溫燦，陳遠(yuǎn)志，羅文新

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再循環(huán)抗體的研究進(jìn)展

溫燦1，陳遠(yuǎn)志2，羅文新2

1 廈門(mén)大學(xué) 生命科學(xué)學(xué)院 國(guó)家傳染病診斷試劑與疫苗工程技術(shù)研究中心，福建 廈門(mén) 361102 2 廈門(mén)大學(xué) 公共衛(wèi)生學(xué)院，福建 廈門(mén) 361102

單克隆抗體因其與抗原結(jié)合具有高度特異性與強(qiáng)親和力，已成為抗體藥物研發(fā)的主要類型。但隨著天然單克隆抗體的深入研究，它的諸多缺陷也浮出水面，如與抗原結(jié)合次數(shù)有限、帶來(lái)非預(yù)期的抗體清除效應(yīng)和抗原累積效應(yīng)。人們不再局限于天然抗體的篩選，而是想通過(guò)改造提升抗體藥物的藥效。近年來(lái)，一類新型再循環(huán)抗體的問(wèn)世，很好地解決了天然單克隆抗體發(fā)展的瓶頸。再循環(huán)抗體可以在胞外結(jié)合抗原，在細(xì)胞內(nèi)與抗原解離，使抗體結(jié)合抗原次數(shù)最大化，減少抗原介導(dǎo)的抗體清除效應(yīng)和抗體介導(dǎo)的抗原累積效應(yīng)，并且再循環(huán)抗體可以通過(guò)進(jìn)一步的Fc改造來(lái)加強(qiáng)與Fc受體的親和力。文中綜述了再循環(huán)抗體的研究進(jìn)展，包括其特點(diǎn)、改造方法及展望。

單克隆抗體，再循環(huán)抗體，抗體改造

自1975年雜交瘤技術(shù)建立以來(lái)，單克隆抗體因其與抗原的結(jié)合具有高度特異性與強(qiáng)親和力，已成為各大科研機(jī)構(gòu)和藥物研發(fā)公司的研究熱點(diǎn)。單克隆抗體發(fā)展至今，已有超過(guò)62種抗體藥物批準(zhǔn)上市[1]，且超300種處于臨床發(fā)展評(píng)估階段。在抗體的5種類別中，IgG類抗體在血清中含量最高[2]，具有1–3周的半衰期[3]，使其成為主流的治療性抗體型別。IgG類抗體較其他類別具有半衰期長(zhǎng)的優(yōu)勢(shì)，它能特異地與新生兒受體 (FcRn) 進(jìn)行pH依賴性結(jié)合，當(dāng)其被非特異性清除作用內(nèi)化進(jìn)細(xì)胞時(shí)，在內(nèi)涵體的酸性環(huán)境下，IgG抗體會(huì)被FcRn捕獲而循環(huán)到胞外，在胞外中性條件下被釋放回血漿中，使其免受溶酶體降解[4-6]。

絕大多數(shù)處于臨床研究階段的抗體屬IgG型，但作為醫(yī)療領(lǐng)域中舉足輕重的一類藥物，它的價(jià)格并不親民，且頻繁的給藥頻率給它的推廣普及帶來(lái)了很大的挑戰(zhàn)。因此部分研究者的目光不再停留在高成本的新單克隆抗體的研發(fā)上，而是轉(zhuǎn)向抗體的基因工程改造研究，其中包括改善與靶標(biāo)抗原的親和力與特異性、藥物代謝動(dòng)力學(xué)與藥效學(xué)、調(diào)節(jié)抗體Fc區(qū)段介導(dǎo)的效應(yīng)功能和改善與受體的親和力等方面[7]。

