李少儒，王世進(jìn)，戶瑞麗，任艷芳，文政芳

新鄉(xiāng)醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院婦產(chǎn)科，河南 新鄉(xiāng) 453100

子宮內(nèi)膜癌是一種女性生殖系統(tǒng)惡性腫瘤，其發(fā)病率呈逐年上升趨勢，具有發(fā)病隱匿、發(fā)展速度快、易轉(zhuǎn)移等特點(diǎn)，嚴(yán)重威脅女性的生命健康[1]。常見的治療子宮內(nèi)膜癌的方法有手術(shù)治療、放療及化療，這些治療方法雖然可以取得一定的效果，但往往會影響女性患者的生育功能[2-3]?；虬邢蛑委熓墙陙戆l(fā)現(xiàn)的治療惡性腫瘤的方法之一，具有靶向性強(qiáng)、不良反應(yīng)小等特點(diǎn)[4-5]。組蛋白去乙?；福╤istone deacetylase，HDAC）是一種存在于真核生物體內(nèi)的蛋白酶家族，能夠調(diào)控染色體上組蛋白的乙?；?，進(jìn)而影響細(xì)胞中基因的轉(zhuǎn)錄[6]。組蛋白去乙?；?（histone deacetylase 1，HDAC1）是HDAC蛋白家族的成員之一，參與腫瘤細(xì)胞的生長、凋亡、侵襲和遷移等過程[7]。有研究表明，HDAC1能夠影響肝癌、前列腺癌等腫瘤細(xì)胞的遷移和侵襲[8-9]。本研究以子宮內(nèi)膜癌細(xì)胞為研究對象，通過RNA干擾技術(shù)下調(diào)HDAC1基因的表達(dá)，探討HDAC1對子宮內(nèi)膜癌細(xì)胞遷移和侵襲能力的影響，以期為靶向HDAC1治療子宮內(nèi)膜癌提供理論依據(jù)，現(xiàn)報道如下。

1 材料與方法

1.1 材料

子宮內(nèi)膜癌細(xì)胞Ishikawa（高分化腺癌）購自美國模式菌種收集中心（American Type Culture Collection，ATCC）；DMEM培養(yǎng)基購自美國Sigma公司；胰蛋白酶購自美國Thermo公司；HDAC1siRNA、siRNA control均購自西寶生物科技（上海）股份有限公司；HDAC1、甘油醛-3-磷酸脫氫酶（glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase，GAPDH）引物均購自生工生物工程（上海）股份有限公司；二喹啉甲酸（bicinchoninic acid，BCA）蛋白濃度測定試劑盒購自北京索萊寶公司；RNA提取試劑盒、逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)（reverse transcription-polymerase chain reaction，RT-PCR）試劑盒均購自美國GeneCopoeia公司；基質(zhì)金屬蛋白酶2（matrix metalloprotease 2，MMP2）多克隆抗體、基質(zhì)金屬蛋白酶9（matrix metalloprotease 9，MMP9）多克隆抗體、GAPDH多克隆抗體、信號轉(zhuǎn)導(dǎo)及轉(zhuǎn)錄激活因子3（signal transduction and activator of transcription 3，STAT3）多克隆抗體、磷酸化的STAT3（p-STAT3）多克隆抗體均購自美國Abcam公司；HDAC1多克隆抗體購自美國Abgent公司。

1.2 細(xì)胞培養(yǎng)及轉(zhuǎn)染

將子宮內(nèi)膜癌細(xì)胞Ishikawa接種于含10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)液中，在37℃、飽和濕度、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。當(dāng)細(xì)胞密度達(dá)到80%時，用0.25%的胰蛋白酶消化傳代。Ishikawa細(xì)胞培養(yǎng)至對數(shù)期后，胰蛋白酶消化，采用細(xì)胞培養(yǎng)液調(diào)整細(xì)胞濃度為3×104/ml，以每孔1 ml接種于6孔細(xì)胞培養(yǎng)板中，待細(xì)胞融合度為60%時，用Lipofectamine 2000轉(zhuǎn)染試劑將HDAC1siRNA和siRNA control轉(zhuǎn)染至Ishikawa細(xì)胞中，分別作為HDAC1siRNA組和siRNA control組，轉(zhuǎn)染步驟參照Lipofectamine 2000轉(zhuǎn)染說明書，同時以不作轉(zhuǎn)染的細(xì)胞為對照組。實(shí)驗(yàn)中的HDAC1siRNA組和siRNA control組細(xì)胞均為轉(zhuǎn)染后48 h的細(xì)胞。

