卞化，孫新曉，袁其朋

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代謝工程改造異養(yǎng)微生物固定CO2研究進展

卞化，孫新曉，袁其朋

北京化工大學(xué) 化工資源有效利用國家重點實驗室，北京 100029

環(huán)境保護和能源供應(yīng)是人類關(guān)心的兩大問題。能源消耗釋放出的溫室氣體對環(huán)境造成了嚴重影響。利用CO2固定途徑可將CO2轉(zhuǎn)化成燃料或化學(xué)品。天然固碳生物通常存在生長緩慢、固碳效率低等問題。通過在模式微生物中增強或重構(gòu)CO2固定途徑，實現(xiàn)CO2的再循環(huán)，可提高燃料或化學(xué)品的產(chǎn)量，減少溫室氣體排放。文中詳細介紹了通過代謝工程手段改造CO2固定途徑改善化學(xué)品生產(chǎn)以及糖合成，闡述了相關(guān)代謝途徑及其中的關(guān)鍵酶在CO2固定中的作用，介紹了電生化合成系統(tǒng)的應(yīng)用，顯示出CO2固定的巨大潛力，并展望了未來CO2固定的研究方向。

CO2固定，卡爾文循環(huán)，非氧化糖酵解，絲氨酸循環(huán)，電化學(xué)

溫室氣體排放造成的全球氣候變化是人類面臨的巨大挑戰(zhàn)。為了緩解這一趨勢，需要大幅度減少化石燃料的消耗，并且開發(fā)替代能源技術(shù)[1]。將CO2轉(zhuǎn)化為燃料或化學(xué)品，是CO2資源化利用的途徑之一。在過去幾年中，研究者們通過工程自養(yǎng)微生物如藍細菌和藻類，利用光能固定CO2合成乙醇[2-4]、正丁醇[5-8]、丙酮[9]、異丁醛[5]、乳酸[10-12]、異戊二烯[13]、1,2-丙二醇[14]、甲烷[15]和生物柴油[16-17]等化學(xué)品。除了光能之外，自養(yǎng)微生物還可以在溫和條件下使用氫氣或硫磺作為CO2同化的能源[18]。

自然界已發(fā)現(xiàn)的天然固碳途徑主要有6條，包括卡爾文(CBB)循環(huán)、3-羥基丙酸雙循環(huán)、Wood-Ljungdahl (WL) 途徑、還原性 (逆向) TCA 循環(huán)、二羧酸/4-羥基丁酸循環(huán)和 3-羥基丙酸/4-羥基丁酸循環(huán)。天然固碳的主要限制在于途徑自身的代謝速率較低，以及需要較高的能量供給。研究者通過表達關(guān)鍵酶或重構(gòu)固碳途徑提高固碳速率。關(guān)于CO2固定途徑及其關(guān)鍵酶以及利用自養(yǎng)微生物固定CO2已有相關(guān)綜述進行了系統(tǒng)總結(jié)[19-20]。

在異氧微生物中構(gòu)建高效穩(wěn)定的CO2固定途徑成為最近的研究熱點，旨在提高燃料或化學(xué)品的產(chǎn)量及得率。另外，為了提高CO2固定的總體效率，研究者還探索了不依賴于1,5-二磷酸核酮糖羧化酶 (RuBisCO) 的CO2固定途徑，設(shè)計構(gòu)建與電催化結(jié)合的生物合成途徑來協(xié)同改善CO2固定。因此，本文對近年來改造異養(yǎng)微生物 (如大腸桿菌或釀酒酵母) 固定CO2生產(chǎn)燃料及化學(xué)品的研究進展進行了總結(jié)。

1 CO2固定合成化學(xué)品

1.1 CO2固定應(yīng)用于琥珀酸生產(chǎn)

琥珀酸及其衍生物廣泛用于食品、化妝品和制藥領(lǐng)域[21]。美國能源部將其確定為可從生物質(zhì)中大量生產(chǎn)的12種高附加值化學(xué)品之一[22]。由于石油化學(xué)工藝生產(chǎn)琥珀酸會導(dǎo)致嚴重污染，研究者通過代謝工程改造提高生物法琥珀酸的產(chǎn)量。采取的策略包括消除競爭途徑[23-25]、破壞磷酸轉(zhuǎn)移酶系統(tǒng) (PTS) 以增加磷酸烯醇式丙酮酸 (PEP) 供應(yīng)[26-27]、激活乙醛酸途徑[28-29]，并結(jié)合定向進化改善琥珀酸生產(chǎn)[30-32]。其中，通過表達磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶 (PEPC)、磷酸烯醇式丙酮酸羧激酶 (PEPCK) 或者丙酮酸羧化酶 (PYC) 固定CO2合成草酰乙酸是提高琥珀酸的產(chǎn)量和得率的關(guān)鍵步驟[25,27,31,33](圖1)。

