林冬融 揭育東 韓江全

腦梗死是中老年人常見(jiàn)病及多發(fā)病，其致殘率高，嚴(yán)重影響患者的生活質(zhì)量。細(xì)胞凋亡已被公認(rèn)是腦梗死眾多發(fā)病機(jī)制中的重要一環(huán)，以凋亡為主要病理變化的腦缺血半暗帶面積大小直接決定患者預(yù)后。近年來(lái)研究表明細(xì)胞凋亡亦是糖尿病加重腦缺血再灌注損傷的重要機(jī)制之一[1]。尤瑞克林即人尿激肽原酶，是我國(guó)科研工作者研發(fā)的一種治療急性缺血性腦血管病藥物，它可以選擇性擴(kuò)張缺血區(qū)腦血管，減輕神經(jīng)細(xì)胞損傷，抑制神經(jīng)細(xì)胞凋亡以及促進(jìn)內(nèi)源性神經(jīng)再生[2]。本研究通過(guò)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)?zāi)M糖尿病大鼠腦缺血再灌注損傷的病理生理過(guò)程，探討尤瑞克林對(duì)糖尿病合并急性腦缺血再灌注損傷神經(jīng)細(xì)胞的保護(hù)機(jī)制。

1 材料和方法

1.1實(shí)驗(yàn)動(dòng)物與分組選取8周齡健康雄性SD大鼠82只，體重250～300 g，購(gòu)自廣東省醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心。大鼠置室溫25℃，潔凈通風(fēng)環(huán)境下飼養(yǎng)。以簡(jiǎn)單隨機(jī)數(shù)字法分為尤瑞克林組(n=36只)、缺血組(n=36只)和假手術(shù)組(n=10只)，尤瑞克林缺血組和缺血組再隨機(jī)分為腦缺血2 h再灌注12、24和48 h亞組，每亞組12只。

1.2方法

1.2.1糖尿病模型制作：SD大鼠均于實(shí)驗(yàn)前8 h禁食，6 h禁水。術(shù)前30 min新鮮配制濃度為5 mg/mL無(wú)菌鏈脲佐菌素(STZ)溶液。常規(guī)消毒后，按體重2 mg/100 g給予大鼠左下腹腔注射STZ，24 h后再次按體重3.5 mg/100 g注射STZ。術(shù)后自由進(jìn)水進(jìn)食。7 d后以微機(jī)血糖儀測(cè)定大鼠尾尖外周血血糖，非空腹血糖16.7～25.6 mmol/L為糖尿病造模成功。所有大鼠均造模成功。

1.2.2大腦中動(dòng)脈阻塞再灌注(MCAO/R)大鼠模型制備：參照Z(yǔ)ea-Longa法制作MCAO/R模型。以線體直徑0.26 mm，線頭直徑0.36 mm的成品栓線栓塞大鼠右側(cè)頸內(nèi)動(dòng)脈2 h，抽出栓線實(shí)現(xiàn)再灌注。假手術(shù)組按相同步驟切開(kāi)及分離頸總動(dòng)脈、頸外動(dòng)脈后重新縫合皮膚，不插入栓線。尤瑞克林組大鼠于再灌后30 min給予舌下靜脈注射尤瑞克林(8.75×10-3PNA單位/kg)，缺血組給予等量生理鹽水，假手術(shù)組不進(jìn)行注射。將大鼠放入鼠籠中飼養(yǎng)，自由飲食，室溫保持在25℃。造模過(guò)程中缺血組1只大鼠因麻醉過(guò)量死亡，尤瑞克林組1只大鼠取腦時(shí)發(fā)現(xiàn)蛛網(wǎng)膜下腔出血給予排除。按隨機(jī)原則補(bǔ)充2只。

