于海奕， 宋 峣， 馬曉偉， 馮 偉， 高 煒， 張幼怡

(北京大學(xué)第三醫(yī)院心內(nèi)科， 血管醫(yī)學(xué)研究所， 國(guó)家衛(wèi)生健康委心血管分子生物學(xué)與調(diào)節(jié)肽重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室， 分子心血管學(xué)教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室， 心血管受體研究北京市重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室， 北京 100191)

心臟重構(gòu)(cardiac remodeling)是多種因素共同作用的結(jié)果，神經(jīng)體液調(diào)節(jié)失衡、炎性細(xì)胞激活、炎性介質(zhì)釋放和內(nèi)皮功能紊亂等多種因素均參與了心臟重構(gòu)的發(fā)生發(fā)展[1]，其中β-腎上腺素受體(β-adrenergic receptors，β-ARs)過(guò)度激活是生理和病理狀態(tài)下調(diào)節(jié)心臟結(jié)構(gòu)和功能的主要神經(jīng)體液機(jī)制[2]。β1-AR和β2-AR轉(zhuǎn)基因小鼠可出現(xiàn)心臟肥厚和纖維化等病理改變[3]。異丙基腎上腺素(isoproterenol，ISO)是β-ARs非選擇性激動(dòng)劑，我們先前采用連續(xù)腹腔注射或微滲透泵方式給予小鼠ISO 1～2周可誘導(dǎo)明顯的心臟重構(gòu)[4]。β-ARs過(guò)度激活引起心臟重構(gòu)的主要作用機(jī)制包括Gs/AC/cAMP/PKA信號(hào)通路、激活細(xì)胞外信號(hào)調(diào)節(jié)激酶-絲裂原活化蛋白激酶(mitogen-activated protein kinase，MAPK)級(jí)聯(lián)反應(yīng)、白介素-6(interleukin-6，IL-6)/ 信號(hào)傳導(dǎo)及轉(zhuǎn)錄激活因子(signal transducers and activators of transcription, STAT3)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)以及非經(jīng)典通路等[5]。

微小RNAs(microRNAs, miR)是一類內(nèi)源性小分子非編碼RNA。業(yè)已證明，多種miRNA參與β-ARs過(guò)度激活引起的心臟重構(gòu)[6-7]。激動(dòng)β-ARs后，采用microRNA芯片檢測(cè)心臟中多種microRNA表達(dá)水平改變，其中miR-21表達(dá)顯著上調(diào)[8]。Tatsuguchi等[9]證明miR-21是體內(nèi)和體外心臟肥大的重要調(diào)節(jié)因子。 miR-21可通過(guò)靶向負(fù)調(diào)控軟脂酰化磷蛋白(sprouty 1，Spry1)及磷酸酶和張力蛋白同系物(phosphatase and tensin homolog deleted on chromosome ten，PTEN)激活MAPK信號(hào)途徑等，促進(jìn)心肌細(xì)胞生長(zhǎng)及成纖維細(xì)胞的增殖和膠原合成[10]。 在不同病因?qū)е碌男呐K重構(gòu)中，miR-21上游可受到不同轉(zhuǎn)錄因子調(diào)控，包括缺氧誘導(dǎo)因子-1α[11]和STAT3[12]等，引起miR-21轉(zhuǎn)錄增加，進(jìn)而發(fā)揮下游的促心臟重構(gòu)作用。

miR-21在β-ARs激動(dòng)誘導(dǎo)的心臟重構(gòu)中可發(fā)揮重要作用，但β-ARs激動(dòng)如何調(diào)控心臟miR-21表達(dá)，目前尚未得知。本研究采用ISO分別作用于心肌細(xì)胞和心臟成纖維細(xì)胞，探討β-ARs激動(dòng)引起miR-21表達(dá)增加的主要調(diào)控機(jī)制，分析細(xì)胞間旁分泌作用對(duì)miR-21表達(dá)的影響，并驗(yàn)證IL-6/ STAT3通路是否介導(dǎo)β-ARs激動(dòng)引起miR-21表達(dá)增加。以期進(jìn)一步認(rèn)識(shí)心臟細(xì)胞之間相互作用參與交感過(guò)度激活引起心臟重構(gòu)的分子機(jī)制。