圖1 有氧、厭氧以及雙相發(fā)酵條件下大腸桿菌生產(chǎn)琥珀酸的代謝工程策略

PEPC廣泛存在于光合生物如植物、藻類、藍細菌、光合細菌以及許多非光合細菌中。PEPC催化PEP和CO2生成草酰乙酸和無機磷酸。PEPC催化的反應(yīng)為細胞各種組分的生物合成提供四碳二羧酸，參與維持檸檬酸循環(huán)，在初級代謝中有重要的補給作用，在光合作用中是催化大氣中CO2固定的第一步反應(yīng)，是C4植物光合作用途徑中最重要的酶之一[34]。PYC廣泛存在于動物、霉菌和酵母中，而植物和大部分細菌不含有該酶。它催化丙酮酸和CO2生成草酰乙酸和無機磷酸，在三羧酸循環(huán)中是供給草酰乙酸的主要反應(yīng)。PEPCK廣泛存在于動植物和細菌中，可催化PEP和CO2生成草酰乙酸并產(chǎn)生1分子ATP。

琥珀酸是TCA循環(huán)的中間體，在有氧條件下積累量很低。為了實現(xiàn)有氧條件琥珀酸的生產(chǎn)，對其生產(chǎn)途徑進行了改造。琥珀酸可經(jīng)乙醛酸旁路和TCA氧化分支兩條途徑生成，最大理論產(chǎn)量為1 mol/mol葡萄糖。敲除葡萄糖磷酸轉(zhuǎn)移酶基因() 缺失PTS系統(tǒng)，失活丙酮酸氧化酶基因()和乙酸激酶-磷酸轉(zhuǎn)乙酰化酶基因() 缺失副產(chǎn)物乙酸生成途徑，滅活aceBAK操縱子抑制子基因()，敲除異檸檬酸脫氫酶基因() 激活乙醛酸旁路，敲除琥珀酸脫氫酶基因()，并在大腸桿菌中過表達來自高粱的PEPC，琥珀酸得率達到0.94 mol/mol葡萄糖[35]。在谷氨酸棒桿菌中過表達內(nèi)源PEPC和PYC，琥珀酸比生產(chǎn)率達到1.60 mmol/(g?cdw?h)[36]。

在厭氧條件下，如果不提供外源電子，琥珀酸最大理論產(chǎn)量為1.714 mol/mol葡萄糖[21,33]。與有氧條件不同的是，琥珀酸主要經(jīng)逆向TCA循環(huán)生成。對菌株進行與有氧發(fā)酵條件類似的改造，在大腸桿菌中過表達枯草芽孢桿菌的PYC基因，琥珀酸得率達到1.29 mol/mol葡萄糖[37]；為了進一步提高琥珀酸產(chǎn)量，將更多的碳定向到磷酸戊糖途徑以及消除競爭途徑后，引入產(chǎn)琥珀酸放線桿菌的PEPCK基因和谷氨酸棒桿菌的PYC基因，最終琥珀酸產(chǎn)量高達1.54 mol/mol葡萄糖，達到最大理論產(chǎn)量的90%[38]。值得一提的是，PEPCK固定CO2的同時生成ATP，ATP的增加導(dǎo)致更高的生物量和琥珀酸產(chǎn)量[39]。

無氧條件下細胞生長相對緩慢，為此研究者采用“雙相”發(fā)酵，即先在有氧條件下積累足夠的生物量，再轉(zhuǎn)換到厭氧條件下生產(chǎn)琥珀酸。在大腸桿菌中“雙相”發(fā)酵時，缺失乳酸、甲酸等副產(chǎn)物競爭途徑和PTS系統(tǒng)，失活丙酮酸羧化酶，當過表達來自的PEPCK，琥珀酸的產(chǎn)量比未表達PEPCK的對照菌株提高60%[25]。為了最小化副產(chǎn)物甲酸的產(chǎn)量，缺失副產(chǎn)物途徑后在大腸桿菌中導(dǎo)入博伊斯假絲酵母的NAD+依賴性甲酸脫氫酶基因 () 增加NADH的供應(yīng)，并激活乙醛酸途徑，過表達乳酸乳球菌PYC，在補料分批發(fā)酵的條件下，琥珀酸生產(chǎn)力達到2 g/(L?h)[40]。

通過基因工程手段引入關(guān)鍵酶或外源途徑重構(gòu)CO2固定途徑，在大腸桿菌或谷氨酸棒狀桿菌中過表達PYC、PEPC或PEPCK，使目標產(chǎn)物琥珀酸的產(chǎn)量在有氧、無氧或是“雙相”的發(fā)酵條件下都有顯著提高，顯示出CO2固定在琥珀酸生產(chǎn)上的巨大潛力。