1.2.3神經(jīng)功能評(píng)分：分別于再灌注12、24和48 h各時(shí)間點(diǎn)處死大鼠前按照Bederson 6級(jí)5分制法進(jìn)行神經(jīng)功能評(píng)分。0分：無(wú)神經(jīng)功能缺損；1分：對(duì)側(cè)上肢不能完全伸展；2分：對(duì)側(cè)肢體抵抗力下降；3分：提尾時(shí)向?qū)?cè)轉(zhuǎn)圈；4分：行走時(shí)自動(dòng)轉(zhuǎn)圈；5分：對(duì)刺激無(wú)反應(yīng)，無(wú)自發(fā)性活動(dòng)。評(píng)分≥2分表示MACO/R造模成功。

1.2.4腦標(biāo)本制備：按腦缺血再灌注12、24和48 h處死大鼠，斷頭取腦，腦組織置4%(質(zhì)量濃度)多聚甲醛液中固定24 h后，在視交叉后2～7 mm處垂直切取冠狀切片，腦片厚度約5 mm，放入厚度與之相適應(yīng)的石蠟包埋網(wǎng)盒備用。

1.2.5凋亡細(xì)胞數(shù)檢測(cè)：采用原位缺口末端標(biāo)記法(TUNEL法)檢測(cè)細(xì)胞凋亡數(shù)目，嚴(yán)格按照細(xì)胞凋亡檢測(cè)試劑盒說(shuō)明書(shū)操作。細(xì)胞核具有凋亡形態(tài)學(xué)特征且有棕黃色顆粒者為陽(yáng)性凋亡細(xì)胞。隨機(jī)選取腦缺血半暗帶皮層組織內(nèi)5個(gè)不相重復(fù)的視野，計(jì)算陽(yáng)性凋亡細(xì)胞數(shù)目，取其平均值。

1.2.6caspase-12表達(dá)檢測(cè)：采用免疫組化檢測(cè)大鼠腦缺血半暗帶皮層組織caspase-12表達(dá)。具體操作嚴(yán)格按照免疫組化檢測(cè)試劑盒(S-P法)說(shuō)明書(shū)進(jìn)行。Ⅰ抗為caspase-12 Rabbit mAb。細(xì)胞胞質(zhì)呈棕黃色者為陽(yáng)性細(xì)胞。以MiVnT顯微生物圖像分析系統(tǒng)對(duì)圖片進(jìn)行分析，以平均灰度級(jí)表示陽(yáng)性細(xì)胞率，平均灰度級(jí)值越低，表明染色越深，陽(yáng)性細(xì)胞率越高。

1.3統(tǒng)計(jì)學(xué)處理采用SPSS17.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行正態(tài)性和方差齊性檢驗(yàn)，符合正態(tài)分布的計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示，多組均數(shù)間比較應(yīng)用單因素方差分析，兩兩比較采用 SNK檢驗(yàn)。取α=0.05。

2 結(jié)果

2.1大鼠外周血血糖測(cè)定MACO/R造模前假手術(shù)組、缺血組及尤瑞克林組平均血糖分別為(21.11±1.70)、(21.09±2.67)、(20.72±2.78)mmol/L，3組間比較無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(F=0.210，P=0.811)。

2.2神經(jīng)功能評(píng)分假手術(shù)組大鼠神經(jīng)功能評(píng)分均為0分，未見(jiàn)神經(jīng)功能缺損，另2組大鼠出現(xiàn)不同程度的神經(jīng)功能缺損表現(xiàn)。尤瑞克林組神經(jīng)功能缺損評(píng)分低于缺血組(P<0.05)；缺血組及尤瑞克林組大鼠于再灌注24、48 h神經(jīng)功能缺損評(píng)分均高于再灌注12 h時(shí)間點(diǎn)(P<0.05)。結(jié)果見(jiàn)表1。

2.3各組凋亡細(xì)胞數(shù)比較假手術(shù)組可見(jiàn)少量凋亡細(xì)胞，另2組大鼠缺血半暗帶中均可見(jiàn)大量凋亡細(xì)胞。缺血組及尤瑞克林組大鼠于再灌注24、48 h凋亡細(xì)胞數(shù)均高于再灌注12 h時(shí)間點(diǎn)(P<0.05)；尤瑞克林組凋亡細(xì)胞數(shù)低于缺血組(均P<0.05)。結(jié)果見(jiàn)表2、圖1。

