部分阻斷沉默Twsit對體外HUVECs小管形成的抑制作用，使用JNK和p38通路抑制劑卻沒有觀察到這種抑制作用，從而表明Twist可能調控鼻咽癌細胞中ERK信號通路，影響VEGF的表達從而在體外血管新生過程中發(fā)揮了一定作用。

綜上所述，Twist可通過抑制ERK信號通路的激活而調控鼻咽癌細胞對體外內皮細胞活力、侵襲和小管形成的作用，表明Twist可能在鼻咽癌血管新生中扮演了重要角色。Twist有望成為治療鼻咽癌新的作用靶點，后續(xù)會在體內進行進一步的驗證及探討。