1.2 CO2固定應(yīng)用于乙醇生產(chǎn)

為了限制化石燃料的燃燒，減少溫室氣體的排放，人們已開始使用生物燃料作為替代能源[41]。生物乙醇是目前在工業(yè)規(guī)模生產(chǎn)和使用最廣泛的生物燃料[42-43]。釀酒酵母是生物乙醇生產(chǎn)的最常用宿主。然而，在酵母發(fā)酵產(chǎn)乙醇的過程中，生成1分子乙醇的同時釋放1分子CO2，造成碳損失及溫室氣體排放。另外，過量NADH導(dǎo)致副產(chǎn)物甘油大量積累。研究者將異源的磷酸核酮糖激酶 (PRK) 和RuBisCO導(dǎo)入釀酒酵母中構(gòu)建CBB循環(huán)固定CO2，提高了乙醇產(chǎn)量并減少了副產(chǎn)物甘油積累[1,44-45](圖2)。

圖2 CO2固定提高釀酒酵母乙醇得率

PRK催化5-磷酸核酮糖 (R5P) 轉(zhuǎn)化為1,5-二磷酸核酮糖 (RuBP)作為RuBisCO固定CO2的底物。RuBisCO廣泛存在于真核生物如植物和原核生物中，在光合生物中，RuBisCO是同化大氣CO2到生物圈的主要酶[46]。該酶催化光合作用CO2固定的第一步反應(yīng)，使CO2和RuBP轉(zhuǎn)變成2個分子的3-磷酸甘油酸，是碳同化的限速酶。

研究者在釀酒酵母中共表達了菠菜的PRK和脫氮假單胞菌的RuBisCO。RuBisCO由8個大亞基組成，屬于Ⅱ型，其活性表達需要大腸桿菌伴侶蛋白GroEL和GroES的輔助。通過固定代謝途徑中產(chǎn)生的CO2生成3-磷酸甘油酸，進而增加了乙醇產(chǎn)量。在含有葡萄糖和半乳糖的培養(yǎng)基上，與原始菌株相比，PRK和RuBisCO的共表達使副產(chǎn)物甘油減少90%，乙醇產(chǎn)量增加10%[44]。使用甘蔗和玉米淀粉為原料生產(chǎn)乙醇存在“與人爭糧”的問題[47]。為此研究者使用木質(zhì)纖維素水解生成的木糖為原料，在釀酒酵母中構(gòu)建異源木糖途徑即木糖還原酶 (XR)/木糖醇脫氫酶 (XDH) 途徑[48]，使釀酒酵母能夠以木糖為碳源產(chǎn)乙醇，并引入菠菜的PRK和深紅紅螺菌的RuBisCO實現(xiàn)CO2的固定。中RuBisCO也由8個大亞基組成，屬于Ⅱ型，其活性表達同樣需要大腸桿菌分子伴侶的輔助。實驗結(jié)果表明工程酵母凈乙醇產(chǎn)量增加，副產(chǎn)物減少，且生成單位乙醇的CO2釋放量減少，證明固定途徑的引入實現(xiàn)了CO2的再循環(huán)[1]。

此外，研究者還將PRK-RuBisCO模塊與木糖還原酶-木糖醇脫氫酶 (mXR-XDH) 模塊構(gòu)建到釀酒酵母中，利用木糖和麥芽糖共同發(fā)酵產(chǎn)乙醇。在釀酒酵母中共表達真氧產(chǎn)堿桿菌H16的PRK和RuBisCO[49]。.H16 RuBisCO由8個大亞基和8個小亞基組成，屬于Ⅰ型。為了確保其活性，共表達了釀酒酵母的內(nèi)源性伴侶 (Hsp60-HSP10)。結(jié)果顯示，乙醇的生產(chǎn)率比對照菌株即未構(gòu)建CO2固定系統(tǒng)的菌株高出15%，且CO2固定速率達到336.6–436.3 mg CO2/(L?h)，顯著高于以往的天然或工程微生物(5.8–147.0 mg CO2/(L?h))。值得一提的是，實驗證明，Ⅰ型RuBisCO的羧化活性高于Ⅱ型，可能是由于小亞基具有富集CO2的能力，提高了酶分子周圍CO2的濃度[45]。

在這幾項研究中，通過在釀酒酵母引入RuBisCO和PRK，實現(xiàn)生物乙醇生產(chǎn)過程中CO2的原位固定，提高目標產(chǎn)物乙醇的產(chǎn)量，為利用木質(zhì)纖維素生產(chǎn)其他燃料及化學(xué)品奠定了基礎(chǔ)。

