施 魁，唐燕妮，劉 煬，管武太，陳 芳，鄧躍林

（華南農(nóng)業(yè)大學(xué)動物科學(xué)學(xué)院，國家生豬種業(yè)工程技術(shù)研究中心，廣東廣州 510642）

胎盤作為哺乳動物妊娠期母體與胎兒之間物質(zhì)交換的重要器官，對胎兒的宮內(nèi)發(fā)育具有非常重要的作用[1]。胎盤滋養(yǎng)層細(xì)胞是胎盤屏障的重要組成部分，位于胎盤屏障的最外層，其直接接觸母體血液，在妊娠識別、胚胎植入、胎盤形成、胎兒發(fā)育、代謝廢物的運輸以及維持妊娠等各個方面都起到非常重要的作用[2]。

氨基酸在動物體內(nèi)不僅是合成蛋白質(zhì)的重要成分，也是合成神經(jīng)遞質(zhì)和核苷酸等非蛋白物質(zhì)的重要前體物質(zhì)[3]。在宮內(nèi)發(fā)育過程中，胎兒通過胎盤得到母體血液中的氨基酸對其生長發(fā)育十分重要。氨基酸的跨膜轉(zhuǎn)運是主動運輸，這一過程需在氨基酸轉(zhuǎn)運載體的介導(dǎo)下才可實現(xiàn)。因此，氨基酸轉(zhuǎn)運載體的功能對維持胎兒在子宮內(nèi)的存活以及正常生長發(fā)育起著至關(guān)重要的作用。Cramer等[4]研究表明，在A系列氨基酸轉(zhuǎn)運系統(tǒng)的轉(zhuǎn)運活性降低的情況下，胎兒會發(fā)生宮內(nèi)發(fā)育遲緩（IUGR）現(xiàn)象。Dicke等[5]研究發(fā)現(xiàn)，已經(jīng)發(fā)生IUGR的母豬胎盤中A系列氨基酸轉(zhuǎn)運載體的表達(dá)顯著降低。Kavitha等[6]研究發(fā)現(xiàn)，IUGR胎兒的胎盤中氨基酸轉(zhuǎn)運載體LAT1、LAT2和SNAT2的蛋白表達(dá)量均顯著降低。

本實驗室前期研究發(fā)現(xiàn)，母豬妊娠后期在基礎(chǔ)日糧中添加 0.4%～0.8%亮氨酸（Leu）能通過增加胎豬體蛋白質(zhì)沉積從而促進(jìn)胎兒宮內(nèi)發(fā)育，且顯著提高了新生仔豬背最長肌、小腸和胎盤氨基酸轉(zhuǎn)運載體的表達(dá)[7]。因此，本研究旨在利用細(xì)胞模型進(jìn)一步探究Leu對豬胎盤滋養(yǎng)層細(xì)胞（pTr）增殖、細(xì)胞氨基酸轉(zhuǎn)運載體以及mTOR信號通路的影響，以期對妊娠母豬日糧中Leu的使用提供一定的理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 細(xì)胞完全培養(yǎng)基 DMEM/F12培養(yǎng)基（美國Gibco公司）：每500 mL中添加0.8%雙抗（美國Gibco公司）、0.5% ITS、10%胎牛血清（FBS，美國Gibco公司）。

1.2 亮氨酸母液的配制 Leu（美國Sigma公司）為無菌的白色粉末狀結(jié)晶，準(zhǔn)確稱取0.131 g Leu，溶于40 mL含1% FBS的完全培養(yǎng)基中，經(jīng)0.22 μm濾膜過濾除菌，終濃度為25 mmol/L，于-20℃保存?zhèn)溆?；后用?%FBS的DMEM/F12培養(yǎng)基稀釋備用。

1.3 引物設(shè)計合成 參考NCBI中GenBank公布的基因序列，應(yīng)用Primer Premier 5.0軟件設(shè)計合成，由上海生工生物技術(shù)有限公司合成，引物序列見表1。

