熊力力，吳文旋，王 羽中，熊江林*，吳靈英*

（1.武漢輕工大學(xué)農(nóng)副產(chǎn)品蛋白質(zhì)飼料資源教育部工程研究中心，湖北武漢 430023；2.武漢輕工大學(xué)動(dòng)物營養(yǎng)與飼料科學(xué)湖北省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，湖北武漢 430023；3.貴州大學(xué)動(dòng)物科學(xué)院，新農(nóng)村發(fā)展研究院，貴州貴陽 550025；4.浙江農(nóng)林大學(xué)動(dòng)物科技學(xué)院動(dòng)物營養(yǎng)研究所，浙江杭州 311300）

黃曲霉毒素結(jié)構(gòu)相似于霉菌毒素，由黃曲霉、寄生曲霉和少量特異曲霉產(chǎn)生。其中，黃曲霉毒素B1（Aflatoxin B1，AFB1）毒性最強(qiáng)，在不當(dāng)?shù)氖崭詈蛢?chǔ)存條件下產(chǎn)生進(jìn)而污染奶牛飼料。奶牛攝入AFB1污染的飼料后會(huì)在奶中分泌AFB1的羥基化代謝產(chǎn)物黃曲霉毒素M1（Aflatoxin M1，AFM1）。據(jù)報(bào)道，日糧中AFB1轉(zhuǎn)化為乳中AFM1的比率為0.56%～0.59%和1%～3%，轉(zhuǎn)化率的差異受泌乳階段影響[1]。鑒于AFB1和AFM1的肝臟毒性和致癌性，它們被國際癌癥研究機(jī)構(gòu)列為I類致癌物質(zhì)[2-3]。中國最新的飼料標(biāo)準(zhǔn)將奶牛精料補(bǔ)充料和植物性飼料原料中AFB1限值分別設(shè)定為10、30 μg/kg[4]。歐盟將奶牛飼料和飼料原料中AFB1限值分別設(shè)為5、20 μg/kg[5]，美國將奶牛飼料中黃曲霉毒素總量的法定限值設(shè)為20 μg/kg[6]。中國和美國將牛奶中AFM1的限值設(shè)定為500 ng/kg[7-8]，而歐盟的限值為50 ng/kg[9]。

盡管各國制定了飼料AFB1和牛奶AFM1的限量標(biāo)準(zhǔn)，但黃曲霉毒素的致癌、致畸和致突變性使得人們一直高度關(guān)注該毒素在牛奶和飼料中的污染情況。加強(qiáng)奶牛精料原料AFB1和牛奶產(chǎn)品AFM1的監(jiān)測，有利于生產(chǎn)安全牛奶。湖北省處于亞熱帶地區(qū)，氣候條件適合奶牛飼料原料的AFB1生成，引起牛奶AFM1污染。因此，本研究分別檢測湖北省飼料廠和奶牛場精料原料以及市售的巴氏滅菌奶和超高溫滅菌（Ultra High Temperature Treated，UHT）奶中AFB1和AFM1含量并分析其污染原因，為奶牛養(yǎng)殖和牛奶市場提供借鑒和參考。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)時(shí)間及地點(diǎn) 本研究于2016年10月—2017年3月在湖北省武漢市、黃岡市、襄陽市和十堰市進(jìn)行樣品采集，在武漢輕工大學(xué)動(dòng)物營養(yǎng)與飼料科學(xué)湖北省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行樣品檢測。

1.2 試驗(yàn)材料

1.2.1 牛奶樣品 在12家商超采集某乳企2個(gè)主要品牌的UHT奶120份，另采集2家乳企生產(chǎn)的巴氏滅菌牛奶122份。2家乳企均為黃岡市和襄陽市企業(yè)，采用黃岡市和襄陽市奶牛場的奶源生產(chǎn)。樣品為調(diào)研期間生產(chǎn)的不同批次奶樣，處于保質(zhì)期內(nèi)。UHT奶儲(chǔ)存在4℃條件下，巴氏滅菌奶保存在-20℃條件下，在樣品保質(zhì)期內(nèi)進(jìn)行AFM1分析。

