黃志蓉 陳育娟

（廈門大學附屬婦女兒童醫(yī)院，廈門市婦幼保健院圍產(chǎn)保健科，福建 廈門 361003）

妊娠期高血壓疾病是妊娠與血壓升高并存的一組疾病[1]。這些疾病幾乎占所有孕產(chǎn)婦死亡的10%。有研究發(fā)現(xiàn)，胎盤滋養(yǎng)層細胞的過度遷移和侵襲與妊娠高血壓的發(fā)生緊密關聯(lián)[2]。

MicroRNA（miRNA）是一類由19-24個核苷酸組成的小非編碼RNA，并參與許多基本的細胞過程[3]。已有多項研究發(fā)現(xiàn)miRNAs參與妊娠期高血壓疾病發(fā)生與發(fā)展[4]。約有600個miRNA在人類正常胎盤和驚厥前期胎盤中表達，其中miR-17被發(fā)現(xiàn)在重度子癇前期患者胎盤中表達降低[5]，提示miR-17可能參與滋養(yǎng)細胞侵襲、遷移等功能異常過程，但具體分子機制仍需不清楚。本實驗通過上調(diào)及下調(diào)滋養(yǎng)層細胞HTR8-SVneo內(nèi)miR-17的表達水平，檢測滋養(yǎng)層細胞遷移和侵襲功能變化，并檢測其對基質(zhì)金屬蛋白酶-2（MMP-2）蛋白表達的影響，探討miR-17和MMP-2在滋養(yǎng)細胞的侵襲和遷移能力中的作用，為臨床妊娠高血壓的靶點治療提供有力的實驗室依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 細胞系：人類滋養(yǎng)層細胞系HTR8-SVneo由本實驗室保存。

1.2 細胞培養(yǎng)：HTR8-SVneo細胞培養(yǎng)于含有10%胎牛血清、青霉素100 U/mL及鏈霉素100 μg/mL的DMEM培養(yǎng)基（美國Gibco公司）中。培養(yǎng)瓶置于37 ℃，5% CO2培養(yǎng)箱，每2～ 3 d進行一次細胞傳代。

1.3 細胞轉(zhuǎn)染：通過細胞轉(zhuǎn)染將miR-17 mimic或miR-17 inhibitor或pcDNA-MMP2（上海吉瑪基因）轉(zhuǎn)染至HTR8-SVneo細胞。具體過程為，接種于6孔板的HTR8-SVneo細胞生長至50%～70%密度時，用Lipfectamine 3000將上述RNA或DNA轉(zhuǎn)染至細胞，24 h或48 h后提取RNA或蛋白進行后續(xù)實驗。

1.4 熒光定量RT-PCR檢測基因表達：提取HTR8-SVneo細胞中總RNA，經(jīng)RNA濃度測定后，通過逆轉(zhuǎn)錄試劑盒，以總RNA為模板，將其逆轉(zhuǎn)錄為cDNA。以U6或磷酸甘油醛脫氫酶分子為內(nèi)參，采用SYBR Green PCR試劑盒進行實時定量PCR檢測miR-17或MMP-2表達水平。根據(jù)2-ΔΔCt方法計算相對表達水平，實驗重復3次。

1.5 Western blot檢測蛋白表達量：提取HTR8-SVneo細胞總蛋白，用BCA法測定蛋白濃度，取等量蛋白加入SDS-PAGE膠孔中，待蛋白條帶分離后，用孔徑0.45 μm的PVDF膜進行蛋白轉(zhuǎn)膜。TBST漂洗3次，用封閉血清封閉1 h，以1∶1000濃度加入兔（鼠）抗人MMP-2一抗或抗β-actin一抗，4 ℃孵育過夜，常溫下TBST洗膜3次，辣根過氧化物酶標記二抗孵育后ECL化學發(fā)光法檢測，Quantity one軟件分析。