材 料 和 方 法

1 主要試劑

ISO和AG 490購(gòu)自Sigma；抗p-STAT3抗體購(gòu)自Santa Cruz Biotechnology；抗p-STAT3抗體購(gòu)自Cell Signaling； Real-time PCR相關(guān)試劑購(gòu)自ThermoFisher；細(xì)胞培養(yǎng)和轉(zhuǎn)染試劑購(gòu)自Invitorgen；Dual-Luciferase Reporter Assay System購(gòu)自Promega；其它生化試劑均為進(jìn)口分裝或國(guó)產(chǎn)分析純。

2 主要方法

2.1原代小鼠心肌細(xì)胞和心臟成纖維細(xì)胞的分離 BALB/c新生小鼠，出生1～2 d，由北京大學(xué)醫(yī)學(xué)部實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供，動(dòng)物許可證號(hào)為SYXK(京)2016-0041,動(dòng)物實(shí)驗(yàn)倫理批準(zhǔn)號(hào)為L(zhǎng)A2010-036。胸腹部用75%的乙醇消毒后，立即開(kāi)胸取出心臟，置入4 ℃的Hank’s平衡鹽溶液中清洗2次，去除心房和心底部大血管，然后將心室剪碎成小塊，用Hank’s平衡鹽溶液配制的含0.07%胰蛋白酶和0.04%Ⅱ型膠原酶于37 ℃恒溫?cái)嚢钘l件下消化。收集消化后細(xì)胞懸液，用含10% FBS的DMEM培養(yǎng)液混合后離心清洗2次，合并每次所得心肌細(xì)胞懸液，接種于培養(yǎng)板中，在37 ℃、5% CO2的培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)，90 min內(nèi)貼壁生長(zhǎng)的細(xì)胞為成纖維細(xì)胞P0代，傳代1次后為P1代成纖維細(xì)胞，用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)；未貼壁細(xì)胞懸液(含心肌細(xì)胞)加入BrdU(終濃度為0.1 mmol/L)以抑制非心肌細(xì)胞生長(zhǎng)，所得心肌細(xì)胞另行接種，用含10% FBS的DMEM培養(yǎng)液培養(yǎng)36 h后，更換為不含血清的DMEM培養(yǎng)液，繼續(xù)培養(yǎng)24 h，用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

2.2條件培養(yǎng)液的制備 將P1代成纖維細(xì)胞撤血清培養(yǎng)24 h，加入ISO(10 μmol/L)，分別于1、6、12、24和48 h收集培養(yǎng)液上清，制成共5種梯度條件培養(yǎng)液。在所制備的5種條件培養(yǎng)液中，選取起效早、效應(yīng)顯著的24 h時(shí)點(diǎn)培養(yǎng)液，檢測(cè)條件培養(yǎng)液引起心肌細(xì)胞p-STAT3/STAT3和miR-21表達(dá)增加的機(jī)制。

2.3miRNA提取和定量分析 按照 TRIzol試劑(Invitorgen)操作手冊(cè)提取新生小鼠心肌細(xì)胞中的總RNA。采用TaqMan MicroRNA Reverse Transcription Kit(Applied Biosystems，Cat#4366596)逆轉(zhuǎn)錄成cDNA，采用TaqMan MicroRNA Assays試劑盒(Applied Biosystems，Cat#4324018)，用實(shí)時(shí)定量PCR(real-time PCR)檢測(cè)成熟的miR-21(Applied Biosystems， 貨號(hào)000397)和U6 RNA(Applied Biosystems，貨號(hào)001973)，PCR擴(kuò)增條件為：98 ℃預(yù)變性10 min；98 ℃變性15 s、60 ℃退火60 s，共40個(gè)循環(huán)。采用Realplex 2 PCR儀進(jìn)行real-time PCR反應(yīng)，讀取樣本中miR-21和U6 RNA的Ct值,以U6作為內(nèi)參照，miR-21相對(duì)表達(dá)量采用2-ΔΔCt法進(jìn)行計(jì)算。

