王文宏， 孔 君， 林小祥， 李劍俠， 陳陸馗

(1東南大學(xué)附屬中大醫(yī)院神經(jīng)外科， 江蘇 南京 210001； 2東南大學(xué)附屬中大醫(yī)院江北分院神經(jīng)外科， 江蘇 南京 210044)

創(chuàng)傷性顱腦損傷(craniocerebral injury, CI)又稱顱腦外傷，是外傷患者致殘和致死的主要原因之一。隨著醫(yī)療技術(shù)的不斷發(fā)展，顱腦損傷患者的生存率雖有較大提高，但其神經(jīng)功能障礙給患者及其家屬帶來諸多困擾[1-2]。顱腦損傷可誘發(fā)炎癥、腦水腫和氧化損傷等病理過程[3-4]。存在于腦組織中的堿性成纖維細(xì)胞生長因子(basic fibroblast growth factor，bFGF)能夠促進(jìn)創(chuàng)傷愈合、組織修復(fù)及組織再生，具有廣泛的生物學(xué)特性[5]。最近的研究顯示，bFGF能夠減輕顱腦損傷后的神經(jīng)元損傷，促進(jìn)顱腦損傷大鼠運動能力的恢復(fù)，但對顱腦損傷大鼠的炎癥反應(yīng)、氧化應(yīng)激和自噬等的影響尚不明確[6]。本實驗構(gòu)建了顱腦損傷大鼠模型，探討bFGF對顱腦損傷大鼠神經(jīng)功能、炎癥反應(yīng)和脂質(zhì)過氧化等的影響，為bFGF治療顱腦損傷的臨床應(yīng)用提供理論依據(jù)。

材 料 和 方 法

1 實驗動物、試劑與儀器

成年雄性SD大鼠共50只，體重250 g～280 g，購自南京大學(xué)動物模式研究所實驗動物中心，合格證號為SCXK(蘇)2015-0001。

丙二醛(malondialdehyde，MDA)含量檢測試劑盒購自Solarbio；腫瘤壞死因子α(tumor necrosis factor-α，TNF-α)ELISA檢測試劑盒和超氧化物歧化酶(superoxide dismutase，SOD)活性測定試劑盒購自上海碧云天生物技術(shù)有限公司；谷胱甘肽過氧化物酶(glutathione peroxidase，GSH-Px)活性檢測試劑盒購自上海信帆生物；白細(xì)胞介素6(interleukin-6，IL-6)和IL-1β ELISA檢測試劑盒購自Thermo；抗LC3-Ⅱ抗體、抗beclin-1抗體和HRP標(biāo)記的II抗購自GeneTex； BCA Protein Assay Kit購自Sigma；重組人bFGF購自Promega。StatFax酶標(biāo)儀購自AWARENESS；電泳儀購自Bio-Rad； Alpha凝膠成像分析系統(tǒng)購自Protein Simple；大腦立體定向儀購自四川成都儀器廠。

2 實驗方法

2.1顱腦損傷大鼠模型的構(gòu)建 大鼠飼養(yǎng)條件為21～25 ℃，12 h光照，不限制飲水和飲食。大鼠顱腦損傷模型構(gòu)建采用Feeney’s自由落體硬膜外撞擊法，步驟參照文獻(xiàn)[7]，按照50 mg/kg的戊巴比妥鈉腹腔注射麻醉大鼠，將大鼠的頭部固定于立體定向儀，把頂部的皮毛剪掉，于大鼠右側(cè)頭部冠狀縫后2 mm，中線旁開2 mm的位置將大鼠的頭皮切開，把骨膜分離掉，暴露顱骨，用牙科鉆頭鉆一個直徑大小為5 mm的孔，保持硬膜的完整，給予高20 cm、重30 g的擊錘自由墜落撞擊，引起顱腦損傷，以骨蠟把骨孔封閉以后，將頭皮縫合。大鼠隨機(jī)分為對照(control)組、CI組及bFGF低劑量(low-dose,L)組、中劑量(middle-dose,M)組和高劑量(high-dose,H)組，每組10只。CI組按照上述方法構(gòu)建顱腦損傷模型；對照組不給予硬膜外撞擊，其它同模型組；bFGF低、中和高劑量組在建模成功后30 min分別給予2、4和6 μg的bFGF(溶于1 mL的生理鹽水中)腹腔注射，連續(xù)注射7 d；CI組和對照組給予注射等量的生理鹽水。