1.6 Transwell侵襲實驗：為消除細胞增殖對細胞侵襲實驗的影響，HTR8-SVneo細胞經(jīng)過血清饑餓后，羥基脲作用12 h，待轉(zhuǎn)染不同RNA或質(zhì)粒后，配制細胞懸液并計數(shù)（5×104個/mL）。向鋪有Matrigel基質(zhì)膠的Transwell上室（0.8 μm）加入200 μL細胞懸液，下室加入含有10% FBS的培養(yǎng)液500 μL，培養(yǎng)12 h。以棉簽擦去上層未穿透膜的細胞，取下Transwell上室，用多聚甲醛室溫固定5 min，2 μg/mL的DAPI染核，熒光顯微鏡每組隨機取5個視野觀察計數(shù)并記錄穿膜細胞數(shù)。

1.7 劃痕實驗：為消除細胞增殖對細胞侵襲實驗的影響，HTR8-SVneo細胞經(jīng)過血清饑餓后，羥基脲作用12 h。將細胞分組轉(zhuǎn)染不同RNA或質(zhì)粒后，用100 μL槍頭垂直孔板劃線，棄細胞培養(yǎng)液，PBS沖洗孔板3次，繼續(xù)在細胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，拍照記錄培0 h和24 h的細胞圖片。

1.8 雙熒光素酶實驗：通過NCBI查詢MMP-2基因3'-UTR序列后，設計合成其野生序列和突變序列，以pmirGLO質(zhì)粒為載體，分別構(gòu)建含有MMP-2 3'-UTR和MMP-2 3'-UTR突變序列的質(zhì)粒，然后與miR-17 mimic或mimic-NC通過Lipfectamine 3000共轉(zhuǎn)染至HTR8-SVneo細胞，48 h后用熒光檢測儀檢測熒光強度，每組試驗重復3次。

1.9 統(tǒng)計學處理：用SPSS 20.0軟件進行數(shù)據(jù)分析。實驗數(shù)據(jù)用均數(shù)±標準差表示，兩組均數(shù)間比較用t檢驗，多組均數(shù)比較采用單因素方差分析和LSD法。P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

2.1 轉(zhuǎn)染后miR-17的表達情況：熒光定量PCR檢測轉(zhuǎn)染miR-17 mimic或miR-17 inhibitor后HTR8-SVneo細胞中miR-17水平。結(jié)果見圖1，與mimic-NC組相比，miR-17 mimic組中miR-17水平顯著增加，而轉(zhuǎn)染miR-17 inhibitor顯著下調(diào)HTR8-SVneo細胞中miR-17水平，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）。

圖1 轉(zhuǎn)染后miR-17的表達情況。*P＜0.05

2.2 miR-17對HTR8-SVneo細胞遷移和侵襲的影響：Transwell侵襲實驗結(jié)果顯示：轉(zhuǎn)染miR-17mimic后，HTR8-SVneo細胞侵襲能力顯著下降，而轉(zhuǎn)染miR-17 inhibitor后細胞侵襲能力較對照組顯著升高（P＜0.05）（圖2）。

細胞劃痕實驗結(jié)果顯示：轉(zhuǎn)染miR-17mimic細胞的遷移能力較對照組顯著降低，而miR-17 inhibitor顯著增加細胞的遷移能力（P＜0.05）（圖2）。

圖2 miR-17對HTR8-SVneo細胞遷移和侵襲的影響。*P＜0.05

2.3 HTR8-SVneo細胞中miR-17調(diào)節(jié)MMP-2的表達：熒光定量PCR和Western blot檢測miR-17對MMP-2的表達影響。結(jié)果顯示，miR-17 mimic顯著降低MMP-2的mRNA水平和蛋白水平，而miR-17 inhibitor顯著提高MMP-2的mRNA水平和蛋白水平（圖3）。經(jīng)生物在線預測軟件分析顯示，miR-17與MMP-2 3'UTR具有潛在結(jié)合位點。為進一步確認miR-17與MMP-2的相互關系，開展雙熒光素酶實驗。結(jié)果顯示，miR-17 mimic可降低含有MMP-2 3'UTR序列的熒光素酶報告質(zhì)粒所在細胞的熒光素酶活性，而對含有MMP-2 3'UTR突變序列的熒光素酶報告質(zhì)粒所在細胞的熒光素酶活性沒有影響（圖3）。