2.4細(xì)胞總蛋白的提取 細(xì)胞用冰浴的PBS洗滌2遍后加入全細(xì)胞裂解液(20 mmol/L Tris-HCl pH7.4，150 mmol/L NaCl, 2.5 mmol/L EDTA, 50 mmol/L NaF，0.1 mmol/L Na4P2O7，1 mmol/L Na3VO4, 1% Triton X-100, 10% 甘油, 0.1% SDS, 1% 脫氧膽酸, 1 mmol/L PMSF和1 mg/L 抑肽酶)，在冰上用細(xì)胞刮刮下細(xì)胞，將裂解液收集至Epperdorf管中，超聲處理后于4 ℃、12 000×g離心15 min，將上清移入新的EP管中，-80 ℃凍存。

2.5Western blot法檢測(cè)蛋白水平 細(xì)胞裂解液進(jìn)行蛋白定量后，取60 μg蛋白進(jìn)行10%SDS-PAGE凝膠電泳，蛋白分離后轉(zhuǎn)膜至硝酸纖維素膜，置于5%脫脂奶粉中室溫封閉1 h，分別孵育抗STAT3抗體(1∶1 000)、p-STAT3抗體(1∶1 000)和eIF5抗體(1∶1 000)4 ℃過(guò)夜。次日采用TBST溶液洗膜后，置于HRP標(biāo)記的山羊抗兔IgG(1∶3 000)中，室溫孵育1 h，洗膜后采用ECL發(fā)光液顯影。

2.6ELISA檢測(cè)IL-6含量 采用R&D的小鼠IL-6免疫檢測(cè)試劑盒(Cat#DY406)，用ELISA方法檢測(cè)細(xì)胞培養(yǎng)液上清中IL-6含量。以標(biāo)準(zhǔn)品的A450值作線性回歸直線，再通過(guò)樣品的A450值計(jì)算出樣品的濃度。

2.7miR-21啟動(dòng)子報(bào)告基因質(zhì)粒的構(gòu)建 采用天根生化公司的基因組提取試劑盒提取新生小鼠基因組，擴(kuò)增miR-21啟動(dòng)子片段，上游引物序列為5’-CCGCTCGAGCGAGTACATAAA-3’，下游引物序列為5’-CCGCTCGAGCAAAGATCACTATCCCAATC-3’?；厥掌?，與載體pGL3-basic分別進(jìn)行XhoI/HindIII雙酶切、回收和連接，轉(zhuǎn)化和鑒定質(zhì)粒。

2.8質(zhì)粒轉(zhuǎn)染和報(bào)告基因活性檢測(cè) 采用Invitrogen的Lipofectamine 2000進(jìn)行質(zhì)粒轉(zhuǎn)染。心肌細(xì)胞按約每孔1.5×105個(gè)細(xì)胞種植于24孔板，貼壁培養(yǎng)24 h后，換液(含BrdU和血清但不含雙抗的DMEM，每孔500 μL)，轉(zhuǎn)染操作按照說(shuō)明書(shū)進(jìn)行。轉(zhuǎn)染螢光素酶報(bào)告基因質(zhì)粒(含miR-21啟動(dòng)子區(qū)螢光素酶報(bào)告基因pGL3-21PPR)每孔0.32 μg，同時(shí)共轉(zhuǎn)染每孔0.02 μg海腎(Renilla)螢光素酶報(bào)告基因作為內(nèi)參照，轉(zhuǎn)染24 h后換液(無(wú)血清的DMEM每孔1 mL)繼續(xù)培養(yǎng)24 h后，加入條件培養(yǎng)液處理24 h后，收集細(xì)胞裂解液，-80 ℃凍存待測(cè)。應(yīng)用Promega的Dual-Luciferase Reporter Assay System(Cat# E1910)進(jìn)行檢測(cè)。檢測(cè)時(shí)應(yīng)用Promega的CLOMAX儀。預(yù)先加好每孔20 μL細(xì)胞裂解液放入白板，避光放置5 min，然后啟動(dòng)自動(dòng)加樣的DLR(雙報(bào)告)程序。每次順序加入每孔100 μL LARII以及100 μL Stop&Glo Reagent至96孔白板(Costar, Cat# 3922)。讀數(shù)為目的基因螢火蟲(chóng)螢光素酶(firefly)活性以及內(nèi)參海腎螢光素酶(Renilla)報(bào)告基因的活性，檢測(cè)結(jié)果經(jīng)內(nèi)參校正，用相對(duì)螢光素酶活性單位(relative luciferase activity，RLU)表示，即目的基因螢光素酶活性與Renilla螢光素酶報(bào)告基因的螢光素酶活性的比值。