1.3 RT-PCR檢測HDAC1 mRNA的表達(dá)水平

HDAC1siRNA組、siRNA control組和對照組細(xì)胞培養(yǎng)48 h后，采用RNA提取試劑盒提取細(xì)胞中的RNA，采用紫外分光光度計(jì)檢測RNA樣品的濃度和純度。采用反轉(zhuǎn)錄試劑盒反轉(zhuǎn)錄合成cDNA，按照RT-PCR試劑盒使用說明書檢測基因表達(dá)水平，以GAPDH基因?yàn)閮?nèi)參，采用2-△△Ct方法計(jì)算HDAC1mRNA的表達(dá)水平。HDAC1上游引物為5'-CGCATGACTCATAAT-3'，下游引物為5'-GCTGTGGTACTTGGTCATCT-3'；GAPDH 上游引物為5'-CCAGCCATGTACGTTGCTATC-3'，下游引物為5'-CAGGTCCAGCCGACGGATGGC-3'。反應(yīng)條件：94 ℃ 3 min；94 ℃ 45 s，53 ℃ 60 s，72 ℃ 80 s，共30個循環(huán)。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.4 蛋白質(zhì)印跡法（Western blot）檢測HDAC1蛋白的表達(dá)水平

HDAC1siRNA組、siRNA control組和對照組細(xì)胞培養(yǎng)48 h后，加入裂解液，置于冰上裂解30 min后，12 000 r/min離心20 min，將蛋白上清吸取至EP管中。BCA法對蛋白樣品進(jìn)行定量，步驟參照BCA蛋白濃度測定試劑盒。取蛋白樣品，加入等體積的2×loading buffer混合后，置于100℃的孵育器中煮沸變性。每孔加入30 μg蛋白樣品進(jìn)行蛋白電泳，初始電壓為80 V，待溴酚藍(lán)進(jìn)入到分離膠后，將電壓調(diào)整到120 V直至電泳結(jié)束。在恒流100 mA、4℃條件下，將蛋白轉(zhuǎn)印至硝酸纖維素膜上，轉(zhuǎn)膜時間為70 min。5%牛血清白蛋白室溫封閉60 min，然后加入一抗（1∶1000倍稀釋，4℃孵育過夜）、二抗（1∶2000倍稀釋，37 ℃孵育60 min），電化學(xué)發(fā)光（electrochemiluminescence，ECL）顯色試劑盒顯色，以GAPDH為內(nèi)參，利用Bandscan 5.0軟件分析目的蛋白的相對表達(dá)水平。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.5 細(xì)胞劃痕實(shí)驗(yàn)檢測細(xì)胞的遷移能力

HDAC1siRNA組、siRNA control組和對照組細(xì)胞培養(yǎng)至對數(shù)期后，以2×104/ml接種于細(xì)胞培養(yǎng)瓶中培養(yǎng)過夜，待細(xì)胞完全貼壁后，吸除上清液，用200 μl的移液槍槍頭在長滿細(xì)胞的瓶壁上垂直劃出一條細(xì)痕，用磷酸鹽緩沖液（phosphate buffered saline，PBS）將劃下的細(xì)胞洗掉。加入細(xì)胞培養(yǎng)液，置于37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h。在倒置顯微鏡下觀察0 h劃痕寬度和24 h劃痕寬度，計(jì)算細(xì)胞遷移率。細(xì)胞遷移率=細(xì)胞遷移距離/0 h劃痕寬度，細(xì)胞遷移距離=0 h劃痕寬度-24 h劃痕寬度。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.6 Transwell小室檢測細(xì)胞的侵襲能力

在實(shí)驗(yàn)開始前將基質(zhì)膠加入到24孔Transwell小室中，并將Transwell小室置于37℃培養(yǎng)箱中濕化3 h，待基質(zhì)膠凝固后，用不含胎牛血清的細(xì)胞培養(yǎng)液繼續(xù)孵育40 min。取200 μl的HDAC1siRNA組、siRNA control組和對照組細(xì)胞懸浮液（無血清的培養(yǎng)液調(diào)整細(xì)胞濃度為4×104/ml）加入Transwell小室的上室，在小室的下室加入500 μl含有胎牛血清的細(xì)胞培養(yǎng)液。培養(yǎng)24 h后，取出Transwell小室，用棉簽將沒有穿膜的細(xì)胞擦掉，PBS洗滌，多聚甲醛固定，結(jié)晶紫染色后，在顯微鏡下隨機(jī)選取5個視野觀察侵襲細(xì)胞數(shù)目。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.7 Western blot檢測 MMP2、MMP9、STAT3、p-STAT3蛋白的表達(dá)水平