2.2大鼠神經(jīng)功能評分 以改良神經(jīng)功能評分法對各組大鼠的神經(jīng)功能進(jìn)行評分，分值越高神經(jīng)功能損傷越重。在顱腦損傷后的1 d、4 d和7 d進(jìn)行評分，評分標(biāo)準(zhǔn)參照文獻(xiàn)[7]。最高得分值為18分。

2.3大鼠腦組織中含水量的測定 各組大鼠在顱腦損傷7 d神經(jīng)功能評分后，取大鼠的全腦組織，于電子天平上稱量腦組織的濕重，再把腦組織放在錫紙中包裹以后，100 ℃烤干24 h，再用電子天平稱量干重。腦組織水含量(%)=(濕重-干重)/濕重×100%。

2.4大鼠腦組織中TNF-α、IL-6和IL-1β水平的測定 取方法2.3中收集的腦組織，制作腦組織勻漿液，用ELISA法測定TNF-α、IL-6和IL-1β含量，具體操作步驟同試劑盒說明書。簡述如下：用冰預(yù)冷的PBS將組織洗滌并剪碎以后，進(jìn)行組織勻漿，5 000×g離心10 min，收集組織勻漿液，將標(biāo)準(zhǔn)品稀釋以后，按照每孔50 μL的標(biāo)準(zhǔn)品添加于酶標(biāo)板上，待測孔每孔添加10 μL，在37 ℃孵育30 min以后，添加酶標(biāo)試劑，顯色劑顯色以后，測定波長450 nm處的吸光度(A)值，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計算濃度。

2.5大鼠腦組織中MDA含量及SOD和GSH-Px活性的測定 取方法2.3中收集的腦組織，制作腦組織勻漿液，在組織勻漿液中加入0.5%的硫代巴比妥酸溶液，置于沸水煮沸10 min，檢測波長450 nm、532 nm和600 nm處的A值，根據(jù)公式：MDA濃度(μmol/L)=[6.45×(A532-A600)-0.56×A450]計算MDA含量。另外取組織勻漿液，根據(jù)樣品和標(biāo)準(zhǔn)品設(shè)置96孔板，在37 ℃孵育30 min以后，檢測450 nm處的A值，計算SOD酶活力。GSH-Px是一種硒蛋白酶，可以同苯甲酸顯色液發(fā)生反應(yīng)生成黃色的離子，檢測422 nm處的A值可以間接推算GSH-Px的活性，GSH-Px活性檢測步驟同試劑盒說明書。

2.6大鼠腦組織中自噬相關(guān)蛋白LC3-Ⅱ和beclin-1表達(dá)水平的檢測 取方法2.3中收集的腦組織，研磨后，添加含有PMSF的裂解液，用BCA法測定蛋白濃度。把蛋白樣品同1/4體積的5×Loading Buffer混勻后，100 ℃煮沸5 min。配制10%的分離膠和5%的濃縮膠，在上樣孔中加入30 μg的蛋白樣品，以90 V電壓在濃縮膠中電泳，約30 min后，把電壓升高至120 V，當(dāng)溴酚藍(lán)染料達(dá)到底部邊緣后，把電源關(guān)閉，取出蛋白凝膠。把凝膠上的蛋白在90 V電壓條件下電轉(zhuǎn)到NC膜上。取出NC膜，置于100 g/L的脫脂奶粉中，室溫條件孵育2 h。將抗LC3-Ⅱ和beclin-1抗體用TBST以1∶800稀釋以后，與NC膜反應(yīng)，反應(yīng)條件為4 ℃過夜; 再將HRP標(biāo)記的 II 抗用TBST以1∶3 000稀釋，于室溫中孵育2 h。用ECL發(fā)光試劑盒顯色，以ImageQuant LAS 4000mini拍照分析灰度值，GAPDH作為內(nèi)參照，分析LC3-Ⅱ和beclin-1的蛋白水平。

