郭苗苗，楊理凱，杜偉立，張濤，路宏朝，王令

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CRISPR/Cas9介導(dǎo)的外源基因靶向插入雞EAV-HP基因組

郭苗苗，楊理凱，杜偉立，張濤，路宏朝，王令

陜西理工大學(xué) 生物科學(xué)與工程學(xué)院，陜西 漢中 723000

郭苗苗, 楊理凱, 杜偉立, 等. CRISPR/Cas9介導(dǎo)的外源基因靶向插入雞EAV-HP基因組. 生物工程學(xué)報(bào), 2019, 35(2): 236–243.Guo MM, Yang LK, Du WL, et al. CRISPR/Cas9-mediated foreign gene targeted knock-in into the chicken EAV-HP genome. Chin J Biotech, 2019, 35(2): 236–243.

本研究旨在通過CRISPR/Cas9介導(dǎo)外源基因靶向插入雞EAV-HP基因組。首先設(shè)計(jì)特異性引物并擴(kuò)增雞內(nèi)源性病毒 (EAV-HP) 左右同源臂和增強(qiáng)型綠色熒光蛋白 (eGFP) 基因表達(dá)盒，然后通過重疊延伸PCR技術(shù)將兩個(gè)同源臂DNA連接至eGFP表達(dá)盒兩側(cè)，獲得全長DNA片段LER，并克隆至pMD19-T載體，獲得攜帶基因的供體載體pMDT-LER。隨后在HEK293T細(xì)胞中驗(yàn)證供體載體pMDT-LER能成功表達(dá)后，將EAV-HP打靶載體和供體載體共轉(zhuǎn)染至DF-1細(xì)胞，觀察綠色熒光陽性細(xì)胞，提取細(xì)胞基因組，PCR檢測外源基因成功整合至雞基因組EAV-HP位點(diǎn)。最后，將轉(zhuǎn)基因細(xì)胞DF-1傳至第7代，用PCR和Western blotting檢測在轉(zhuǎn)基因細(xì)胞中穩(wěn)定表達(dá)。文中初步驗(yàn)證外源基因能整合至雞EAV-HP位點(diǎn)并穩(wěn)定表達(dá)，為轉(zhuǎn)基因雞的研究提供新整合位點(diǎn)。

CRISPR/Cas9，雞內(nèi)源性病毒，EAV-HP，整合位點(diǎn)，供體載體

基因編輯技術(shù)可以實(shí)現(xiàn)生物體基因組特定DNA序列靶向性修飾，其作為強(qiáng)大的現(xiàn)代生物技術(shù)，涉及到生物學(xué)基礎(chǔ)研究和生物醫(yī)學(xué)等諸多領(lǐng)域，具有廣闊的應(yīng)用前景和商業(yè)價(jià)值[1-2]。精準(zhǔn)的基因編輯技術(shù)對(duì)生物學(xué)研究具有重要意義，且是基因疾病治療的有效途徑[3-4]。最新的基因編輯技術(shù)CRISPR/Cas9是在細(xì)菌和古菌的免疫系統(tǒng)基礎(chǔ)上優(yōu)化改造而來，因簡便、高效且成本低的優(yōu)點(diǎn)，已被研究者廣泛使用。CRISPR/Cas9可通過單個(gè)引導(dǎo)RNA (sgRNA) 介導(dǎo)Cas9蛋白識(shí)別目標(biāo)序列并切斷DNA雙鏈，使機(jī)體以同源重組或非同源末端連接的方式修復(fù)受損DNA，從而實(shí)現(xiàn)對(duì)目標(biāo)基因的靶向敲除、敲入和修正等目的[5-8]。人們對(duì)基因編輯的產(chǎn)物安全性質(zhì)疑主要是外源基因的插入影響整合位點(diǎn)附近基因序列、染色體結(jié)構(gòu)的改變是否造成內(nèi)源基因的破壞以及是否會(huì)激活原本己關(guān)閉的基因等不確定因素[9]。所以在基因編輯技術(shù)中，編輯位點(diǎn)尤為重要[10-11]。

相對(duì)于小鼠等模式生物的基因組編輯研究，雞轉(zhuǎn)基因研究發(fā)展比較滯后[12-13]。目前，人基因組中腺相關(guān)病毒整合位點(diǎn)1 (Adeno-associated virus integration site 1, AAVS1) 和小鼠的ROSA26位點(diǎn)已被證實(shí)是安全可靠的外源基因整合位點(diǎn)，且小鼠還有更多的位點(diǎn)正在被發(fā)掘，如基因位點(diǎn)[14]。但鳥類模式生物——雞的轉(zhuǎn)基因安全位點(diǎn)的相關(guān)報(bào)道較少，因此限制了轉(zhuǎn)基因雞的研究。