1.3 構(gòu)建非氧化糖酵解途徑實現(xiàn)完全碳轉(zhuǎn)化

糖酵解途徑是存在于幾乎所有生物中的基礎(chǔ)代謝途徑。然而，天然糖酵解途徑 (EMP) 產(chǎn)生1分子乙酰輔酶A的同時釋放1分子CO2，導(dǎo)致理論碳收率僅有66.7%。為此，研究者設(shè)計構(gòu)建了一條環(huán)形非氧化糖酵解 (NOG) 途徑 (圖3)。該途徑中，磷酸轉(zhuǎn)酮酶將3分子6-磷酸果糖 (F6P) 分解成3分子乙酰磷酸 (AcP) 和3分子4-磷酸赤蘚糖 (E4P)。3分子E4P通過碳重排重新生成2分子F6P。凈反應(yīng)是1分子F6P生成3分子AcP而沒有碳損失。過表達磷酸酮醇酶(Fpk/Xpk)，刪除琥珀酸、乳酸、乙醇、甲酸等競爭途徑，得到的工程大腸桿菌菌株發(fā)酵木糖產(chǎn)乙酸的得率達到2.2 mol/mol，接近理論最大得率 (2.5 mol/mol)，超過木糖由EMP途徑生成乙酸的最大理論值 (1.67 mol/mol)[50]。

圖3 氧化及非氧化糖酵解途徑[50]

然而，NOG循環(huán)自身不能支持細胞在以糖為唯一碳源的最小培養(yǎng)基中生長，需要EMP途徑的輔助以產(chǎn)生丙酮酸及其他合成代謝前體。為克服該挑戰(zhàn)，研究者進一步構(gòu)建了不使用EMP進行糖分解代謝的大腸桿菌菌株。構(gòu)建的菌株包含11個基因過表達，10個基因缺失，并通過定向進化得到超過50個基因突變 (包括3個整體調(diào)節(jié)因子)。該菌株可在葡萄糖基本培養(yǎng)基中有氧生長，并且厭氧發(fā)酵葡萄糖產(chǎn)乙酸的碳轉(zhuǎn)化率接近100%[51]。

1.4 應(yīng)用Wood-Ljungdahl途徑提高碳轉(zhuǎn)化率

除了利用上述NOG途徑實現(xiàn)碳的完全轉(zhuǎn)化外，研究者還將糖酵解途徑與WL途徑相結(jié)合，進行混合營養(yǎng)發(fā)酵，也可實現(xiàn)糖到乙酰輔酶A的化學(xué)計量轉(zhuǎn)化。

WL途徑也稱還原性乙酰輔酶A途徑，主要存在于厭氧的產(chǎn)乙酸菌及產(chǎn)甲烷菌中。與其他環(huán)形固碳途徑不同，該途徑可將2分子CO2直接還原生成1分子乙酸 (圖4)。由于途徑的兩個關(guān)鍵酶CO脫氫酶 (CODH) 和乙酰輔酶A合成酶 (ACS) 的極度氧敏感性，該途徑需在嚴格厭氧條件下進行。與其他固碳途徑相比，WL途徑對ATP的需求較低且消耗NADH的量恰好等于糖酵解途徑產(chǎn)生的NADH的量。因此，通過WLP驅(qū)動的混合營養(yǎng)發(fā)酵，1分子的己糖可以產(chǎn)生3分子乙酰輔酶A及1分子ATP。作為概念驗證，改造永達爾梭菌產(chǎn)丙酮的得率為先前最大理論得率的138%。此外，當提供足夠的還原力 (即H2) 時，發(fā)酵過程可不排放CO2[52]。

1.5 大腸桿菌CO2固定合成糖及生物質(zhì)

能否通過進化改造實現(xiàn)異養(yǎng)微生物直接由CO2合成生物質(zhì)？最近的一項研究表明，經(jīng)過合理代謝網(wǎng)絡(luò)改造、異源重組表達和實驗室進化，重構(gòu)完整功能的CBB循環(huán)可以實現(xiàn)大腸桿菌利用CO2合成糖和其他生物質(zhì)成分。通過引入來自聚球藻sp. PCC7002的RuBisCO和PCC7942的PRK[53]，并刪除磷酸甘油變位酶基因來切斷糖異生，將中樞代謝分成兩個獨立的子網(wǎng)絡(luò)。網(wǎng)絡(luò)一包含上游糖酵解、磷酸戊糖途徑和重組CBB循環(huán)酶 (RuBisCO和PRK)；網(wǎng)絡(luò)二是含有下游糖酵解和TCA循環(huán)的能量模塊，為模塊一的碳固定提供ATP和還原力。

圖4 Wood-Ljungdahl途徑

雖然初始菌株不能以丙酮酸為唯一碳源生長，但是在木糖限制的恒化器中培養(yǎng)，進化后的菌株能夠在高CO2的濃度下，僅以丙酮酸為碳源生長。進一步質(zhì)譜分析表明，CO2是進化菌株中糖合成的唯一碳源，證明了在大腸桿菌中完整功能的CBB循環(huán)能直接從CO2合成糖。經(jīng)過全基因組測序，基因 (編碼核糖磷酸焦磷酸激酶) 是3次恒化實驗中出現(xiàn)的唯一的共同突變基因。該酶是CBB循環(huán)模塊的主要分支酶。該研究表明CBB循環(huán)的功能性不僅取決于異源酶RuBisCO和PRK，而且取決于與其相互作用的內(nèi)源組分，主要是循環(huán)碳庫中的生物合成酶[54]。