3 統(tǒng)計學(xué)處理

數(shù)據(jù)采用SPSS 21.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計分析。所有數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(mean±SD)表示，多組間比較采用單因素方差分析，組間多重比較采用SNK-q檢驗，以P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

結(jié) 果

1 bFGF改善顱腦損傷大鼠神經(jīng)功能

CI模型組大鼠神經(jīng)功能評分高于對照組(P<0.05)，而bFGF-L、-M和-H組顱腦損傷大鼠的神經(jīng)功能評分低于腦損傷組(P<0.05)，說明bFGF改善顱腦損傷大鼠神經(jīng)功能，見表1。研究也發(fā)現(xiàn)與對照組相比，CI組大鼠腦組織結(jié)構(gòu)疏松，空泡增多，且腫脹和壞死細(xì)胞明顯增多，而bFGF處理后病理結(jié)構(gòu)有所改善，且高劑量組的改善效果優(yōu)于中劑量組，中劑量組的改善效果優(yōu)于低劑量組，見圖1。

表1 各組大鼠神經(jīng)功能評分和腦組織含水量的比較

*P<0.05vscontrol group;#P<0.05vsCI group.

Figure 1.bFGF attenuated craniocerebral injury in the rats (HE staining, ×40).

圖1bFGF改善大鼠顱腦損傷

2 bFGF降低顱腦損傷大鼠腦組織含水量

腦損傷組大鼠的腦組織含水量高于對照組(P<0.05)，而bFGF-L、-M和-H組顱腦損傷大鼠腦組織的含水量低于腦損傷組(P<0.05),說明bFGF降低顱腦損傷大鼠腦組織含水量，見表1。

3 bFGF降低顱腦損傷大鼠腦組織中TNF-α、IL-6和IL-1β的含量

腦損傷組大鼠腦組織中TNF-α、IL-6和IL-1β的含量高于對照組(P<0.05)，而bFGF-L、-M和-H組顱腦損傷大鼠腦組織中的TNF-α、IL-6和IL-1β含量低于腦損傷組(P<0.05)，說明bFGF降低顱腦損傷大鼠腦組織中TNF-α、IL-6和IL-1β含量，減輕腦組織炎癥，見表2。

表2各組大鼠腦組織中TNF-α、IL-6和IL-1β水平的比較

Table 2.The changes of TNF-α, IL-6 and IL-1β levels in the brain tissues of the rats in each group (Mean±SD.n=10)

GroupTNF-α (ng/g)IL-6 (ng/g)IL-1β (ng/g)Control79.25±6.141.54±0.1256.23±5.27CI241.78±22.86?5.45±0.57?185.26±14.02?bFGF-L194.25±12.45#4.36±0.32#148.21±12.56#bFGF-M175.48±11.20#3.12±0.20#121.45±10.37#bFGF-H164.25±14.58#2.46±0.15#112.57±10.89#

*P<0.05vscontrol group;#P<0.05vsCI group.