雞基因組中含有多種內(nèi)源性病毒，與雞協(xié)同進(jìn)化而穩(wěn)定存在于雞基因組中[15-16]。但將這些內(nèi)源性病毒位點(diǎn)作為外源基因整合位點(diǎn)而制備轉(zhuǎn)基因雞的相關(guān)研究還未見報(bào)道。本研究針對(duì)雞內(nèi)源性病毒中的一個(gè)亞科EAV-HP基因組序列，設(shè)計(jì)靶向位點(diǎn)，用CRISPR/Cas9剪切EAV-HP基因序列并插入供體基因，探索EAV-HP是否為雞基因組編輯的有效位點(diǎn)，為轉(zhuǎn)基因雞的研究提供新思路。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

CRISPR/Cas9骨架載體pX330-U6-CBh-hSpCas9購自Addgene公司；表達(dá)EAV-HP靶序列HPT1 sgRNA的CRISPR/Cas9表達(dá)載體pX330-U6- HPT1-CBh-hSpCas9由本實(shí)驗(yàn)室構(gòu)建[17]；質(zhì)粒pCD513B、HEK293T細(xì)胞系和雞DF-1細(xì)胞系由本實(shí)驗(yàn)室保存；大腸桿菌TOP10感受態(tài)細(xì)胞由本實(shí)驗(yàn)室制備。

2×PCR MasterMix，DNA聚合酶，d Ⅲ、RⅠ、HⅠ、Ⅰ內(nèi)切酶購自NEB公司；TA克隆試劑盒購自西安寶生物公司；DMEM培養(yǎng)基、Superfect細(xì)胞轉(zhuǎn)染試劑、OPTI-MEM、青霉素和鏈霉素、DNA回收試劑盒、質(zhì)粒提取試劑盒等購自西安沃爾森生物技術(shù)有限公司；高糖DMEM培養(yǎng)基、胎牛血清均購自Gibco公司；0.25%胰酶購自Invitrogen公司；增強(qiáng)型綠色熒光蛋白鼠源多克隆抗體購自ABclonal生物技術(shù)公司；辣根過氧化物標(biāo)記羊抗鼠二抗購自康為世紀(jì)生物科技有限公司。

1.2 供體載體的構(gòu)建

1.2.1 PCR引物設(shè)計(jì)

根據(jù)雞EAV-HP基因組序列 (GenBank登錄號(hào)NC_005947) 和增強(qiáng)型綠色熒光蛋白 (eGFP) 表達(dá)盒序列特征，利用軟件Primer Premier 5.0設(shè)計(jì)擴(kuò)增同源臂和基因的特異引物，引物信息見表1。

1.2.2 EAV-HP左右同源臂DNA片段及eGFP表達(dá)盒擴(kuò)增

以雞基因組DNA為模板，使用特異性引物ArmL-F和ArmL-R擴(kuò)增EAV-HP左側(cè)同源臂片段；ArmR-F和ArmR-R引物擴(kuò)增EAV-HP右側(cè)同源臂DNA片段。同時(shí)，以eGFP-F和eGFP-R為引物，質(zhì)粒pCD513B為模板，擴(kuò)增表達(dá)盒DNA片段。PCR產(chǎn)物經(jīng)10 g/L瓊脂糖凝膠電泳檢測，然后用DNA回收試劑盒純化3種PCR產(chǎn)物，測濃度后保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.3 重疊PCR連接DNA片段

將EAV-HP左右同源臂和基因的PCR產(chǎn)物以分子個(gè)數(shù)比1∶1∶1的原則混合后作為模板，加入引物ArmL-F、ArmR-R，利用重疊延伸PCR將與左右同源臂連接，形成DNA長片段，簡稱LER。瓊脂糖凝膠電泳檢測重疊延伸PCR產(chǎn)物L(fēng)ER，并將純化的LER片段TA克隆至pMD19-T載體，篩選陽性克隆并提取質(zhì)粒，通過酶切和測序鑒定，獲得供體載體pMDT-LER。

表1 本研究所用引物

Note: the underlined part of the eGFP-F primer sequence is the EAV-HP left homologue arm downstream sequence; the underlined part of the eGFP-R primer sequence is the EAV-HP right homology arm upstream part sequence.