20世紀(jì)90年代，隨著抗體Fc區(qū)段與大鼠FcRn復(fù)合物結(jié)構(gòu)的解析[8]及FcRn在IgG類抗體體內(nèi)代謝中的重要調(diào)控功能的發(fā)現(xiàn)[9]，研究者開(kāi)始了Fc區(qū)段的改造來(lái)延長(zhǎng)此類抗體在血液中的半衰期。1997年，首次報(bào)道的Fc改造來(lái)源于鼠的IgG1類抗體，突變體較野生型在小鼠體內(nèi)半衰期延長(zhǎng)了約1.6倍[10]，但由于種屬差異，F(xiàn)c區(qū)段的改造后來(lái)集中于人IgG類抗體及相關(guān)評(píng)價(jià)的動(dòng)物模型的構(gòu)建。2010年，Zalevsky團(tuán)隊(duì)改造了針對(duì)VEGF的人IgG1類抗體的Fc區(qū)段，突變體在酸性條件下與FcRn親和力較野生型有7倍的提升，在食蟹猴中，半衰期是野生型的2.5倍[11]。雖然Fc的改造在非特異性清除上的補(bǔ)救效果較好，但此法延長(zhǎng)半衰期的程度是有限的，并且抗體絕大部分的清除是抗原的特異性清除帶來(lái)的，所以增加抗體“使用”次數(shù)的“再循環(huán)抗體”概念被提出。再循環(huán)抗體在胞外與抗原結(jié)合內(nèi)化進(jìn)細(xì)胞后，因內(nèi)涵體的環(huán)境與胞外環(huán)境有很大的差異 (pH、鈣離子濃度等)，再循環(huán)抗體會(huì)與抗原解離，之后通過(guò)FcRn循環(huán)回到血漿中，再結(jié)合別的靶標(biāo)抗原。通過(guò)重復(fù)這個(gè)循環(huán)，再循環(huán)抗體可以實(shí)現(xiàn)與多個(gè)靶標(biāo)抗原的結(jié)合，使抗體與抗原結(jié)合次數(shù)最大化。Igawa團(tuán)隊(duì)首次于2010年改造出了 1株pH依賴性抗原結(jié)合抗體 (再循環(huán)妥珠單抗)，在轉(zhuǎn)基因小鼠中，再循環(huán)抗體的抗原清除效果和抗體半衰期均優(yōu)于親本抗體，5年后，該團(tuán)隊(duì)也成功改造出了具有鈣離子依賴的再循環(huán)抗體。隨著進(jìn)一步的研究，將Fc區(qū)段的改造和可變區(qū)的“再循環(huán)”改造結(jié)合起來(lái)的“清道夫抗體”概念被提出，旨在得到抗原清除效率和抗體半衰期的同步提升。

就天然抗體而言，雖然它與抗原結(jié)合具有高度特異性與強(qiáng)親和力，但它只能與抗原結(jié)合一次，如果體內(nèi)產(chǎn)生遠(yuǎn)大于抗體注射劑量的抗原，這就從根本上限制了它不能隨后中和更多抗原。因此改善藥物代謝動(dòng)力學(xué)中的延長(zhǎng)半衰期顯得尤為重要。近年來(lái)再循環(huán)抗體的問(wèn)世，很好地解決了傳統(tǒng)抗體的這種限制[12-14]。文中綜述了再循環(huán)抗體的研究進(jìn)展，包括其特點(diǎn)、改造途徑及發(fā)展?jié)摿Α?/p>

1 再循環(huán)抗體的作用機(jī)制

細(xì)胞外環(huán)境中的生物大分子以胞吞的形式形成囊泡進(jìn)入細(xì)胞，隨后與早期內(nèi)涵體融合，其中一些內(nèi)吞物被循環(huán)內(nèi)涵體循環(huán)至胞外，在早期內(nèi)涵體的成熟過(guò)程中，囊泡以出芽的形式從內(nèi)涵體上離開(kāi)并成熟為晚期內(nèi)涵體，晚期內(nèi)涵體進(jìn)一步融合溶酶體或進(jìn)一步成熟為溶酶體而降解內(nèi)含物[15]。因此再循環(huán)抗體在早期內(nèi)涵體中，與抗原解離，被循環(huán)內(nèi)涵體上的FcRn循環(huán)至胞外，解離的抗原隨著內(nèi)涵體的成熟最終被降解。再循環(huán)抗體主要有兩類：pH依賴性抗原結(jié)合再循環(huán)抗體和鈣離子依賴性抗原結(jié)合再循環(huán)抗體。

1.1 pH依賴性抗原結(jié)合再循環(huán)抗體

人血漿為中性，pH 7.4左右，而胞內(nèi)環(huán)境為酸性，pH 6.0左右，pH依賴性抗原結(jié)合再循環(huán)抗體能在血漿中結(jié)合抗原，抗原抗體復(fù)合物被內(nèi)化進(jìn)細(xì)胞后，在內(nèi)涵體酸性的環(huán)境下，pH依賴性抗原結(jié)合再循環(huán)抗體會(huì)與抗原解離，解離抗原的抗體被FcRn捕獲循環(huán)到胞外，在胞外中性的環(huán)境下，F(xiàn)cRn將抗體釋放，回到血漿中的抗體可以再結(jié)合別的抗原，實(shí)現(xiàn)抗體的循環(huán)使用。