1.4 RNA的提取及實時熒光定量PCR 采用傳統(tǒng)法用Trizol裂解液（美國Invitrogen公司）提取豬胎盤滋養(yǎng)層細(xì)胞系（pTr由德州農(nóng)工大學(xué)伍國耀教授饋贈）中的總RNA，并用核酸/蛋白定量儀來檢測其濃度，再參照DNase I（RNase Free，1 000 Units）、DNA Marker（DL 2000）、TaKaRa反轉(zhuǎn)錄試劑盒進(jìn)行合成cDNA。實時熒光定量PCR反應(yīng)體系為20 μL：cDNA 1 μL，目的基因上、下游引物各 0.5 μL（10 μmol/L），SYBY Green Real time PCR Master Mix（日本TOYOBO（上海）公司） 10 μL，DEPC水（美國 Sigma公司）8 μL。PCR反應(yīng)條件：預(yù)變性（95℃ 60 s）；擴增（95℃ 15 s；60℃ 15 s；72℃ 40 s），38個循環(huán)；熔解（95℃ 60 s；60℃ 30 s；95℃ 30 s；60℃ 15 s）。

1.5 統(tǒng)計分析 采用SPSS 19.0統(tǒng)計軟件進(jìn)行Duncan′s多重比較和方差分析，結(jié)果均以平均值±標(biāo)準(zhǔn)誤表示，P＜0.05表示差異顯著，P＜0.01表示差異極顯著。

2 結(jié) 果

2.1 Leu對pTr細(xì)胞周期相關(guān)基因CDK4表達(dá)的影響如圖1所示，不同濃度Leu處理pTr細(xì)胞24 h后，各試驗組CDK4的mRNA相對表達(dá)量與對照組無顯著差異（P＞0.05）；處理48 h后，10 mmol/L試驗組CDK4的mRNA相對表達(dá)量較對照組顯著降低（P＜0.05）。

表1 相關(guān)目的基因及內(nèi)參基因β-actin引物參數(shù)

圖1 不同濃度Leu處理pTr細(xì)胞對其CDK4 mRNA相對表達(dá)量的影響

2.2 Leu對pTr細(xì)胞凋亡相關(guān)基因Caspase-8表達(dá)的影響 如圖2所示，不同濃度Leu處理pTr細(xì)胞24 h和48 h后，各試驗組Caspase-8的mRNA相對表達(dá)量與對照組相比均無顯著差異（P＞0.05）。

圖2 不同濃度Leu處理pTr細(xì)胞對其Caspase-8 mRNA相對表達(dá)量的影響

2.3 Leu對pTr細(xì)胞氨基酸轉(zhuǎn)運載體表達(dá)的影響 如圖3所示，Leu處理pTr細(xì)胞24 h后，1 mmol/L試驗組SNAT1的mRNA相對表達(dá)量較對照組極顯著降低（P＜0.01），但10 mmol/L試驗組和對照組之間差異不顯著（P＞0.05），此外10 mmol/L試驗組SNAT1的mRNA相對表達(dá)量顯著高于1 mmol/L試驗組（P＜0.05）；各試驗組SNAT2、LAT1、4F2hc和rBAT的mRNA相對表達(dá)量與對照組無顯著差異（P＞0.05）。

如圖4所示，Leu處理pTr細(xì)胞48 h后，所有試驗組的氨基酸轉(zhuǎn)運載體SNAT1、SNAT2、LAT1、4F2hc和rBAT的mRNA相對表達(dá)量隨著Leu濃度增加均呈不同程度降低。與對照組相比，1 mmol/L試驗組LAT1 mRNA相對表達(dá)量顯著降低（P＜0.05）；10 mmol/L試驗組SNAT1、SNAT2、LAT1 mRNA相對表達(dá)量較對照組極顯著降低（P＜0.01），rBAT mRNA相對表達(dá)量顯著降低（P＜0.05），4F2hc基因無顯著差異（P＞0.05）。

2.4 Leu對pTr細(xì)胞mTOR信號通路表達(dá)的影響 如圖5所示，Leu處理pTr細(xì)胞24 h后，1 mmol/L試驗組4E-BP1和eIF4G的mRNA相對表達(dá)量顯著低于對 照 組（P＜0.05）；10 mmol/L試 驗 組mTORC1的mRNA相對表達(dá)量極顯著高于對照組和1 mmol/L試驗 組（P＜0.01）。但 1 mmol/L和 10 mmol/L試驗組S6K1、eIF4G、PKB的mRNA相對表達(dá)量與對照組差異均不顯著（P＞0.05）。