3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

實(shí)驗(yàn)結(jié)果以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)誤(mean±SEM)表示。數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)采用Prism 5.0軟件進(jìn)行分析(Graphpad Software Inc.)。對(duì)照組與處理組之間的比較采用t檢驗(yàn)或方差分析。以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié) 果

1 ISO處理心臟成纖維細(xì)胞的條件培養(yǎng)液可使小鼠心肌細(xì)胞miR-21表達(dá)增加

采用條件培養(yǎng)液孵育心肌細(xì)胞24 h后，檢測(cè)miR-21表達(dá)量的改變。隨著ISO孵育成纖維細(xì)胞時(shí)間越長(zhǎng)，所制備的條件培養(yǎng)液引起的心肌細(xì)胞miR-21的表達(dá)量越高；其中ISO作用24 h產(chǎn)生的條件培養(yǎng)液，可使心肌細(xì)胞miR-21表達(dá)量比對(duì)照組增加130%(P<0.01)，ISO作用48 h產(chǎn)生的條件培養(yǎng)液，可使miR-21增加140%(P<0.05)，見(jiàn)圖1A，而ISO直接作用下的心肌細(xì)胞及心臟成纖維細(xì)胞miR-21的表達(dá)量未見(jiàn)明顯增加，見(jiàn)圖1B。

2 ISO作用的心臟成纖維細(xì)胞條件培養(yǎng)液可使心肌細(xì)胞miR-21轉(zhuǎn)錄活性顯著增加

應(yīng)用螢光素酶報(bào)告基因?qū)嶒?yàn)檢測(cè)了ISO作用不同時(shí)間的條件培養(yǎng)液對(duì)心肌細(xì)胞miR-21轉(zhuǎn)錄活性的影響。隨著ISO孵育成纖維細(xì)胞時(shí)間的延長(zhǎng)，所制備的條件培養(yǎng)液引起的心肌細(xì)胞miR-21的轉(zhuǎn)錄活性增加越高，其中ISO作用24 h產(chǎn)生的條件培養(yǎng)液可使心肌細(xì)胞miR-21轉(zhuǎn)錄活性比對(duì)照組增加94.9%(P<0.01)，ISO作用48 h產(chǎn)生的條件培養(yǎng)液，可使心肌細(xì)胞miR-21增加77.1% (P<0.01)，與miR-21表達(dá)水平的變化趨勢(shì)一致，見(jiàn)圖2。

Figure 1.The expression of miR-21 in cardiomyocytes after incubation with conditioned medium from fibroblasts treated with ISO (10 μmol/L) for different time. A: the expression of miR-21 in cardiomyocytes significantly increased after incubation with the medium from ISO-treated fibroblasts, and ISO did not directly induce miR-21 up-regulation in cardiomyocytes; B: miR-21 expression was not induced in fibroblasts by ISO (10 μmol/L) stimulation. Mean±SEM.n=3.*P<0.05,**P<0.01vsISO group.

圖1ISO處理心臟成纖維細(xì)胞的條件培養(yǎng)液可使小鼠心肌細(xì)胞miR-21表達(dá)增加

Figure 2.miR-21 transcriptional activity was determined by luciferase activity assay. Transcriptional activity of miR-21 in cardiomyocytes significantly increased after incubation with the medium from ISO-treated fibroblasts. Mean±SEM.n=3.**P<0.01vscontrol group.

