黃羅丹，安春艷，劉德陽，潘裕添

(閩南師范大學 菌物產(chǎn)業(yè)工程技術中心，福建 漳州363000)

桑黃是一種中國的傳統(tǒng)藥用真菌，自古以來被奉為珍稀藥材。近幾十年來，國內外科學家們在桑黃的人工栽培技術、生物學特性研究、藥理活性研究等方面開展了廣泛的研究[1]?，F(xiàn)今已成為國際上公認的癌癥治療領域中藥效最為顯著的抗癌真菌之一[2-3]，其抗癌效果顯著高于靈芝、阿加里斯茸等同類真菌[4]。但桑黃抗腫瘤的物質基礎尚未定論。本研究從液體發(fā)酵培養(yǎng)的桑黃菌落中提取得到總黃酮，對其藥物毒性以及抗腫瘤活性進行檢測。

1 材料與方法

1.1 菌種來源

桑黃菌菌株(由閩南師范大學菌物產(chǎn)業(yè)工程中心提供)，經(jīng)鑒定為火木層菌屬。

1.2 試劑

麥芽浸粉(天津化學試劑廠)；乙酸乙酯(天津永大試劑廠)；甲醇(山東禹王試劑廠)；胎牛血清(南美PAN Biotech)培養(yǎng)基(MEM1640，美國Gibco公司)；胰蛋白酶，MTS(Amresco)。

1.3 細胞

小鼠成纖維細胞L929，人肝癌細胞HepG-2，上述細胞均由閩南師范大學菌物工程產(chǎn)業(yè)技術中心提供。

2 體外抗腫瘤實驗

2.1 桑黃菌總黃酮的制備

液體發(fā)酵培養(yǎng)桑黃菌20 d，用乙酸乙酯萃取發(fā)酵液，反復3次。將萃取物低溫旋轉蒸發(fā)器中蒸發(fā)至恒重，得到粗提物。菌絲體加入甲醇，超聲破碎，濾去固體后液體同用上述方法萃取，液體蒸發(fā)至恒重。產(chǎn)物用1∶1比例的氯仿∶甲醇洗出，再次蒸發(fā)至恒重，得到粗提物。濾液回收乙醇至無醇味后，分次加到AB-8 大孔樹脂柱上[5]。2 倍柱體積的超純水洗滌，洗滌液棄去。繼續(xù)用5 倍柱體積的體積分數(shù)70% 乙醇洗脫，收集洗脫液，減壓濃縮，減壓干燥，粉碎，得桑黃總黃酮[5-6]。

2.2 樣品溶液的制備

黃酮溶液的制備：用胎牛血清體積濃度為10%的1640完全培養(yǎng)基稀釋以DMSO溶解的總黃酮配置成100 μg/mL的黃酮溶液，使溶液最后DMSO體積占比為黃酮溶液總體積的0.1%，再經(jīng)0.22 μm微孔過濾器過濾除菌。實驗梯度分別設為10 ,20,50,100 μg/mL，使用時用1640培養(yǎng)基稀釋[7]。

2.3 MTS法檢測細胞活力

細胞培養(yǎng)：用胎牛血清體積10%的1640完全培養(yǎng)基傳代培養(yǎng)，將培養(yǎng)至處于對數(shù)生長期的細胞用體積濃度0.25%胰酶消化下來，加培養(yǎng)基終止消化后1000 r/min，離心5 min去除胰酶影響，加入適當培養(yǎng)基調整細胞濃度至30×104個/mL，配制成細胞懸液。按1 mL/皿的量接種于直徑9 cm塑料培養(yǎng)皿中，放入37 ℃，5% CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)24 h后，分別用濃度為10 μg/mL，20 μg/mL ，50 μg/mL，100 μg/mL的黃酮樣品溶液10 mL進行換液，以體積濃度為10%的1640完全培養(yǎng)基作為空白對照，各3個重復。