圖3 不同濃度Leu處理pTr細(xì)胞24 h對其氨基酸轉(zhuǎn)運載體mRNA相對表達(dá)量的影響

圖4 不同濃度Leu處理pTr細(xì)胞48 h對其氨基酸轉(zhuǎn)運載體mRNA相對表達(dá)量的影響

圖5 不同濃度Leu處理pTr細(xì)胞24 h對其mTOR信號通路mRNA相對表達(dá)量的影響

如圖6所示，Leu處理pTr細(xì)胞48 h后，1 mmol/L試驗組4E-BP1 mRNA相對表達(dá)量顯著低于對照組（P＜0.05），10 mmol/L試 驗 組4E-BP1 mRNA相 對表達(dá)量極顯著低于對照組（P＜0.01）。10 mmol/L試驗組mTORC1 mRNA相對表達(dá)量顯著高于對照組和1 mmol/L試 驗 組（P＜0.05）。 各 組S6K1、eIF4G和PKB mRNA相對表達(dá)量差異均不顯著（P＞0.05）。

圖6 不同濃度Leu處理pTr細(xì)胞48 h對mTOR信號通路mRNA相對表達(dá)量的影響

3 討 論

3.1 Leu對pTr細(xì)胞增殖的影響 細(xì)胞周期性分裂是一個復(fù)雜的過程，其中周期蛋白依賴性激酶（Cyclin Dependent Kinase，CDK）發(fā)揮著非常重要的作用，但其需要與特異性周期蛋白（Cyclin）結(jié)合才具有蛋白激酶的活性，其中CDK作為催化亞基，Cyclin作為調(diào)節(jié)亞基。細(xì)胞周期從G1期過渡到S期主要是通過CDK4與Cyclin D產(chǎn)生的特異性結(jié)合來促進(jìn)的[8]。Takeuchi等[9]研究表明，高濃度Leu能夠抑制C6大鼠Cyclin D1蛋白的表達(dá)，從而抑制神經(jīng)膠質(zhì)瘤細(xì)胞的生長。本次試驗結(jié)果表明，0、1、10 mmol/L Leu處理pTr細(xì)胞24 h和48 h后，CDK4基因的mRNA相對表達(dá)量均呈不同程度降低，尤其是10 mmol/L組處理48 h出現(xiàn)顯著降低的效果。這一結(jié)果提示了高濃度Leu可能會使細(xì)胞周期停滯在G0～G1期，減少其向S期的轉(zhuǎn)變。

細(xì)胞凋亡即細(xì)胞在一定的生理或病理條件下主動死亡的過程，此過程由多種凋亡相關(guān)基因進(jìn)行調(diào)控[10]。細(xì)胞凋亡需要在多種酶的參與下進(jìn)行一系列的基因激活、表達(dá)及調(diào)控，在維持機體內(nèi)環(huán)境穩(wěn)態(tài)和正常生理代謝等方面具有重要意義[11-12]。半胱氨酸蛋白酶（Caspases）是參與真核細(xì)胞凋亡的重要蛋白之一[13]。Caspase被激活后會誘導(dǎo)細(xì)胞內(nèi)相關(guān)底物的降解，從而引起細(xì)胞凋亡[13-14]。Wakshlag等[15]研究發(fā)現(xiàn)，高濃度Leu處理會促進(jìn)犬腎細(xì)胞和骨肉瘤細(xì)胞凋亡，且處理細(xì)胞后Caspase-3和Caspase-2被激活，而Caspase-8未被激活，從而產(chǎn)生了Leu通過介導(dǎo)線粒體途徑來調(diào)控細(xì)胞凋亡的猜測。本試驗結(jié)果表明，不同Leu處理pTr細(xì)胞24 h和48 h后，Caspase-8基因的mRNA相對表達(dá)量與對照組差異均不顯著。這與Wakshlag等[15]的研究結(jié)果一致，因此，可以推測高濃度Leu誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡不是通過Caspase-8途徑介導(dǎo)的。