4 bFGF減輕顱腦損傷大鼠腦組織氧化損傷

腦損傷組大鼠腦組織中的MDA水平高于對照組，而SOD和GSH-Px活性低于對照組(P<0.05)；bFGF-L、-M和-H組顱腦損傷大鼠腦組織中MDA水平低于腦損傷組，而SOD和GSH-Px活性高于腦損傷組(P<0.05)，說明bFGF降低顱腦損傷大鼠腦組織氧化損傷，減輕氧化應(yīng)激，見表3。

表3各組大鼠腦組織中MDA含量及SOD和GSH-Px活性的比較

Table 3.The content of MDA and the activity of SOD and GSH-Px in the brain tissue of each group (Mean±SD.n=10)

GroupSOD (103 U/g)MDA (μmol/g)GSH-Px (103 U/g)Control15.47±1.2317.46±1.5232.16±3.87CI4.02±0.41?41.56±3.25?14.17±1.28?bFGF-L6.85±0.58#29.71±2.16#21.46±2.31#bFGF-M 9.64±0.74#24.10±2.43#26.58±2.56#bFGF-H12.84±1.21#18.76±1.57#30.15±2.47#

*P<0.05vscontrol group;#P<0.05vsCI group.

5 bFGF降低顱腦損傷大鼠腦組織中自噬相關(guān)蛋白LC3-Ⅱ和beclin-1的表達(dá)

腦損傷組大鼠腦組織中LC3-Ⅱ和beclin-1蛋白水平高于對照組(P<0.05)；bFGF-L、-M和-H組顱腦損傷大鼠腦組織中的LC3-Ⅱ和beclin-1蛋白水平低于腦損傷組(P<0.05),說明bFGF降低顱腦損傷大鼠腦組織的自噬水平，見圖2和表4。

Figure 2.The images of Western blot for determining the protein expression of autophagy related proteins in the brain tissues of the rats in each group.

圖2Westernblot測定各組大鼠腦組織中自噬相關(guān)蛋白的表達(dá)

表4各組大鼠腦組織中LC3-Ⅱ和beclin-1蛋白水平比較

Table 4.The protein levels of LC3-II and beclin-1 in the brain tissue of each group (Mean±SD.n=10)

GroupLC3-ⅡBeclin-1Control0.15±0.030.26±0.02CI1.03±0.12?0.79±0.08?bFGF-L0.84±0.10#0.51±0.06#bFGF-M0.55±0.06#0.43±0.02#bFGF-H0.35±0.04#0.31±0.04#

*P<0.05vscontrol group;#P<0.05vsCI group.

討 論

bFGF含有155個氨基酸，具有促進(jìn)神經(jīng)元和膠質(zhì)細(xì)胞生長的作用，其在體內(nèi)可以抑制興奮性氨基酸等對神經(jīng)元的毒性作用，此外，外源性的bFGF可以促進(jìn)雪旺細(xì)胞、內(nèi)皮細(xì)胞和成纖維細(xì)胞等多種細(xì)胞的增殖，參與組織傷口愈合[8]。近年來的研究表明，bFGF具有減輕腦缺血再灌注損傷的作用，對于腦梗塞、脊髓損傷和腦震蕩等均有抑制作用[9-10]。bFGF治療后的重型顱腦損傷患者的腦水腫現(xiàn)象逐漸消退，腦組織供血明顯改善[11]。本實驗的結(jié)果顯示，bFGF處理后的顱腦損傷大鼠模型神經(jīng)功能評分明顯降低，說明bFGF具有改善顱腦損傷神經(jīng)功能的作用。