1.3 eGFP表達(dá)驗(yàn)證

HEK293T細(xì)胞培養(yǎng)于DMEM培養(yǎng)基 (10% FBS，青、鏈霉素雙抗)，37 ℃、5% CO2條件下培養(yǎng)。轉(zhuǎn)染前一天，胰酶消化HEK293T細(xì)胞并傳代至6孔板，當(dāng)細(xì)胞密度達(dá)到60%–80%時(shí)，分別配置質(zhì)粒pCD513B和pMDT-LER與Superfect轉(zhuǎn)染試劑混合液，并分別加入細(xì)胞培養(yǎng)板中，完成轉(zhuǎn)染。轉(zhuǎn)染24 h后在熒光顯微鏡下觀察綠色熒光陽性細(xì)胞，以驗(yàn)證供體載體中基因表達(dá)情況。

1.4 打靶載體和供體載體共轉(zhuǎn)染雞細(xì)胞系

DF-1細(xì)胞培養(yǎng)于DMEM培養(yǎng)基 (10% FBS，青、鏈霉素雙抗)，37 ℃、5% CO2條件下培養(yǎng)。轉(zhuǎn)染前，將細(xì)胞傳代至6孔板中，待細(xì)胞密度達(dá)到60%時(shí)即可轉(zhuǎn)染。打靶載體pX330-U6-HPT1- CBh-hSpCas9[17]和供體載體pMDT-LER各取1 μg，制備質(zhì)粒和轉(zhuǎn)染試劑混合液，混合液加入DF-1細(xì)胞培養(yǎng)板中，輕輕搖晃培養(yǎng)板使其混勻后置于CO2培養(yǎng)箱。以轉(zhuǎn)染空載體pX330-U6-CBh-hSpCas9 和pMD19-T的細(xì)胞為對(duì)照。轉(zhuǎn)染24 h后更換新鮮培養(yǎng)基，在倒置熒光顯微鏡下觀察細(xì)胞的綠色熒光情況。細(xì)胞轉(zhuǎn)染72 h后，收集細(xì)胞，用0.25%胰酶消化細(xì)胞，吹打形成單個(gè)細(xì)胞，PBS清洗 2次，1 000 r/min離心5 min后棄上清，再用PBS重新清洗2次；調(diào)整細(xì)胞密度為106個(gè)/mL，用流式細(xì)胞儀檢測陽性細(xì)胞率，同時(shí)以未轉(zhuǎn)染的細(xì)胞作為陰性對(duì)照。

提取轉(zhuǎn)染細(xì)胞基因組，利用檢測引物chF和chR (表1) 檢測基因是否整合至DF-1細(xì)胞基因組中。為驗(yàn)證外源基因在細(xì)胞增殖過程中是否穩(wěn)定遺傳并表達(dá)，將轉(zhuǎn)染細(xì)胞傳代至第7代，再次收集細(xì)胞，提取基因組，用引物ArmL-F與ArmR-R檢測靶向插入，同時(shí)提取細(xì)胞總蛋白，以增強(qiáng)型綠色熒光蛋白鼠源多克隆抗體為一抗，以羊抗鼠IgG為二抗，利用Western blotting檢測蛋白表達(dá)。

2 結(jié)果與分析

2.1 供體載體構(gòu)建及鑒定

本研究構(gòu)建的供體載體含表達(dá)盒，其兩邊攜帶EAV-HP同源序列。首先利用PCR擴(kuò)增EAV-HP的左右同源臂以及表達(dá)盒，然后通過重疊延伸PCR將3個(gè)DNA片段連接，其PCR產(chǎn)物簡稱LER。最后利用TA克隆將LER片段插入T載體pMD19-T，經(jīng)菌落PCR、酶切鑒定和DNA測序，證明LER片段成功克隆至T載體，且無突變，獲得重組載體pMDT-LER (圖1A)。該重組載體將為CRISPR/Cas9介導(dǎo)基因靶向插入雞EAV-HP位點(diǎn)提供供體DNA (圖1B)。

2.2 供體載體表達(dá)驗(yàn)證

轉(zhuǎn)染pCD513B質(zhì)粒的陽性對(duì)照細(xì)胞觀察到綠色熒光，同時(shí)轉(zhuǎn)染供體載體pMDT-LER的HEK293T細(xì)胞亦觀察到明顯的綠色熒光，結(jié)果表明，pMDT-LER重組載體攜帶的外源基因可在HEK293T細(xì)胞中表達(dá) (圖2)。