1.2.2 精料原料 從10家奶牛場和奶牛飼料生產(chǎn)廠采集162份飼料原料樣品。其中，玉米40份（奶牛場:奶牛飼料生產(chǎn)廠為25:15）、麥麩21份（奶牛場:奶牛飼料生產(chǎn)廠為13:8）、花生餅36份（奶牛場:奶牛飼料生產(chǎn)廠為24:12）、大豆粕34份（奶牛場:奶牛飼料生產(chǎn)廠為20:14）、芝麻餅31份（奶牛場:奶牛飼料生產(chǎn)廠為24:7）。樣本來自不同批次，每一批次隨機(jī)采集5袋飼料，每袋取樣1.2 kg，即原料包裝上、中、下部位各取400 g，將6 kg樣品混勻后通過四分法取樣，最終獲得有代表性的次級(jí)樣品370 g。本采樣方法符合《飼料采樣方法》（GB/T 14699.1-2005）要求。飼料樣品在65℃下風(fēng)干，儲(chǔ)存在室溫條件下，1個(gè)月內(nèi)完成樣品AFB1檢測。

1.3 主要儀器與試劑 美國伯樂酶標(biāo)儀（型號(hào)BIORAD680）；德國 eppendorf八通道移液槍（30～300 μL）；生化培養(yǎng)箱（型號(hào)BSP-250），上海博迅醫(yī)療生物儀器股份有限公司。飼料AFB1檢測ELISA試劑盒（產(chǎn)品貨號(hào)R1211）和牛奶AFM1檢測ELISA試劑盒（產(chǎn)品貨號(hào)R1121），來自德國拜發(fā)（R-Biopharm AG，Darmstadt，Germany）。

1.4 檢測方法 參照AFB1和AFM1檢測試劑盒的使用說明書進(jìn)行檢測，包括樣品前處理、加樣加酶反應(yīng)、競爭性酶結(jié)合反應(yīng)、顯色反應(yīng)、終止反應(yīng)5個(gè)步驟，并用設(shè)定好波長為450 nm酶標(biāo)儀讀取各孔吸光度（OD450）。試劑盒中的黃曲霉毒素標(biāo)準(zhǔn)品用于建立濃度和吸光度的標(biāo)準(zhǔn)曲線，根據(jù)樣品的吸光度推算樣品中黃曲霉毒素濃度。AFB1檢出限為1 μg/kg，回收率80%～100%，變異系數(shù)8%。AFM1檢出限為5 ng/kg，回收率約95%，變異系數(shù)14%。

本試驗(yàn)中，每個(gè)樣品進(jìn)行3次平行檢測，每20個(gè)樣品安排1個(gè)加標(biāo)樣品（檢測AFM1時(shí)，加標(biāo)濃度為0.010 μg/kg；檢測 AFB1時(shí)，加標(biāo)濃度為 1 μg/kg），用以評(píng)定方法的可靠性。

1.5 統(tǒng)計(jì)分析 采用非參數(shù)性檢驗(yàn)方法分析樣本中黃曲霉毒素濃度差異，即借助SPSS 11.5統(tǒng)計(jì)軟件中Mann-Whitney法進(jìn)行生物統(tǒng)計(jì)，顯著性檢驗(yàn)水平設(shè)定為P＜0.05。使用SPSS 11.5對(duì)陽性樣本黃曲霉毒素濃度的中位數(shù)進(jìn)行描述性分析。AFB1、AFM1的平均濃度表示為平均值±標(biāo)準(zhǔn)誤。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同飼料原料中AFB1污染情況 由表1可見，在檢測的162份樣品中有28.4%被AFB1污染，陽性樣本平均濃度為28.5 μg/kg。AFB1污染濃度最高的樣本是玉米（368.0 μg/kg），其次是花生餅（315.3 μg/kg），分別有1個(gè)（2.5%）和3個(gè)（8.3%）樣本超過國家限值（30 μg/kg）。芝麻餅AFB1陽性率最高（41.9%），小麥麩陽性率最低 （4.8%），2類樣本AFB1均未高于國家限值，平均濃度分別為8.7 μg/kg和3.1 μg/kg。陽性樣本AFB1濃度最低的是大豆粕，平均濃度為2.1 μg/kg，最高濃度5.9 μg/kg。花生餅中AFB1平均濃度顯著高于玉米（P＜0.05）。花生餅和玉米的AFB1污染濃度顯著高于小麥麩、豆粕和芝麻餅（P＜0.05）。