圖2螢光素酶報(bào)告基因?qū)嶒?yàn)檢測(cè)miR-21的轉(zhuǎn)錄活性

3 ISO作用成纖維細(xì)胞形成的條件培養(yǎng)液增加心肌細(xì)胞轉(zhuǎn)錄因子STAT3活性

隨著ISO孵育成纖維細(xì)胞時(shí)間越長(zhǎng)，所制備的條件培養(yǎng)液引起的心肌細(xì)胞磷酸化STAT3(p-STAT3)含量越高,其中ISO作用24 h產(chǎn)生的條件培養(yǎng)液作用于心肌細(xì)胞30 min，p-STAT3/STAT3增加96.6%(P<0.01)；ISO作用48 h產(chǎn)生的條件培養(yǎng)液，可使心肌細(xì)胞p-STAT3/STAT3增加142%(P<0.01),見(jiàn)圖3A。

ISO作用成纖維細(xì)胞24 h產(chǎn)生的條件培養(yǎng)液使心肌細(xì)胞p-STAT3/STAT3和miR-21表達(dá)量分別較對(duì)照組增加57.7%(P<0.01)和128%(P<0.01)。 應(yīng)用JAK2/3/STAT3的抑制劑AG490預(yù)先孵育細(xì)胞30 min抑制JAK-STAT3通路，再給予條件培養(yǎng)液孵育，則可顯著抑制條件培養(yǎng)液引起的心肌細(xì)胞p-STAT3/STAT3和miR-21表達(dá)增加，與只給予條件培養(yǎng)液組相比，分別抑制25.9%(P<0.05)和40.2%(P<0.05)， AG490本身不影響心肌細(xì)胞p-STAT3/STAT3和miR-21的表達(dá)，見(jiàn)圖3B、3C。

4 ISO作用的成纖維細(xì)胞條件培養(yǎng)液中IL-6水平增加，IL-6可劑量依賴性升高心肌細(xì)胞miR-21表達(dá)

ISO作用成纖維細(xì)胞6、12、24和48 h制成的4種條件培養(yǎng)液，均可顯著增加成纖維細(xì)胞上清中IL-6的水平，而ISO對(duì)心肌細(xì)胞IL-6的分泌水平無(wú)明顯影響,見(jiàn)圖4A。直接給予IL-6刺激心肌細(xì)胞24 h可以起miR-21表達(dá)增加，100 pmol/L的IL-6使心肌細(xì)胞miR-21表達(dá)增加約153%(P<0.05)，與條件培養(yǎng)液的效果類似，見(jiàn)圖4B。

討 論

miR-21通過(guò)負(fù)調(diào)控多種靶基因，如Sprouty、PTEN[10]、Smad7[13]和programmed cell death protein 4(PDCD4)等[14]，發(fā)揮促細(xì)胞增殖和分泌、抑制細(xì)胞凋亡的作用。miR-21參與心臟重構(gòu)的作用已有報(bào)道，但miR-21的上游調(diào)控機(jī)制尚未闡明。本項(xiàng)工作探討了交感/腎上腺素受體激動(dòng)引起的心臟重構(gòu)過(guò)程中，引起miR-21這一重要分子表達(dá)改變的調(diào)控機(jī)制，證實(shí)了激動(dòng)β-ARs可介導(dǎo)成纖維細(xì)胞合成和表達(dá)IL-6，旁分泌作用于心肌細(xì)胞，進(jìn)而通過(guò)上調(diào)心肌細(xì)胞中轉(zhuǎn)錄因子STAT3活性，增加miR-21的轉(zhuǎn)錄和表達(dá)水平，加重心臟重構(gòu)反應(yīng)。揭示成纖維細(xì)胞旁分泌IL-6，經(jīng)由細(xì)胞間的相互作用，以上調(diào)心肌細(xì)胞miR-21表達(dá)，參與了β-ARs激動(dòng)所介導(dǎo)的心臟重構(gòu)的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)機(jī)制。