2.3 轉(zhuǎn)基因細(xì)胞系檢測

將CRISPR/Cas9表達(dá)載體和供體DNA共轉(zhuǎn)染至DF-1細(xì)胞，24 h后觀察綠色熒光，并利用流式細(xì)胞儀檢測綠色熒光陽性細(xì)胞。結(jié)果顯示，陽性細(xì)胞約占50%，說明供體載體成功導(dǎo)入DF-1細(xì)胞，基因獲得表達(dá) (圖3A)。PCR結(jié)果顯示實(shí)驗(yàn)組獲得特異性DNA條帶，而對(duì)照組無條帶，與理論相符，在DNA水平確定了外源基因的靶向整合 (圖3B)。

將轉(zhuǎn)染細(xì)胞傳代至第7代，收集細(xì)胞，分別提取細(xì)胞基因組和總蛋白，再次利用PCR和Western blotting檢測基因及表達(dá)產(chǎn)物。PCR結(jié)果表明外源基因在DF-1細(xì)胞增殖過程中沒有丟失 (圖4A)。Western blotting結(jié)果顯示，在轉(zhuǎn)基因雞細(xì)胞中高效表達(dá) (圖4B)。上述結(jié)果進(jìn)一步表明，外源基因通過同源重組的方式成功整合進(jìn)雞細(xì)胞EAV-HP基因組中，并穩(wěn)定存在和高效表達(dá)。

圖1 CRISPR/Cas9介導(dǎo)外源基因eGFP插入雞EAV-HP位點(diǎn)示意圖(A：供體載體結(jié)構(gòu)示意圖；B：供體載體整合至雞基因組原理示意圖)

圖2 HEK293T細(xì)胞水平驗(yàn)證eGFP表達(dá)

圖3 轉(zhuǎn)eGFP基因的DF-1細(xì)胞檢測(A：熒光觀察eGFP基因表達(dá)；B：PCR檢測eGFP基因)

圖4 第7代轉(zhuǎn)基因DF-1細(xì)胞檢測(A：PCR檢測目標(biāo)基因；B：Western blotting檢測綠色熒光蛋白)

3 討論

雞作為世界上存在數(shù)量最多的禽類，與人們的生活密切相關(guān)[18]。與轉(zhuǎn)基因牛、羊等哺乳動(dòng)物相比，轉(zhuǎn)基因雞可以作為更快速和更豐富的生物制藥來源[12,19-20]。但是自20世紀(jì)80年代開始，禽類的轉(zhuǎn)基因研究進(jìn)展一直較為緩慢，其主要問題是外源基因的轉(zhuǎn)入無法有效地整合進(jìn)基因組中，大多以游離狀態(tài)存在于細(xì)胞中，在遺傳過程中出現(xiàn)丟失現(xiàn)象，不能穩(wěn)定遺傳給下一代。所以在轉(zhuǎn)基因雞的研究中，尋找到能完整整合、表達(dá)并能穩(wěn)定遺傳的外源基因插入位點(diǎn)是關(guān)鍵性問題。

內(nèi)源性逆轉(zhuǎn)錄病毒基因EAV-HP屬于內(nèi)源性禽逆轉(zhuǎn)錄病毒科的一個(gè)亞科。家雞EAV-HP的基因缺失表現(xiàn)為部分基因、整個(gè)基因和部分基因的缺失，野雞的EAV-HP含有完整的基因[21-22]，這些缺失和突變導(dǎo)致EAV-HP基因組不轉(zhuǎn)錄或以極低的水平轉(zhuǎn)錄部分mRNA，且不能翻譯形成活性蛋白，不產(chǎn)生病毒體[23]。上述研究結(jié)果表明，在進(jìn)化過程中EAV-HP穩(wěn)定存在于雞基因組，無病毒活性，且不影響雞的正常生長發(fā)育，是潛在的外源基因插入的安全位點(diǎn)。基于上述發(fā)現(xiàn)，本研究將外源基因整合至EAV-HP位點(diǎn)，在DNA和蛋白水平證明了能穩(wěn)定遺傳和高效表達(dá)。2003年有研究發(fā)現(xiàn)，雞SLCO1B3基因5￠端區(qū)域整合的EAV-HP 3￠LTR序列增強(qiáng)了SLCO1B3的表達(dá)，使雞蛋表現(xiàn)出綠殼性狀[24]，此研究結(jié)果說明，EAV-HP基因組部分元件可能對(duì)臨近的基因表達(dá)有增強(qiáng)作用。但是，其元件是否對(duì)整合的外源基因表達(dá)有調(diào)控作用尚不清楚，外源基因插入位點(diǎn)的不同和外源基因啟動(dòng)子的差異是否會(huì)影響整合效率及遺傳穩(wěn)定性也有待進(jìn)一步研究。