圖3 miR-17調(diào)節(jié)MMP-2的表達。*P＜0.05

2.4 MMP-2逆轉(zhuǎn)miR-17對HTR8-SVneo細胞遷移和侵襲的抑制作用：HTR8-SVneo細胞轉(zhuǎn)染miR-17 mimic或轉(zhuǎn)染miR-17 mimic和pcDNAMMP-2組。Transwell侵襲實驗和劃痕實驗結(jié)果顯示，miR-17 mimic顯著抑制HTR8-SVneo細胞侵襲和遷移，而pcDNA-MMP-2逆轉(zhuǎn)miR-17 mimic的抑制作用（圖4）。

3 討 論

胎盤外滋養(yǎng)層細胞向母體子宮組織遷移是胎盤成功植入和胎兒結(jié)局的基礎。妊娠早期滋養(yǎng)細胞開始侵襲過程，并持續(xù)到妊娠第二十周。在最初的幾周內(nèi)，遷移到母體螺旋動脈的血管內(nèi)滋養(yǎng)細胞會堵塞這些血管，這可能會阻止母體血液過早進入絨毛間腔。滋養(yǎng)細胞的異常侵襲、血管的不完全阻塞和氧氣水平的過早升高會損害胎盤絨毛，從而導致妊娠并發(fā)癥的發(fā)生，如流產(chǎn)、妊娠期高血壓等[6]。最近研究表明，miRNA是滋養(yǎng)細胞侵襲和遷移的一種新的調(diào)節(jié)因子[7]。有研究報道，人類胎盤中表達大量miRNA，且miRNA表達譜在妊娠高血壓患者和正常人胎盤中存在差異[8]。如Gao等研究發(fā)現(xiàn)miR-299通過靶向組蛋白脫乙酰酶2抑制子癇前期滋養(yǎng)細胞的侵襲和遷移。Xu等的實驗發(fā)現(xiàn)，與正常對照相比，miR-17在嚴重子癇前期患者胎盤中表達顯著下降[5]。為研究miR-17在滋養(yǎng)層細胞中的作用，在滋養(yǎng)層細胞中促進miR-17表達或抑制miR-17表達，檢測滋養(yǎng)層細胞遷移和侵襲的變化。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，過表達miR-17會抑制HTR8-SVneo細胞遷移和侵襲，揭示miR-17可能在滋養(yǎng)層細胞功能中發(fā)揮重要作用。

圖4 MMP-2與miR-17對HTR8-SVneo細胞遷移和侵襲的抑制作用的關系。*P＜0.05；#P＜0.05

近年來研究表明，MMP-2是MMP超家族中一種重要的鋅依賴蛋白酶，可分解細胞外基質(zhì)復合物，可能參與胚胎發(fā)育過程中細胞滋養(yǎng)層的侵襲。MMP-2表達失調(diào)和MMP-2活性降低參與了妊娠期高血壓患者子宮胎盤異常重構(gòu)和滋養(yǎng)細胞侵襲。MMP-2的下調(diào)與炎癥和氧化因子共同導致子癇前期滋養(yǎng)細胞功能障礙。研究發(fā)現(xiàn)，miR-29b通過靶向MMP-2和血管內(nèi)皮生長因子A抑制滋養(yǎng)細胞的侵襲和血管生成，增強細胞凋亡。通過生物在線預測軟件及雙熒光素酶報告基因?qū)嶒灒l(fā)現(xiàn)miR-17可抑制MMP-2的表達，且二者存在相互作用。進一步研究發(fā)現(xiàn)，MMP-2逆轉(zhuǎn)miR-17對滋養(yǎng)層細胞遷移和侵襲的抑制作用。

本實驗發(fā)現(xiàn)miR-17可抑制HTR8-SVneo細胞的遷移侵襲，進一步研究發(fā)現(xiàn)其是通過靶向抑制MMP-2表達，該結(jié)果為妊娠高血壓的診治提供新的思路。