Figure 3.Altered p-STAT3 expression in cardiomyocytes after incubation with conditioned medium from fibroblasts treated with ISO for different time. A: the relative expression of p-STAT3/STAT3 of cardiomyocytes were time-dependently increased after incubation with conditioned medium; B: AG490 inhibited the relative expression of p-STAT3/STAT3 in cardiomyocytes induced by ISO-incubated medium from fibroblast; C: AG490 inhibited miR-21 expression in cardiomyocytes induced by ISO-incubated medium from fibroblast. Mean±SEM.n=3.**P<0.01vscontrol medium group;#P<0.05vsISO medium group.

圖3ISO作用心臟成纖維細(xì)胞的條件培養(yǎng)基增加心肌細(xì)胞p-STAT3和miR-21的表達(dá)

多種心臟重構(gòu)模型中均可見(jiàn)miR-21表達(dá)增加[15-17]。在不同病因作用下miR-21作用于多種靶基因，發(fā)揮促心臟重構(gòu)的作用[8]。但既往的研究中檢測(cè)心肌組織中miR-21的表達(dá)均為心臟整體表達(dá)情況，為了研究整體心臟中增加的miR-21的來(lái)源和調(diào)控機(jī)制，本研究分別在原代心肌細(xì)胞和心臟成纖維細(xì)胞中進(jìn)行檢測(cè)，單獨(dú)給予這2種細(xì)胞ISO處理均不引起miR-21的表達(dá)變化，提示miR-21的表達(dá)上調(diào)可能源于細(xì)胞間的交互作用。ISO作用于成纖維細(xì)胞形成的培養(yǎng)液上清，可時(shí)間依賴性上調(diào)心肌細(xì)胞miR-21表達(dá)，并且條件培養(yǎng)液可顯著激活miR-21的轉(zhuǎn)錄活性，證實(shí)激動(dòng)β-ARs引起的miR-21表達(dá)上調(diào)是在轉(zhuǎn)錄水平實(shí)現(xiàn)的。以往亦有研究報(bào)道ISO作用于大鼠心肌細(xì)胞，可促進(jìn)miR-21表達(dá)增加[18]，與我們研究結(jié)果不同，可能原因是細(xì)胞來(lái)源的動(dòng)物種屬不同所致。

Figure 4.ISO regulates cardiac miR-21 expression through the paracrine action of IL-6 from fibroblasts. A: IL-6 secretion of cardiomyocytes and fibroblasts upon ISO incubation for different time. ISO did not induce IL-6 secretion in cardiomyocytes, but IL-6 secretion was significantly increased in cardiac fibroblasts; B: IL-6 time-dependently increases miR-21 expression in cardiomyocytes. Mean±SEM.n=3.*P<0.05vsother groups;#P<0.05vs1 pmol/L group. FB-ISO: cardiac fibroblast with ISO (10 μmol/L) treatment. CM-ISO: cardiomyocytes with ISO (10 μmol/L) treatment. CTR: control.

圖4ISO作用的成纖維細(xì)胞培養(yǎng)液中IL-6水平增加

轉(zhuǎn)錄因子是引起心肌細(xì)胞miR-21轉(zhuǎn)錄激活的主要機(jī)制之一，miR-21的啟動(dòng)子區(qū)含有多個(gè)保守的增強(qiáng)子原件，包括激活蛋白1(AP1，由Fos和Jun家族核心癌基因組成)、C/EBP-α(控制造血系統(tǒng)分化的關(guān)鍵因子)及核因子I(NFI)、SRF、p53和STAT3的結(jié)合位點(diǎn)[19]。STAT3是miR-21的轉(zhuǎn)錄因子[20]，STAT3激活可增加miR-21的轉(zhuǎn)錄活性和表達(dá)水平，同時(shí)STAT3是介導(dǎo)腎上腺素受體激活發(fā)揮促心臟重構(gòu)作用的重要信號(hào)分子[21-22]。本研究結(jié)果與既往報(bào)道一致，ISO作用成纖維細(xì)胞形成的條件培養(yǎng)液，導(dǎo)致心肌細(xì)胞中STAT3活性顯著增加，STAT3活性變化與miR-21表達(dá)改變一致；給予STAT3通路抑制劑，則可顯著抑制條件培養(yǎng)液引起的心肌細(xì)胞miR-21的表達(dá)增加，證實(shí)激動(dòng)β-ARs引起的心肌miR-21表達(dá)上調(diào)至少部分依賴于心肌細(xì)胞中轉(zhuǎn)錄因子STAT3的激活。