2.4各組大鼠腦組織caspase-12表達(dá)假手術(shù)組腦組織caspase-12表達(dá)極低，另2組大鼠缺血半暗帶中均可見(jiàn)caspase-12高表達(dá)。缺血組及尤瑞克林組大鼠于再灌注24、48 h的 caspase-12表達(dá)均高于再灌注12 h(P<0.05)。與假手術(shù)組比較，缺血組和尤瑞克林組大鼠腦組織caspase-12表達(dá)升高(均P<0.01)，且尤瑞克林組caspase-12表達(dá)水平均低于缺血組(P<0.05)。結(jié)果見(jiàn)表3、圖2。

表1 各組大鼠腦缺血再灌注不同時(shí)間神經(jīng)功能評(píng)分比較

注：與假手術(shù)組比較，aP<0.05；與缺血組比較，bP<0.05；與同組12 h比較，cP<0.05；—：未進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

表2 各組大鼠腦缺血再灌注不同時(shí)間點(diǎn)腦組織凋亡細(xì)胞計(jì)數(shù)比較

注：與假手術(shù)組比較，aP<0.05；與缺血組比較，bP<0.05；與同組12 h比較，cP<0.05

注：細(xì)胞核內(nèi)有棕黃色顆粒為T(mén)UNEL染色陽(yáng)性細(xì)胞，細(xì)胞核呈藍(lán)色為正常細(xì)胞 圖1 各組大鼠腦缺血再灌注后不同時(shí)間腦缺血半暗帶皮層組織凋亡細(xì)胞比較(TUNEL 染色，×400)

3 討論

糖尿病是缺血性腦血管病的獨(dú)立危險(xiǎn)因素，高血糖狀態(tài)可加重急性腦梗死發(fā)生后的腦損傷。國(guó)內(nèi)外相關(guān)研究證實(shí)[1]，細(xì)胞凋亡在高血糖加重腦缺血再灌注損傷的眾多機(jī)制中起著至關(guān)重要的作用，而內(nèi)質(zhì)網(wǎng)途徑則是3條經(jīng)典的細(xì)胞凋亡途徑之一[3]。內(nèi)質(zhì)網(wǎng)是真核細(xì)胞中蛋白質(zhì)翻譯、合成和鈣離子的存儲(chǔ)場(chǎng)所，缺血、缺氧等各種外在條件刺激下，可引起其功能障礙，導(dǎo)致內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激(endoplasmic reticulum stress，ERS)發(fā)生。缺血缺氧的早期，ERS可糾正錯(cuò)誤折疊蛋白或使未折疊蛋白重新恢復(fù)正常，但隨應(yīng)激時(shí)間逐漸延長(zhǎng)及應(yīng)激反應(yīng)的逐漸增強(qiáng)，則引起細(xì)胞凋亡。caspase-12存在于內(nèi)質(zhì)網(wǎng)外膜，是caspase家族成員之一，caspase-12作為ERS介導(dǎo)的固有凋亡蛋白，與其他的caspase家族成員一樣在生理?xiàng)l件下以無(wú)活性酶原形式存在，僅在ERS時(shí)才能被活化，非內(nèi)質(zhì)網(wǎng)介導(dǎo)的凋亡途徑無(wú)caspase-12表達(dá)[4-5]。實(shí)驗(yàn)研究發(fā)現(xiàn)，caspase-12缺陷大鼠僅能抵抗ERS介導(dǎo)的細(xì)胞凋亡，而對(duì)其他死亡因子的刺激仍可引發(fā)細(xì)胞凋亡，充分證實(shí)caspase-12是ERS誘導(dǎo)凋亡機(jī)制的特異性因子[6]。本課題組前期有關(guān)糖尿病加重腦缺血再灌注損傷的細(xì)胞凋亡途徑研究中，通過(guò)對(duì)比正常血糖組及高血糖組大鼠腦缺血再灌注后caspase-12表達(dá)的變化發(fā)現(xiàn)，與正常血糖組比較，高血糖組大鼠腦缺血半暗帶中caspase-12表達(dá)顯著增強(qiáng)，提示caspase-12介導(dǎo)的ERS可能是糖尿病加重腦缺血再灌注損傷的機(jī)制之一[7]。