通過合理的代謝網(wǎng)絡(luò)設(shè)計，在大腸桿菌中實現(xiàn)了完全功能和自催化的碳固定循環(huán)，能夠在沒有向循環(huán)中輸入有機碳的情況下合成己糖、戊糖和丙糖。所有糖類都是由CO2和所需的輔因子合成。合理的代謝設(shè)計和實驗室進化兩者之間的協(xié)同作用，有助于優(yōu)化代謝網(wǎng)絡(luò)，推動可持續(xù)性能源的發(fā)展。

2 電化學(xué)在CO2固定上的應(yīng)用

目前，受到關(guān)鍵酶活性的限制，生物固碳的總體效率仍然較低[55-56]。為此，研究者嘗試開發(fā)了電生化混合系統(tǒng)，較傳統(tǒng)生物系統(tǒng)可能具有更高的效率。

研究者開發(fā)了一種將電能儲存為高級醇化學(xué)能的方法，高級醇可以用作液體運輸燃料。通過基因工程改造了一種石油自養(yǎng)微生物H16，在使用CO2作為唯一碳源和電作為唯一能量輸入的電生物反應(yīng)器中生產(chǎn)高級醇。電力驅(qū)動陰極上的CO2還原成甲酸，甲酸被H16轉(zhuǎn)化為異丁醇和3-甲基-1-丁醇。該工藝整合了CO2固定、電化學(xué)甲酸生產(chǎn)以及高級醇合成，為電驅(qū)動CO2轉(zhuǎn)化成商業(yè)化學(xué)品開創(chuàng)了可能性[57]。雖然這項工作證明了電化學(xué)固定CO2的可行性，但是由于缺乏對宿主生物的充分認識，且生產(chǎn)過程中產(chǎn)生過氧化氫影響細胞生長，限制了該系統(tǒng)的持續(xù)改進。

為了避免上述問題，研究者選擇大腸桿菌作為電生化混合生產(chǎn)系統(tǒng)的宿主，因為其具有無氧代謝能力并擁有許多生產(chǎn)所需的酶[58]。類似地，首先使用電催化將CO2還原成甲酸，并在大腸桿菌中重構(gòu)CO2和甲酸固定途徑，通過甘氨酸和L-絲氨酸將兩個甲酸和一個CO2轉(zhuǎn)化為一個丙酮酸。結(jié)果表明，使用CO2和電可支持大腸桿菌的生長。該系統(tǒng)的產(chǎn)物是一種中心代謝物，因此幾乎可以與所有的生化途徑相連接，由CO2和電產(chǎn)生各種化合物，顯示出良好的應(yīng)用前景。

3 展望

CO2固定在化學(xué)品和燃料生產(chǎn)上的應(yīng)用越來越廣泛。為了提高目標產(chǎn)物的產(chǎn)量，對天然CO2固定途徑的改造研究日益增多，主要集中于CBB循環(huán)，尤其是對關(guān)鍵酶RuBisCO的改造方面[19]。RuBisCO在自然界中含量豐富，是植物中可溶性蛋白含量最多的酶，是調(diào)節(jié)植物的光合作用和光呼吸的雙功能酶。因此，對該酶的研究具有重要的理論及實際應(yīng)用價值。進一步提高RuBisCO本身的活性難度較高。為此，一方面可以篩選不同來源的RuBisCO，獲得活性較高的酶；另一方面作為RuBisCO的低羧化活性的補償，一些自養(yǎng)微生物通過形成物理屏障 (例如，藍細菌中的半滲透性羧基體和C4植物中的束鞘細胞) 以濃縮CO2，提高其在RuBisCO周圍的濃度。受此啟發(fā)，未來可將CO2和CO2固定酶限制在亞細胞空間中 (例如，在大腸桿菌中重建羧基體) 或者利用蛋白質(zhì)或RNA支架實現(xiàn)CO2產(chǎn)生酶和固定酶的共定位，有望進一步提高CO2固定效率。通過外部補充CO2的實驗也證明，增加CO2濃度也會帶來有益的效果[44]，因此可以通過表達多相性碳酸酐酶 (CA)[53]，其催化CO2和HCO3?的可逆轉(zhuǎn)化，進一步優(yōu)化RuBisCO的羧化效率。

CO2性質(zhì)穩(wěn)定，不易活化，從無機碳固定到有機碳的過程中需要消耗大量的能量。天然生物固碳的效率目前不能滿足工業(yè)化的要求。生物固碳能量消耗高、固定效率低，設(shè)計低耗高效的固碳途徑是未來的研究方向。合理的代謝設(shè)計和實驗室進化有望創(chuàng)造出更穩(wěn)定的固碳途徑。