HDAC1siRNA組、siRNA control組和對照組細(xì)胞繼續(xù)培養(yǎng)24 h后，按照1.4中Western blot方法檢測細(xì)胞中MMP2、MMP9、STAT3、p-STAT3蛋白的表達(dá)水平。

1.8 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用SPSS 22.0軟件對-數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，多組間比較采用F檢驗(yàn)，多組間兩兩比較采用SNK-q檢驗(yàn)。以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 3組細(xì)胞中HDAC1 mRNA和HDAC1蛋白表達(dá)水平的比較

RT-PCR和Western blot檢測結(jié)果顯示，HDAC1siRNA組中HDAC1mRNA和HDAC1蛋白的表達(dá)水平均低于對照組和siRNA control組，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）；對照組和siRNA control組中HDAC1mRNA和HDAC1蛋白的表達(dá)水平比較，差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。（表1、圖1）

表1 3組細(xì)-胞中HDAC1 mRNA和HDAC1蛋白表達(dá)水平的比較（±s）

表1 3組細(xì)-胞中HDAC1 mRNA和HDAC1蛋白表達(dá)水平的比較（±s）

注：a與對照組比較，P＜0.05；b與siRNAcontrol組比較，P＜0.05

HDAC1 mRNA 1.00±0.08 1.02±0.09 0.28±0.04a b 1.12±0.14 1.13±0.10 0.36±0.06a b對照組siRNAcontrol組HDAC1 siRNA組HDAC1蛋白組別

圖1 Western blot檢測HDAC1蛋白表達(dá)

2.2 細(xì)胞遷移率的比較

細(xì)胞劃痕實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，對照組和siRNA control組的細(xì)胞遷移率比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。HDAC1siRNA組的細(xì)胞遷移率低于對照組和siRNA control組，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。（表 2）

表2 3組細(xì)胞遷移率的比較（%，±s）

表2 3組細(xì)胞遷移率的比較（%，±s）

注：a與對照組比較，P＜0.05；b與siRNAcontrol組比較，P＜0.05

細(xì)胞遷移率63.84±6.26 64.25±6.11 28.56±3.97a b對照組siRNAcontrol組HDAC1 siRNA組組別

2.3 細(xì)胞侵襲數(shù)目的比較

對照組和siRNA control組的侵襲細(xì)胞數(shù)目比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。HDAC1siRNA組的侵襲細(xì)胞數(shù)目少于對照組和siRNA control組，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。（表3）

表3 3組侵襲細(xì)胞數(shù)目的比較（個，±s）

表3 3組侵襲細(xì)胞數(shù)目的比較（個，±s）

注：a與對照組比較，P＜0.05；b與siRNAcontrol組比較，P＜0.05

組別對照組siRNAcontrol組HDAC1 siRNA組125.36±11.87 129.42±12.55 69.23±8.34a b侵襲細(xì)胞數(shù)目

2.4 3組細(xì)胞中MMP2、MMP9、STAT3、p-STAT3蛋白表達(dá)水平的比較

對照組和 siRNA control組中 MMP2、MMP9、STAT3、p-STAT3蛋白的表達(dá)水平比較，差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。HDAC1siRNA組中MMP2、MMP9、p-STAT3蛋白的表達(dá)水平均低于對照組和siRNA control組，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。（圖2、表4）

圖2 Western blot檢測MMP2、MMP9、STAT3、p-STAT3蛋白表達(dá)

表4 3組細(xì)胞中MMP2、MMP9、STAT3、p-STAT3蛋白表達(dá)水平的比較（±s）

表4 3組細(xì)胞中MMP2、MMP9、STAT3、p-STAT3蛋白表達(dá)水平的比較（±s）

注：a與對照組比較，P＜0.05；b與siRNAcontrol組比較，P＜0.05

組別對照組siRNAcontrol組HDAC1 siRNA組MMP2 0.92±0.11 0.93±0.13 0.37±0.06a b MMP9 0.82±0.06 0.81±0.08 0.30±0.05a b STAT3 1.55±0.13 1.58±0.12 1.57±0.15 p-STAT3 0.87±0.07 0.85±0.10 0.36±0.04a b