基因組編輯技術(shù)是指在細(xì)胞基因組靶位點(diǎn)引入核酸序列變化的一類技術(shù)，包括堿基的插入、缺失、替換等，從而達(dá)到編輯基因的目的[25]。ZFNs和TALENs是較早的兩代基因編輯技術(shù)，ZFN方法中模塊組裝的鋅指蛋白活性低，有效鋅指蛋白不易獲得，此法成本高；TALEN技術(shù)需要組裝多個(gè)重復(fù)模塊，過程繁瑣。與前兩代基因編輯技術(shù)相比，新一代基因編輯技術(shù)CRISPR/Cas9應(yīng)用領(lǐng)域更廣[5]，其載體構(gòu)建簡單易操作，最重要的是其編輯精確性高、效率高[26]。故本研究采用CRISPR/Cas9靶向切斷雞EAV-HP基因組的DNA雙鏈，基于細(xì)胞同源重組修復(fù)機(jī)制，攜帶的供體載體將整合至DNA斷裂處，在細(xì)胞水平上實(shí)現(xiàn)定點(diǎn)整合。

在供體載體整合至EAV-HP位點(diǎn)時(shí)，供體載體的類型也對(duì)整合效率有著一定的影響。有研究報(bào)道同源序列長度一致時(shí)，插入型載體的整合效率要高于置換型載體[27]，但是由于置換型載體的裝載量大，整合精確，所以目前使用的供體載體多為置換型載體。本研究設(shè)計(jì)的供體載體為置換型載體，同源臂的長度約300–500 bp，此長度既保證了同源重組的效率，亦控制了供體DNA大小，左右同源臂和外源基因共約2 kb，利于供體DNA轉(zhuǎn)染至DF-1細(xì)胞。

本研究首次利用CRISPR/Cas9體系將外源基因整合至雞內(nèi)源性病毒中的EAV-HP位點(diǎn)，且外源基因能高效表達(dá)、穩(wěn)定遺傳，在細(xì)胞水平初步證明EVA-HP基因位點(diǎn)是雞基因組中可供選擇的外源基因整合位點(diǎn)，為轉(zhuǎn)基因雞的研究以及禽類育種提供新策略。

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CRISPR/Cas9-mediated foreign gene targeted knock-in into the chicken EAV-HP genome

Miaomiao Guo, Likai Yang, Weili Du, Tao Zhang, Hongzhao Lu, and Ling Wang

School of Biological Science and Engineering, Shaanxi University of Technology, Hanzhong 723000, Shaanxi, China

The study aims to use CRISPR/Cas9 introducing foreign gene targeted knock-in into chicken EAV-HP genome. First, specific primers were designed for amplification of EAV-HP left, right homologous arms and enhanced green fluorescent protein (eGFP) expression cassette. PCR products of homologous arms were ligated to both sides ofby overlap extension PCR, resulting in full-length donor DNA fragment designated as LER. Then LER fragments were cloned into pMD19-T to obtain donor vector pMDT-LER. Subsequently, the donor vector pMDT-LER was transfected into HEK293T cells to verify the expression ofgene. Furthermore, co-transfection of CRISPR/Cas9 expression vector and pMDT-LER into chicken DF-1 cells was performed to achievetransgenic cells. Meanwhile,expression was observed in cells, and the event ofintegration into EAV-HP genome was detectable by amplification of target DNA. Finally, the transgenic DF-1 cells were passaged seven times, and the stable integration and expression ofwas checked by PCR and Western blotting. These results demonstrated thatgene was knocked into the EAV-HP genome successfully, which provides a new integration site for research of transgenic chicken.

CRISPR/Cas9, chicken endogenous virus, EAV-HP, integration site, donor vector

May 31, 2018;

November 5, 2018

National Natural Science Foundation of China (No. 31402071), Shaanxi University of Technology Research Funding Project (No. SLGQD14-02).

Ling Wang. E-mail: wangling619@163.com

國家自然科學(xué)基金 (No. 31402071)，陜西理工大學(xué)科研計(jì)劃 (No. SLGQD14-02) 資助。

2018-11-26

http://kns.cnki.net/kcms/detail/11.1998.Q.20181122.1044.001.html

10.13345/j.cjb.180224

(本文責(zé)編 郝麗芳)