改造異養(yǎng)微生物固定CO2最大的挑戰(zhàn)是如何真正實現(xiàn)從“異養(yǎng)”到“自養(yǎng)”。目前的研究要么是利用有機碳源代謝過程中釋放的CO2，要么是需要在利用CO2時補充有機碳源作為能量，均未實現(xiàn)真正意義上的“自養(yǎng)固碳”。因此，在大腸桿菌或釀酒酵母等異養(yǎng)微生物體內(nèi)重構(gòu)來自于自養(yǎng)菌的代謝體系是未來極具挑戰(zhàn)性的工作。

電生化合成系統(tǒng)與傳統(tǒng)的生物合成相比具有一定的優(yōu)勢，相比于CBB循環(huán)更容易改進，并且在熱力學(xué)上是有利的。最重要的是，因為不涉及到對氧敏感的酶，在有氧或無氧的條件下均能進行?；旌想娚到y(tǒng)將有助于解決可再生能源高效生產(chǎn)的問題。然而，該系統(tǒng)也存在反應(yīng)界面有限、裝置不易放大等不足，是未來實現(xiàn)工業(yè)應(yīng)用需要解決的問題。

[1] Xia PF, Zhang GC, Walker B, et al. Recycling carbon dioxide during xylose fermentation by engineered. ACS Synth Biol, 2016, 6(2): 276–283.

[2] Dexter J, Fu PC. Metabolic engineering of cyanobacteria for ethanol production. Energy Environ Sci, 2009, 2(8): 857–864.

[3] Deng MD, Coleman JR. Ethanol synthesis by genetic engineering in Cyanobacteria. Appl Environ Microbiol, 1999, 65(2): 523–528.

[4] Luo DX, Hu ZS, Choi DG, et al. Life cycle energy and greenhouse gas emissions for an ethanol production process based on blue-green algae. Environ Sci Technol, 2010, 44(22): 8670–8677.

[5] Atsumi S, Higashide W, Liao JC. Direct photosynthetic recycling of carbon dioxide to isobutyraldehyde. Nat Biotechnol, 2009, 27(12): 1177–1180.

[6] Lan EI, Liao JC. Metabolic engineering of cyanobacteria for 1-butanol production from carbon dioxide. Metab Eng, 2011, 13(4): 353–363.

[7] Lan EI, Liao JC. ATP drives direct photosynthetic production of 1-butanol in cyanobacteria. Proc Natl Acad Sci USA, 2012, 109(16): 6018–6023.

[8] Li H, Opgenorth PH, Wernick DG, et al. Integrated electromicrobial conversion of CO2to higher alcohols. Science, 2012, 335(6076): 1596.

[9] Zhou J, Zhang HF, Zhang YP, et al. Designing and creating a modularized synthetic pathway in cyanobacteriumenables production of acetone from carbon dioxide. Metab Eng, 2012, 14(4): 394–400.

[10] Niederholtmeye H, Wolfst?dter BT, Savage DF, et al. Engineering cyanobacteria to synthesize and export hydrophilic products. Appl Environ Microbiol, 2010, 76(11): 3462–3466.

[11] Angermayr SA, Paszota M, Hellingwerf KJ. Engineering a cyanobacterial cell factory for production of lactic Acid. Appl Environ Microbiol, 2012, 78(19): 7098–7106.

[12] Joseph A, Aikawa S, Sasaki K, et al. Utilization of lactic acid bacterial genes insp. PCC 6803 in the production of lactic acid. Biosci Biotechnol Biochem, 2013, 77(5): 966–970.

[13] Bentley FK, Melis A. Diffusion-based process for carbon dioxide uptake and isoprene emission in gaseous/aqueous two-phase photobioreactors by photosynthetic microorganisms. Biotechnol Bioeng, 2012, 109(1): 100–109.

[14] Li H, Liao JC. Engineering a cyanobacterium as the catalyst for the photosynthetic conversion of CO2to 1,2-propanediol. Microb Cell Fact, 2013, 12(1): 4.

[15] Günther A, Jakob T, Goss R, et al. Methane production from glycolate excreting algae as a new concept in the production of biofuels. Bioresour Technol, 2012, 121: 454–457.

[16] Deng XD, Li YJ, Fei XW. Microalgae: a promising feedstock for biodiesel. African J Microbiol Res, 2009, 3(13): 1008–1014.

[17] Tang HY, Abunasser N, Garcia MED, et al. Potential of microalgae oil fromas a feedstock for biodiesel. Appl Energy, 2011, 88(10): 3324–3330.

[18] Boyle NR, Morgan JA. Computation of metabolic fluxes and efficiencies for biological carbon dioxide fixation. Metab Eng, 2011, 13(2): 150–158.

[19] Gong FY, Cai Z, Li Y. Synthetic biology for CO2fixation. Sci China Life Sci, 2015, 45(10): 993–1002 (in Chinese). 鞏伏雨, 蔡真, 李寅. CO2固定的合成生物學(xué). 中國科學(xué): 生命科學(xué), 2015, 45(10): 993–1002.