3 討論

哺乳動物體內(nèi)一共有18種HDAC，分為4大類，其中HDAC1是位于細(xì)胞核內(nèi)的HDAC成員之一，可以使DNA核心區(qū)域組蛋白帶正電荷，從而增加組蛋白與負(fù)電荷DNA結(jié)合的能力，調(diào)控基因的轉(zhuǎn)錄[10]。HDAC1基因編碼的蛋白質(zhì)由482個氨基酸組成，與核小體結(jié)構(gòu)改變、DNA轉(zhuǎn)錄抑制因子的表達(dá)有關(guān)，對細(xì)胞凋亡具有抑制作用[11-12]。HDAC1在腫瘤組織中過表達(dá)，能夠增加腫瘤細(xì)胞的增殖能力，促進(jìn)細(xì)胞外基質(zhì)降解，從而促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的遷移[13]。研究表明，HADC1能夠影響卵巢癌細(xì)胞株的黏附、侵襲及遷移過程[14]。季佳文[15]的研究表明，白藜蘆醇作用于子宮內(nèi)膜癌細(xì)胞后HDAC1的表達(dá)水平下降，細(xì)胞的增殖、遷移和侵襲能力下降，提示HDAC1可能與子宮內(nèi)膜癌細(xì)胞的遷移和侵襲有關(guān)。本研究結(jié)果顯示，干擾HDAC1表達(dá)后的子宮內(nèi)膜癌細(xì)胞的侵襲和遷移能力降低，與之前的研究報道相符，說明HDAC1表達(dá)下調(diào)能夠抑制子宮內(nèi)膜癌的轉(zhuǎn)移能力。

基質(zhì)金屬蛋白酶家族含有26個家族成員，由于需要依賴鋅、鈣等金屬離子的輔助而得名，具有降解細(xì)胞外基質(zhì)的作用，因其作用的底物不同可以分為基質(zhì)溶解素、明膠酶、膠原酶等，與腫瘤細(xì)胞的遷移和侵襲有關(guān)[16-18]。MMP2和MMP9屬于Ⅳ型膠原酶，在已知的基質(zhì)金屬蛋白酶家族成員中作用最為廣泛，能夠促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的遷移和侵襲[19]。研究表明，MMP2和MMP9在多種腫瘤組織中表達(dá)上調(diào)，而干擾其表達(dá)后腫瘤細(xì)胞的侵襲能力下降[20]。本研究結(jié)果顯示，干擾HDAC1表達(dá)后的子宮內(nèi)膜癌細(xì)胞中MMP2和MMP9的表達(dá)水平下降，提示HDAC1表達(dá)下調(diào)可能通過抑制MMP2和MMP9的表達(dá)阻礙子宮內(nèi)膜癌細(xì)胞的遷移和侵襲。

STAT3是一種廣泛存在于生物體內(nèi)的信號通路，在組織胚胎發(fā)育、疾病發(fā)生、免疫調(diào)節(jié)等過程中均發(fā)揮重要作用[21]。STAT3磷酸化后生成的p-STAT3可激活STAT3信號通路，促進(jìn)細(xì)胞生長，STAT3信號通路在腫瘤組織中過度激活，能夠促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的遷移和侵襲[22]。本研究結(jié)果顯示，干擾HDAC1表達(dá)后的子宮內(nèi)膜癌細(xì)胞中p-STAT3的表達(dá)水平下降，提示HDAC1可能通過作用于STAT3信號通路影響子宮內(nèi)膜癌細(xì)胞的遷移和侵襲能力。

本研究為進(jìn)一步探討HDAC1在子宮內(nèi)膜癌中的作用及機(jī)制奠定了基礎(chǔ)，為HDAC1靶向治療子宮內(nèi)膜癌提供了新思路。本研究僅探討了子宮內(nèi)膜癌中HDAC1與STAT3信號通路的關(guān)系，后續(xù)將進(jìn)一步深入探討HDAC1與其他相關(guān)信號通路的作用，并在多株子宮內(nèi)膜癌細(xì)胞及體內(nèi)進(jìn)行驗(yàn)證。

綜上所述，干擾HDAC1的表達(dá)可能通過抑制STAT3信號通路的激活和MMP2、MMP9的表達(dá)，抑制子宮內(nèi)膜癌細(xì)胞的遷移和侵襲能力。