2.4 總黃酮對細胞的毒性測定

將培養(yǎng)至處于對數(shù)生長期的L929、HepG-2細胞用體積濃度0.25%胰酶消化下來，加培養(yǎng)基終止消化后1000 r/min，離心5 min去除胰酶影響，加入適當培養(yǎng)基調整細胞濃度至5×104個/mL，配制成細胞懸液。以每孔100 μL接種量均勻接種于96孔板中，靜置30 min，保證細胞均勻沉淀。將孔板放入37 ℃，5% CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)24 h。將96孔板中舊液去除，加入200 μL的總黃酮樣品溶液，分別設置濃度為0 μg/mL，10 μg/mL，50 μg/mL，100 μg/mL，每組8個重復，以僅加藥但無細胞組作為背景對照，繼續(xù)培養(yǎng)。分別取24 h，48 h和72 h定時測量。測量前每孔中加入20 μL的MTS，放入37 ℃，5% CO2培養(yǎng)箱繼續(xù)培養(yǎng)4 h，然后在波長490 nm處用酶標儀進行測量[6-8]。

相對生長率計算公式：RGR值=A樣品組*100%/A樣品空白組。

1) 總黃酮對HepG-2細胞的細胞形態(tài)影響。分別選擇24 h，48 h，72h的空白組和加藥組的細胞拍照，統(tǒng)一放大倍數(shù)為100倍。

2) 總黃酮對腫瘤細胞周期的影響。將培養(yǎng)至對數(shù)生長期的細胞用體積濃度0.25%胰酶消化下來，加培養(yǎng)基終止消化后1000 r/min，離心5 min去除胰酶影響，加入適當培養(yǎng)基調整細胞濃度至30×104個/mL，配制成細胞懸液。按1 mL/皿的量接種于直徑為9 cm塑料培養(yǎng)皿中，加入9 mL的體積濃度10%的1640培養(yǎng)基，搖勻，放入37 ℃，5% CO2培養(yǎng)箱過夜培養(yǎng)。將培養(yǎng)皿中舊液去除，每皿加入10 mL 的含總黃酮的10%的1640稀釋的樣品溶液，設置濃度為0 μg/mL，10 μg/mL，50 μg/mL，100 μg/mL，每個濃度3個重復，放入37 ℃，5% CO2培養(yǎng)箱繼續(xù)培養(yǎng)24 h后定時測量。每皿測量前需要用體積濃度0.25%胰酶消化下來，加培養(yǎng)基終止消化后1000 r/min，離心5 min去除胰酶影響，冰PBS洗3遍，轉入1.5 mL EP管中，加入70 %乙醇將細胞沉淀吹打均勻后-20 ℃ 固定4 h，離心去除固定液，再加入999 μL 冰PBS將細胞沉淀吹打均勻后加入1 μL DAPI染料，避光浸染5 min，37 ℃。上樣，用流式細胞儀測量，進行數(shù)據(jù)分析[9-11]。

3 體外抗腫瘤實驗結果

3.1 MTS細胞毒性檢測結果

不同質量濃度(0 μg/mL，10 μg/mL，50 μg/mL，100 μg/mL)的桑黃總黃酮分別作用于L929和HepG-2細胞24h后，使用酶標儀檢測其吸光度值。結果顯示，隨著桑黃黃酮濃度的梯度增加，L929正常細胞未發(fā)生分化，且各個濃度藥物對其細胞活力無明顯抑制作用；而HepG-2細胞在C組和D組濃度出現(xiàn)細胞形態(tài)的變化，細胞總活力隨藥物濃度的升高呈梯度降低趨勢。這表明總黃酮在各實驗組質量濃度的藥物下對正常細胞的細胞活力無明顯抑制作用，而高濃度的劑量條件下(50 μg/mL，100 μg/mL)對HepG-2腫瘤細胞會促進其細胞形態(tài)分化，抑制其細胞增殖，如圖1—圖3所示。