[20] Ge XZ, Zhao YX, Liu XY, et al. Research advances in biological CO2fixation pathways and key enzymes. J Beijing Union Univ, 2013, 27(1): 63–68 (in Chinese). 葛喜珍, 趙有璽, 劉曉宇, 等. 生物固定CO2代謝途徑及關(guān)鍵酶的研究進展. 北京聯(lián)合大學(xué)學(xué)報, 2013, 27(1): 63–68.

[21] McKinlay JB, Vieille C, Zeikus JG. Prospects for a bio-based succinate industry. Appl Microbiol Biotechnol, 2007, 76(4): 727–740.

[22] Werpy T, Petersen G, Added TV, et al. Top value added chemicals from biomass. Nato Adv Sci Inst, 2004, 1(12): 263–275.

[23] Stols L, Kulkarni G, Harris BG, et al. Expression ofmalic enzyme in a mutantallows production of succinic acid from glucose. Appl Biochem Biotechnol, 1997, 63(1): 153–158.

[24] Jantama K, Haupt MJ, Svoronos SA, et al. Combining metabolic engineering and metabolic evolution to develop nonrecombinant strains ofC that produce succinate and malate. Biotechnol Bioeng, 2008, 99(5): 1140–1153.

[25] Singh A, Soh KC, Hatzimanikatis V, et al. Manipulating redox and ATP balancing for improved production of succinate in.. Metab Eng, 2011, 13(1): 76–81.

[26] Lu J, Tang JL, Liu Y, et al. Combinatorial modulation ofandgene expression for improved alternative glucose utilization. Appl Microbiol Biotechnol, 2012, 93(6): 2455–2462.

[27] Tan ZG, Zhu XN, Chen J, et al. Activating phosphoenolpyruvate carboxylase and phosphoenolpyruvate carboxykinase in combination for improvement of succinate production. Appl Environ Microbiol, 2013, 79(16): 4838–4844.

[28] Sánchez AM, Bennett GN, San KY. Novel pathway engineering design of the anaerobic central metabolic pathway into increase succinate yield and productivity. Metab Eng, 2005, 7(3): 229–239.

[29] Zhu LW, Li XH, Zhang L, et al. Activation of glyoxylate pathway without the activation of its related gene in succinate-producing engineered. Metab Eng, 2013, 20: 9–19.

[30] Jantama K, Zhang XL, Moore JC, et al. Eliminating side products and increasing succinate yields in engineered strains ofC. Biotechnol Bioeng, 2008, 101(5): 881–893.

[31] Zhang XL, Jantama K, Moore JC, et al. Metabolic evolution of energy-conserving pathways for succinate production in. Proc Natl Acad Sci USA, 2009, 106(48): 20180–20185.

[32] Zhu XN, Tan ZG, Xu HT, et al. Metabolic evolution of two reducing equivalent-conserving pathways for high-yield succinate production in. Metab Eng, 2014, 24: 87–96.

[33] Vemuri GN, Eiteman MA, Altman E. Effects of growth mode and pyruvate carboxylase on succinic acid production by metabolically engineered strains of. Appl Environ Microbiol, 2002, 68(4): 1715–1727.

[34] O’Leary MH. Phosphoenolpyruvate carboxylase: an enzymologist’s view. Annu Rev Plant Physiol, 1982, 33(1): 297–315.

[35] Lin H, Bennett GN, San KY. Fed-batch culture of a metabolically engineeredstrain designed for high-level succinate production and yield under aerobic conditions. Biotechnol Bioeng, 2005, 90(6): 775–779.

[36] Litsanov B, Kabus A, Brocker M, et al. Efficient aerobic succinate production from glucose in minimal medium with. Microb Biotechnol, 2012, 5(1): 116–128.

[37] Wang QZ, Chen X, Yang YD, et al. Genome-scaleaided metabolic analysis and flux comparisons ofto improve succinate production. Appl Microbiol Biotechnol, 2006, 73(4): 887–894.

[38] Meng J, Wang BY, Liu DY, et al. High-yield anaerobic succinate production by strategically regulating multiple metabolic pathways based on stoichiometric maximum in. Microb Cell Fact, 2016, 15(1): 141.

[39] Feist AM, Henry CS, Reed JL, et al. Agenome-scale metabolic reconstruction forK-12 MG1655 that accounts for 1260 ORFs and thermodynamic information. Mol Syst Biol, 2007, 3(1): 121.

[40] Balzer GJ, Thakker C, Bennett GN, et al. Metabolic engineering ofto minimize byproduct formate and improving succinate productivity through increasing NADH availability by heterologous expression of NAD+-dependent formate dehydrogenase. Metab Eng, 2013, 20: 1–8.

[41] Caspeta L, Buijs NAA, Nielsen J. The role of biofuels in the future energy supply. Energy Environ Sci, 2013, 6(4): 1077–1082.

[42] Nielsen J, Larsson C, van Maris A, et al. Metabolic engineering of yeast for production of fuels and chemicals. Curr Opin Biotechnol, 2013, 24(3): 398–404.