表1 奶牛精料中主要飼料原料AFB1污染情況

2.2 牛奶中AFM1的污染情況 由表2可知，本次調(diào)研的242份牛奶中，72.7%檢測出AFM1，平均濃度98.1 ng/kg，最高濃度為346.2 ng/kg，且有32.2%超過歐盟限量標(biāo)準(zhǔn)，但無樣本超過我國的限量標(biāo)準(zhǔn)。

受檢的122份巴氏滅菌奶中，有115份奶含AFM1（94.3%），陽性樣本平均濃度為138.9 ng/kg，且有76份奶AFM1濃度超過歐盟限量標(biāo)準(zhǔn)。受檢120份UHT奶中，有61份奶檢測到AFM1，陽性奶樣平均濃度為21.2 ng/kg，并有2份奶AFM1濃度超過歐盟限量標(biāo)準(zhǔn)。巴氏滅菌奶AFM1濃度顯著高于UHT奶（P＜0.05）。

3 討 論

3.1 奶牛飼料原料中AFB1污染情況及控制 日糧AFB1污染可引起牛奶AFM1污染，因此需要加強(qiáng)對(duì)泌乳期奶牛日糧AFB1的監(jiān)控。為了維持奶牛泌乳性能，精料在泌乳奶牛的日糧中占比大，高產(chǎn)奶牛日糧中精料比例高達(dá)50%～60%。本調(diào)研發(fā)現(xiàn)，奶牛精料的主要組成原料是玉米、豆粕、麩皮，部分使用了花生餅和芝麻餅。因此，對(duì)這些原料進(jìn)行AFB1監(jiān)測可為奶牛日糧中AFB1的控制提供重要參考。Lutfullah等[10]對(duì)谷物AFB1調(diào)查發(fā)現(xiàn)，玉米最易遭受AFB1污染，陽性率達(dá)40%。范或等[11]發(fā)現(xiàn)，北京地區(qū)玉米AFB1陽性率為50.0%，4.5%樣本超過國家限值。這些研究結(jié)果與本研究相似。高秀芬等[12]和杜妮[13]報(bào)道，玉米污染比率分別為74.6%和77.0%，高于本研究的污染比率（25%）。本研究中AFB1平均濃度、最高濃度和污染區(qū)間與其他文獻(xiàn)存在較大差異，這些差異可能與田間管理（如及時(shí)灌溉）、收獲管理（如及時(shí)收獲、減少破損率）和儲(chǔ)存條件（如料倉的衛(wèi)生和濕度情況）有關(guān)[14]。綜上，玉米易受AFB1污染，污染后濃度較高，不同時(shí)間和地區(qū)AFB1污染程度存在差異，其作為奶牛飼料原料需要嚴(yán)格監(jiān)控AFB1。

表2 巴氏滅菌牛奶和UHT牛奶AFM1污染情況

表3 國內(nèi)谷物及蛋白質(zhì)飼料中AFB1污染綜述

表4 巴氏滅菌奶和UHT奶AFM1污染情況

Li等[15]報(bào)道，長三角地區(qū)花生樣本80%被AFB1污染，最高濃度達(dá)32.3 μg/kg。Ding 等[16]監(jiān)測了華東12省花生AFB1含量，25%樣本含有AFB1，1.0%樣本超過國家限量，平均濃度為2.13 μg/kg，最高達(dá)720 μg/kg。本研究中AFB1陽性率和最高濃度介于上述報(bào)道相關(guān)值之間。上述研究結(jié)果顯示，花生及其產(chǎn)品易受AFB1污染，污染后AFB1濃度較高，奶牛飼料生產(chǎn)中要加強(qiáng)花生餅的AFB1監(jiān)測。