表3 各組大鼠腦缺血再灌注不同時(shí)間點(diǎn)腦組織caspase-12表達(dá)比較

注：表中數(shù)據(jù)為灰度級(jí)數(shù)值，其值越高表示caspase-12表達(dá)水平越低；與假手術(shù)組比較，aP<0.01；與缺血組比較，bP<0.05；與同組12 h比較，cP<0.05

注：細(xì)胞質(zhì)呈棕黃色為陽(yáng)性細(xì)胞，細(xì)胞結(jié)構(gòu)較為完整且胞核呈藍(lán)色者為正常細(xì)胞 圖2 各組大鼠腦缺血再灌注不同時(shí)間點(diǎn)腦組織缺血半暗帶皮層caspase-12表達(dá)(免疫組化，×400)

尤瑞克林是從人類(lèi)尿液中提取的一種由238個(gè)氨基酸組成的絲氨酸蛋白酶，能催化激肽原水解產(chǎn)生激肽，后者及其進(jìn)一步降解產(chǎn)物能與缺血部位血管細(xì)胞產(chǎn)生的 B1 受體結(jié)合發(fā)揮擴(kuò)張微動(dòng)脈的作用。因 B1 受體僅在組織受缺血損傷后由損傷的組織血管內(nèi)皮細(xì)胞誘導(dǎo)生成，故尤瑞克林可選擇性擴(kuò)張缺血區(qū)腦血管，提高缺血部位腦組織血流量，改善腦組織對(duì)氧的攝取[2，8]。近年來(lái)多項(xiàng)研究顯示，尤瑞克林的腦保護(hù)作用與多個(gè)凋亡相關(guān)因子有密切關(guān)系，可通過(guò)上調(diào)Bcl-2表達(dá)，下調(diào)caspase-3、Fas-L蛋白、Bax蛋白表達(dá)，抑制p38MAPK活化等，從而抑制神經(jīng)細(xì)胞凋亡，促進(jìn)內(nèi)源性神經(jīng)再生[9-11]，改善神經(jīng)功能缺損癥狀[12]，并被推薦用于缺血性腦血管病急性期治療[13]。同時(shí)，在臨床療效觀察中，對(duì)急性腦梗死合并2型糖尿病患者采用美國(guó)國(guó)立衛(wèi)生研究院腦卒中量表(NIHSS評(píng)分)、改良Rankin scale(mRS評(píng)分)及日常生活能力量表(ADL評(píng)分)評(píng)定尤瑞克林治療組和對(duì)照組患者療效，表明尤瑞克林治療2型糖尿病并發(fā)急性腦梗死療效顯著[14-15]，但其保護(hù)機(jī)制尚未明確。本研究結(jié)果顯示，經(jīng)尤瑞克林干預(yù)的大鼠于腦缺血再灌注后12、24和48 h其神經(jīng)功能評(píng)分及腦缺血半暗帶凋亡細(xì)胞數(shù)和caspase-12表達(dá)均低于缺血組，表明尤瑞克林對(duì)糖尿病大鼠腦缺血再灌注后的神經(jīng)功能缺損具有保護(hù)作用，其保護(hù)機(jī)制可能是通過(guò)抑制缺血半暗帶中的神經(jīng)細(xì)胞凋亡實(shí)現(xiàn)，caspase-12可能參與了尤瑞克林對(duì)糖尿病大鼠腦缺血再灌注損傷的保護(hù)機(jī)制。

綜上所述，本研究結(jié)果顯示，尤瑞克林組大鼠腦缺血再灌注12、24、48 h神經(jīng)功能評(píng)分、細(xì)胞凋亡數(shù)及caspase-12均低于缺血組，表明尤瑞克林對(duì)糖尿病大鼠局灶性腦缺血再灌注后神經(jīng)功能缺損具有保護(hù)作用，其作用機(jī)制可能是通過(guò)下調(diào)caspase-12表達(dá)從而抑制細(xì)胞凋亡有關(guān)。