[43] Rabinovitch-Deere CA, Oliver JWK, Rodriguez GM, et al. Synthetic biology and metabolic engineering approaches to produce biofuels. Chem Rev, 2013, 113(7): 4611–4632.

[44] Guadalupe-Medina V, Wisselink HW, Luttik MA, et al. Carbon dioxide fixation by Calvin-Cycle enzymes improves ethanol yield in yeast. Biotechnol Biofuels, 2013, 6(1): 125.

[45] Li YJ, Wang MM, Chen YW, et al. Engineered yeast with a CO2-fixation pathway to improve the bio-ethanol production from xylose-mixed sugars. Sci Rep, 2017, 7(1): 43875.

[46] Andersson I, Backlund A. Structure and function of Rubisco. Plant Physiol Biochem, 2008, 46(3): 275–291.

[47] Tilman D, Socolow R, Foley JA, et al. Beneficial biofuels-the food, energy, and environment trilemma. Science, 2009, 325(5938): 270–271.

[48] Hahn-H?gerdal B, Karhumaa K, Jeppsson M, et al. Metabolic engineering for pentose utilization in//Olsson L, Ed. Biofuels. Berlin Heidelberg: Springer, 2007: 147–177.

[49] Pohlmann A, Fricke WF, Reinecke F, et al. Genome sequence of the bioplastic-producing “Knallgas” bacteriumH16. Nat Biotechnol, 2006, 24(10): 1257–1262.

[50] Bogorad IW, Lin TS, Liao JC. Synthetic non-oxidative glycolysis enables complete carbon conservation. Nature, 2013, 502(7473): 693–697.

[51] Lin PP, Jaeger AJ, Wu TY, et al. Construction and evolution of anstrain relying on nonoxidative glycolysis for sugar catabolism. Proc Natl Acad Sci USA, 2018, 115(14): 3538–3546.

[52] Jones SW, Fast AG, Carlson ED, et al. CO2fixation by anaerobic non-photosynthetic mixotrophy for improved carbon conversion. Nat Commun, 2016, 7: 12800.

[53] Gong FY, Liu GX, Zhai XY, et al. Quantitative analysis of an engineered CO2-fixingreveals great potential of heterotrophic CO2fixation. Biotechnol Biofuels, 2015, 8(1): 86.

[54] Antonovsky N, Gleizer S, Noor E, et al. Sugar synthesis from CO2in. Cell, 2016, 166(1): 115–125.

[55] Raines CA. Increasing photosynthetic carbon assimilation in C3plants to improve crop yield: current and future strategies. Plant Physiol, 2011, 155(1): 36–42.

[56] Whitney SM, Houtz RL, Alonso H. Advancing our understanding and capacity to engineer nature’s CO2-sequestering enzyme, Rubisco. Plant Physiol, 2011, 155(1): 27–35.

[57] Li H, Opgenorth PH, Wernick DG, et al. Integrated electromicrobial conversion of CO2to higher alcohols. Science, 2012, 335(6076): 1596.

[58] Tashiro Y, Hirano S, Matson MM, et al. Electrical-biological hybrid system for CO2reduction. Metab Eng, 2018, 47: 211–218.

Advances in metabolic engineering of heterotrophic microorganisms for CO2fixation: a review

Hua Bian, Xinxiao Sun, and Qipeng Yuan

State Key Laboratory of Chemical Resource Engineering, Beijing University of Chemical Technology, Beijing 100029, China

Environmental protection and energy supply are our two major concerns. Greenhouse gases released from energy consumption have serious impact on the environment. CO2fixation can be used to convert CO2into fuels or chemicals. However, natural carbon-fixing organisms usually have some disadvantages such as slow growth and low carbon fixation efficiency. Enhancing or remodeling CO2fixation pathways in model microorganisms can realize CO2recycling, which can further increase fuel or chemical production and reduce greenhouse gas emission. This review describes in detail metabolic engineering of CO2fixation pathways to improve chemical production and sugar synthesis, elaborates the role of relevant metabolic pathways and key enzymes in CO2fixation, introduces the application of electro-biochemical synthesis system, shows the great potential of CO2fixation, and prospects the future research direction of CO2fixation.

CO2fixation, Calvin cycle, non-oxidative glycolysis, serine cycle, electrochemistry

June 29, 2018;

September 11, 2018

National Natural Science Foundation of China (Nos. 21636001, 21606012, 21776008),Double First-class Project in Beijing University of Chemical Technology (No. ylkxj03).

s:Xinxiao Sun. E-mail: sunxx@mail.buct.edu.cn Qipeng Yuan. E-mail: yuanqp@mail.buct.edu.cn

10.13345/j.cjb.180267

國家自然科學(xué)基金(Nos. 21636001, 21606012, 21776008)，北京化工大學(xué)雙一流項目(No. ylkxj03)資助。

(本文責編 陳宏宇)