3.2 Leu對 pTr細(xì)胞氨基酸轉(zhuǎn)運載體表達(dá)的影響Wilson等[16]研究表明，對5日齡仔豬注射Leu后，提高了骨骼肌中氨基酸轉(zhuǎn)運載體（如LAT1）的表達(dá)，導(dǎo)致新生體體重和肌肉質(zhì)量的增加。本實驗室前期研究發(fā)現(xiàn)，妊娠后期日糧添加0.4%～1.2%Leu 顯著提高了胎盤、新生仔豬小腸以及背最長肌中氨基酸轉(zhuǎn)運載體LAT1、SNAT1、SNAT2、4F2hc和rBAT的表達(dá)[17]。彭飛[18]的研究表明，SD大鼠母體能量攝入量對胎盤氨基酸轉(zhuǎn)運載體SNAT1、SNAT2的mRNA相對表達(dá)量有上調(diào)作用，但差異不顯著。Zhang等[19]用7.5 mmol/L的Leu對IPEC-J2細(xì)胞進(jìn)行了處理，結(jié)果表明氨基酸轉(zhuǎn)運載體ASCT2和4F2hc的mRNA表達(dá)量上升。而本試驗結(jié)果表明，Leu處理pTr細(xì)胞，SNAT1、SNAT2、rBAT、LAT1以及4F2hc的mRNA的相對表達(dá)量在24 h和48 h后均下降。結(jié)果不同的原因可能是研究者所使用的培養(yǎng)基有差別，Zhang等[19]使用的是不含Leu的培養(yǎng)基，在Leu缺乏的情況下進(jìn)行處理氨基酸轉(zhuǎn)運載體表達(dá)量提高，而本試驗使用的培養(yǎng)基含有能夠維持細(xì)胞正常增殖的Leu，因此本試驗添加的Leu 可能導(dǎo)致Leu 濃度過高，細(xì)胞內(nèi)氨基酸失衡，從而抑制了細(xì)胞增值，并降低了細(xì)胞內(nèi)氨基酸轉(zhuǎn)運載體的表達(dá)。

3.3 Leu對pTr細(xì)胞mTOR信號通路的影響 近年來許多研究表明，mTOR 信號通路能影響到LAT1、4F2hc及氨基酸轉(zhuǎn)運系統(tǒng)A的表達(dá)[20-21]。Luo等[22]在L6大鼠的肌肉細(xì)胞培養(yǎng)基中加入0.105 g/L Leu，發(fā)現(xiàn)LAT1、4F2hc和SNAT2的mRNA相對表達(dá)水平可以通過mTORC1依賴性ATF4信號通路進(jìn)行調(diào)節(jié)。此外，mTOR信號通路也會受到氨基酸濃度的影響，氨基酸能夠激活mTOR信號通路來調(diào)控細(xì)胞的生長代謝。Escobar等[23]研究表明，給新生仔豬添加Leu 可以通過增強信號傳導(dǎo)刺激蛋白質(zhì)合成，以促進(jìn)mRNA的翻譯。Yuan等[24]研究表明，當(dāng)氨基酸缺乏時mTOR信號通路會被抑制，GCN信號通路則被激活。本研究中，使用Leu處理pTr細(xì)胞24 h后，10 mmol/L 試驗組mTORC1的mRNA相對表達(dá)量極顯著高于對照組，48 h后，差異降為顯著，認(rèn)為這可能與Leu在細(xì)胞內(nèi)的分解代謝有關(guān)。細(xì)胞內(nèi)支鏈氨基酸的分解代謝有多種酶參與，其中包括線粒體支鏈α-酮酸脫氫酶（BCKDH），產(chǎn)生的代謝產(chǎn)物最終會進(jìn)入到三羧酸循環(huán)中去。Wessels等[25]研究表明，高濃度Leu能增加BCKDH在組織中的活性，過量Leu會促使支鏈氨基酸的分解加強，從而機體內(nèi)支鏈氨基酸濃度降低。因此推測，高濃度Leu可能會通過對pTr細(xì)胞中BCKDH活性的刺激，從而提升Leu的分解代謝，而隨著時間的推后，細(xì)胞中Leu濃度開始下降，從而削弱了對mTOR信號通路的影響。此外，本試驗結(jié)果顯示，使用高濃度（10 mmol/L）Leu處理pTr細(xì)胞后，mTOR下游信號S6K1、4E-BP1和eIF4G的mRNA相對表達(dá)量均低于對照組，尤其是處理48 h后，4E-BP1的mRNA相對表達(dá)量極顯著下降，這可能是高濃度Leu會激活mTOR上游信號通路，同時對其下游信號通路有抑制作用。

4 結(jié) 論

高濃度Leu（10 mmol/L）顯著降低了增殖相關(guān)基因CDK4的mRNA表達(dá)，但對細(xì)胞凋亡相關(guān)基因Caspase-8的表達(dá)無顯著影響；高濃度Leu（10 mmol/L）還可以通過mTOR信號通路降低pTr細(xì)胞氨基酸轉(zhuǎn)運載體mRNA的表達(dá)。