(a)對照組 (b)10 μg/mL總黃酮組

(c)50 μg/mL總黃酮組 (d)100 μg/mL總黃酮組圖1 不同濃度桑黃總黃酮對HepG-2細胞形態(tài)影響Fig.1 Effect of different concentrations of total flavonoids on cell morphology

用不同濃度的桑黃總黃銅樣品溶液分別培養(yǎng)HepG-2細胞24 h，48 h，72 h，其細胞狀態(tài)與空白組對照存在差異， 圖1(a)與圖1(b)箭頭所指細胞形態(tài)未發(fā)生改變，隨著培養(yǎng)時間的增長細胞數(shù)量逐漸增多以及濃度的增大，圖1(c)和圖1(d)圖細胞形態(tài)由開始的多邊形逐漸生長至有狹長的觸角生成的條狀，基本沒有死細胞漂浮。

圖2 不同質量濃度總黃酮對L929細胞的毒性檢測結果Fig.2 Toxicity of different concentrations of Total flavonoids to L929 cells

圖3 不同質量濃度總黃酮對HepG-2細胞的毒性檢測結果Fig.3 Toxicity of different concentrations of total flavonoids to HepG-2 cells

圖2和圖3中對照組均為藥品作用濃度為0 μg/mL時所測量的吸光度比值。*代表ρ<0.05，**ρ<0.01，***ρ<0.001。

3.2 不同質量濃度桑黃總黃酮對L929、HepG-2細胞周期影響實驗

不同質量濃度的桑黃總黃酮分別作用于L929和HepG-2細胞24 h后，采用流式細胞儀分析其周期[12-13]。結果顯示，隨著桑黃黃酮濃度的增加，L929細胞的細胞周期總體不同時期細胞比例大致相同，不隨總黃酮濃度的上升而發(fā)生改變；反之，HepG-2細胞的G1期細胞總比例隨黃酮濃度的增加而逐漸減少，S+G2期細胞總比例隨濃度依賴性上升；表明桑黃總黃酮在實驗組的質量濃度下對于正常細胞的周期無阻滯作用，對于腫瘤細胞HepG-2的S+G2期有阻滯作用。不同質量濃度桑黃總黃酮作用于L929和HepG-2細胞的周期影響見表1,表2及圖3和圖4。

表1 流式細胞儀檢測L929細胞周期

表2 流式細胞儀檢測HepG-2細胞周期

(a)對照組 (b)10 μg/ml總黃酮組 (c)50 μg/ml總黃酮組 (d)100 μg/ml總黃酮組圖4 不同質量濃度桑黃總黃酮對L929細胞的周期影響Fig.4 Effects of flavonoids from Phellinus igniarius with different concentrations on the cycle of L929 Cells

(a)對照組 (b)10 μg/ml總黃酮組 (c)50 μg/ml總黃酮組 (d)100 μg/ml總黃酮組圖5 不同質量濃度桑黃總黃酮對HepG-2細胞的周期影響Fig.5 Effects of flavonoids from Phellinus igniarius with different concentrations on the cell cycle of HepG-2 Cells

4 結束語

在近幾年的實驗研究以及醫(yī)學治療中，藥用真菌桑黃已經(jīng)越來越多地被應用于抗腫瘤方面，作為化療藥物而使用。其主要抗腫瘤有效成分多糖和黃酮在癌癥中的作用機制，以及如何增強機體免疫力的原理，現(xiàn)今仍缺乏強有力的研究數(shù)據(jù)。據(jù)科學研究表明，桑黃的黃酮能夠直接作用于HepG-2腫瘤細胞，抑制其增殖，并能夠調節(jié)機體免疫力，從而間接達到抗癌作用。本研究顯示，使用L929正常細胞與HepG-2腫瘤細胞在相同的藥物和質量濃度條件下，桑黃總黃酮具有體外抗癌作用，并且具有劑量依賴性。本次實驗所用的最大質量濃度100 μg/mL對于正常細胞無明顯毒性作用，在劑量安全性范圍內。而桑黃總黃酮抑制細胞的機制可能與阻滯腫瘤細胞的細胞周期S+G2期有關。