植物性飼料原料黃曲霉毒素含量受多種因素影響，包括種植活動(dòng)、氣候、谷物類型和儲(chǔ)存條件。因此，為了降低飼料中AFB1含量，必須有良好的生產(chǎn)管理規(guī)范，如適當(dāng)?shù)墓喔?、掌握好收獲時(shí)間、保持谷物的完整性、水份控制在12%以下、保持谷倉的衛(wèi)生并控制好儲(chǔ)存溫度[14]。

3.2 牛奶中AFM1污染情況及控制 本次調(diào)研的242份牛奶AFM1含量均低于國家限量，這與我國消費(fèi)者近年來對(duì)牛奶AFM1污染的關(guān)注、奶牛場監(jiān)測和各級(jí)政府加強(qiáng)監(jiān)管密切相關(guān)。本研究還發(fā)現(xiàn)，巴氏滅菌奶和UHT奶的AFM1陽性率較高，一些牛奶AFM1含量高于歐洲限量，因此，牛奶AFM1污染仍應(yīng)引起重視。日糧AFB1可以在奶牛體內(nèi)轉(zhuǎn)化為AFM1，分泌到奶中[1]，牛奶AFM1陽性率高則反映了奶牛飼料AFB1污染比例高，故而要加強(qiáng)奶牛飼料AFB1的監(jiān)測。研究人員相繼報(bào)道了我國飼料AFB1污染情況：28.4%的精料原料（本研究）、74.6%玉米[12]、25%花生[16]、100%青貯料和100%粗料[18]被AFB1污染。因此，在飼料和牛奶生產(chǎn)過程中實(shí)施公共衛(wèi)生操作程序、HACCP規(guī)范和ISO標(biāo)準(zhǔn)等規(guī)范流程可降低牛奶AFM1的污染，奶牛飼料生產(chǎn)過程使用霉菌毒素吸附劑、分解酶和分解菌來降低AFB1吸收。

本研究顯示，UHT奶AFM1污染程度低于巴氏滅菌奶，這與Zheng 等[19]的研究結(jié)果一致。UHT奶占有我國40%液態(tài)奶市場，是最受我國消費(fèi)者歡迎的奶產(chǎn)品，其質(zhì)量和安全控制比巴氏滅菌奶嚴(yán)格。關(guān)于牛奶AFM1污染的報(bào)道見表4。本研究顯示，1.7%的UHT牛奶中AFM1含量超過歐盟限量，這一比率低于2010年中國（20.3%）[19]、伊朗（17.4%）[20]、印度（64.4%）[21]、2014—2015年中國（11.9%）[22]的數(shù)據(jù)。另外，本研究顯示63.6%的巴氏滅菌奶AFM1含量超過歐洲限量，這一比例高于伊朗（26.7%）[20]、印度（42.9%）[21]、2014—2015年中國（0）[22]的數(shù)據(jù)，但低于2010年中國（20.3%）[19]的數(shù)據(jù)。在本研究的文獻(xiàn)綜述中，卡塔爾牛奶AFM1污染程度最小，所有的UHT奶和巴氏滅菌奶AFM1均未超過歐盟限量[23]。本次調(diào)研的牛奶AFM1均未超過國家限量（500 ng/kg），而印度的巴氏滅菌奶和UHT奶高于該限值的比率分別為42.9%和22.2%[21]。不同國家牛奶AFM1含量的差異可能與氣候、地理?xiàng)l件以及奶牛飼料和乳品加工過程中黃曲霉毒素的監(jiān)控策略有關(guān)。

4 結(jié) 論

本研究中，28.4%奶牛精料原料含有AFB1，其中2.5%樣本超過我國限量（30 μg/kg），玉米和花生最易遭受AFB1污染，需要加強(qiáng)對(duì)易受AFB1污染的飼料原料的監(jiān)測，并積極探索有效的AFB1脫毒方法。另外，所有牛奶AFM1含量低于我國限量標(biāo)準(zhǔn)（500 ng/kg），但牛奶AFM1陽性率高達(dá)72.7%，仍需加強(qiáng)原料奶和奶產(chǎn)品的AFM1控制和監(jiān)測。