顱腦損傷后腦組織的局部會發(fā)生炎癥反應(yīng)，加上顱腦損傷導(dǎo)致的感染，會產(chǎn)生大量的TNF-α等炎性因子，誘導(dǎo)組織中炎性細(xì)胞的激活，激活的炎性細(xì)胞進(jìn)入腦組織后可以再次釋放炎癥因子，導(dǎo)致血腦屏障被破壞，引起腦水腫，導(dǎo)致腦損傷[12-13]。TNF-α、IL-1β和IL-6等炎癥因子在顱腦損傷大鼠模型腦組織中表達(dá)升高，并且與大鼠神經(jīng)功能評分和腦水腫程度等有關(guān)[14]。IL-6是啟動炎癥反應(yīng)的重要因子，TNF-α是炎癥早期出現(xiàn)的炎性因子[15]。除了組織炎癥，氧化應(yīng)激是引起顱腦繼發(fā)性損傷的另一個重要原因，顱腦創(chuàng)傷可以引起腦組織中產(chǎn)生大量的氧自由基，正常組織中少量的氧自由基是信號轉(zhuǎn)導(dǎo)的關(guān)鍵因子，而過量的氧自由基會引起脂質(zhì)發(fā)生過氧化，MDA是脂質(zhì)過氧化的產(chǎn)物之一[16]。SOD是細(xì)胞內(nèi)氧自由基的主要清除劑，具有降低氧自由基水平的作用，GSH-Px具有催化過氧化氫分解的作用，其是降低組織中氧自由基含量的另外一種蛋白酶[17]。有研究表明，bFGF具有降低細(xì)胞中氧自由基水平的作用，在心肌細(xì)胞、成肌細(xì)胞和神經(jīng)細(xì)胞等細(xì)胞中已經(jīng)得以證實[18-20]。本實驗的結(jié)果表明，bFGF治療后的顱腦損傷大鼠模型的腦組織含水量降低，腦組織中TNF-α、IL-6和IL-1β平降低，同時MDA含量也降低，SOD和GSH-Px活性升高，說明bFGF可以通過降低組織炎癥和氧化損傷減輕顱腦損傷，而對于其在感染誘導(dǎo)的組織炎癥中的作用尚不明確。

細(xì)胞自噬是除了凋亡和壞死之外細(xì)胞的第3種死亡方式，是存在于細(xì)胞內(nèi)的蛋白質(zhì)和細(xì)胞器等通過溶酶體降解的途徑。正常情況下，細(xì)胞自噬有利于維持細(xì)胞內(nèi)環(huán)境的穩(wěn)定，而在病理條件下，細(xì)胞過度自噬會引起細(xì)胞死亡，引起組織損傷[21]。LC3是哺乳動物Atg8的同源物，其可以靶向定位自噬體膜，是目前公認(rèn)的自噬過程中的動力學(xué)標(biāo)志物，LC3-Ⅱ是LC3的細(xì)胞形式之一，其可以促進(jìn)自噬小體的生成，LC3-Ⅱ表達(dá)水平的高低是自噬水平高低的標(biāo)志[22]。Beclin-1參與介導(dǎo)自噬蛋白在吞噬泡中的定位過程，是自噬體形成的必需因子，在自噬過程中表達(dá)升高[23]。有研究表明，bFGF能夠在體外減輕雷帕霉素誘導(dǎo)的神經(jīng)細(xì)胞過度自噬，發(fā)揮神經(jīng)細(xì)胞保護(hù)作用[24]。本實驗表明，bFGF處理后的顱腦損傷大鼠模型腦組織中LC3-Ⅱ和beclin-1表達(dá)水平降低，腦組織中自噬水平降低，提示bFGF可以通過抑制顱腦損傷腦組織中的自噬水平發(fā)揮顱腦保護(hù)作用。

bFGF具有促進(jìn)損傷修復(fù)的作用，其可以通過減少腦組織中非感染因素所致的炎癥介質(zhì)的釋放、減輕氧化損傷、降低自噬水平減緩顱腦損傷，促進(jìn)顱腦損傷大鼠神經(jīng)功能恢復(fù)，這為bFGF治療顱腦損傷提供了理論依據(jù)。由于本實驗中所構(gòu)建的顱腦損傷模型不能完全模擬人體臨床顱腦損傷，臨床上感染因素誘導(dǎo)顱腦組織炎癥也是顱腦損傷發(fā)生的重要原因，在以后的實驗中會對感染和非感染誘導(dǎo)的顱腦炎癥進(jìn)行具體探討。