我們以往研究表明，小鼠心肌細(xì)胞上的β-ARs并不能直接介導(dǎo)STAT3激活，而是首先激動(dòng)成纖維細(xì)胞的β2-AR，使其分泌IL-6水平分泌增加，IL-6旁分泌作用于心肌細(xì)胞上的gp130受體，從而導(dǎo)致心肌細(xì)胞的STAT3激活[23]。本研究中ISO既不能直接使小鼠心肌細(xì)胞miR-21增加，也不能使成纖維細(xì)胞miR-21明顯增加，但是ISO作用后的成纖維細(xì)胞的培養(yǎng)液上清卻可使心肌細(xì)胞miR-21表達(dá)量和轉(zhuǎn)錄活性顯著增加，表明心臟β-ARs介導(dǎo)的miR-21表達(dá)增加可能同STAT3的激活機(jī)制相似。有報(bào)道發(fā)現(xiàn)多發(fā)性骨髓瘤細(xì)胞IL-6通過(guò)激活STAT3，使其與miR-21啟動(dòng)子上游的結(jié)合位點(diǎn)結(jié)合，促進(jìn)miR-21的表達(dá)，從而保證瘤細(xì)胞的存活[24]。我們檢測(cè)了條件培養(yǎng)液中IL-6水平，觀察到了與既往研究一致的結(jié)果，隨著ISO孵育成纖維細(xì)胞時(shí)間的延長(zhǎng)，培養(yǎng)液中IL-6水平逐漸增加，IL-6可以時(shí)間依賴性地增加心肌細(xì)胞中miR-21的表達(dá)量。近期研究報(bào)道，β-ARs通過(guò)IL-6旁分泌機(jī)制參與心臟重構(gòu)，ISO通過(guò)激活作用于心臟成纖維細(xì)胞的p38，促進(jìn)IL-6合成和釋放，進(jìn)而通過(guò)旁分泌作用引起心肌細(xì)胞肥大改變[25]。本研究結(jié)果進(jìn)一步補(bǔ)充了上述研究中的級(jí)聯(lián)調(diào)控機(jī)制，即提示β-ARs通過(guò)作用于心臟成纖維細(xì)胞，引起其分泌IL-6水平增高，旁分泌作用于心肌細(xì)胞，經(jīng)由轉(zhuǎn)錄因子STAT3活化，從而在轉(zhuǎn)錄水平激活miR-21，引起miR-21表達(dá)顯著增高，發(fā)揮多靶向作用，促進(jìn)細(xì)胞肥大，抑制細(xì)胞凋亡，參與心臟重構(gòu)。

β-ARs激活引起的心臟重構(gòu)中，細(xì)胞間相互作用機(jī)制對(duì)細(xì)胞和心臟功能產(chǎn)生了重要的影響；成纖維細(xì)胞響應(yīng)刺激信號(hào)，合成和分泌細(xì)胞因子IL-6水平增加，旁分泌作用于心肌細(xì)胞，繼而引起心肌細(xì)胞STAT3活化和miR-21轉(zhuǎn)錄增加。靶向抑制成纖維細(xì)胞旁分泌途徑中的關(guān)鍵分子，將抑制miR-21上游激活機(jī)制，從而抑制β-ARs/STAT3/IL-6/miR-21信號(hào)通路的效應(yīng)，可望阻遏心臟重構(gòu)的進(jìn)展，保護(hù)心臟功能。