將天然抗體改造成再循環(huán)抗體的關(guān)鍵是組氨酸的引入。組氨酸為帶正電的堿性氨基酸，是質(zhì)子的供體和受體，圖1為組氨酸的電子云密度 圖[16]，因?yàn)閭?cè)鏈咪唑基團(tuán)的存在，其pKa為6左右。酸性條件下組氨酸會(huì)發(fā)生質(zhì)子化，當(dāng)組氨酸位于抗原抗體相互作用的交界面時(shí)，如果它是二者相互作用的關(guān)鍵氨基酸，質(zhì)子化的發(fā)生會(huì)直接影響二者的結(jié)合作用；如果組氨酸是維持構(gòu)象的骨架氨基酸，質(zhì)子化的發(fā)生會(huì)造成構(gòu)象的變化而動(dòng)搖二者的結(jié)合[17]。在抗體的適當(dāng)表位引入適當(dāng)數(shù)量的組氨酸，就可能賦予抗體pH依賴性抗原結(jié)合的特性。

圖1 組氨酸電子云密度圖[16]

目前獲得pH依賴性抗原結(jié)合再循環(huán)抗體的方法有組氨酸突變法、天然抗體庫(kù)篩選法、富含組氨酸的合成文庫(kù)篩選法、重組組氨酸抗體文庫(kù)篩選法[18-19]。組氨酸突變法通過(guò)在抗體的CDR或FR的某些位點(diǎn)引入組氨酸，來(lái)達(dá)到pH依賴性抗原結(jié)合的改造效果[12]。天然抗體庫(kù)篩選方法是直接從天然的抗體庫(kù)中篩選具有pH依賴性抗原結(jié)合特性的抗體，它可以是免疫過(guò)的動(dòng)物體或者是人的抗體cDNA文庫(kù)[20]，因?yàn)樘烊豢贵wCDR序列中組氨酸占比只有0.5%–0.6%[17,20]，所以此法的pH依賴性抗原結(jié)合特性的抗體得率不到5%[19]。重組組氨酸文庫(kù)篩選方法是在富含組氨酸的文庫(kù)基礎(chǔ)上，通過(guò)噬菌體[20]或酵母展示[21]的方法，實(shí)現(xiàn)抗原結(jié)合和pH依賴結(jié)合特性的同步篩選。

1.2 鈣離子依賴性抗原結(jié)合再循環(huán)抗體

人血漿環(huán)境和內(nèi)涵體環(huán)境，除酸堿性有差異外，鈣離子的濃度也有很大的不同。對(duì)于某些改造難度大的抗體 (已在親本的基礎(chǔ)上進(jìn)行了基因工程改造的抗體)，或是靶向帶負(fù)電或者是質(zhì)子受體的抗原結(jié)合表位的抗體，組氨酸介導(dǎo)的pH依賴性抗原結(jié)合改造效果可能會(huì)受到限制，如果將抗體可變區(qū)改造成具有對(duì)鈣離子濃度差異敏感的特性，來(lái)替代pH依賴性抗原結(jié)合的改造，也能達(dá)到再循環(huán)抗體的改造效果。

鈣離子依賴性抗原結(jié)合再循環(huán)抗體較pH依賴性抗原結(jié)合類再循環(huán)抗體的優(yōu)勢(shì)主要體現(xiàn)在3個(gè)方面：1) 血漿中鈣離子的濃度為1.2–2 mmol/L，而內(nèi)涵體中為3–30 μmol/L，相差650倍，遠(yuǎn)遠(yuǎn)超過(guò)50倍的質(zhì)子濃度差；2) 內(nèi)涵體中抗體釋放鈣離子帶來(lái)的靜電位的差異遠(yuǎn)強(qiáng)于組氨酸的質(zhì)子化；3) 鈣離子較質(zhì)子有更大的離子殘基，在動(dòng)搖內(nèi)涵體中抗原抗體復(fù)合物上能發(fā)揮更大的作用[22]。

鈣離子依賴性抗原結(jié)合再循環(huán)抗體，在鈣離子濃度高的血漿中結(jié)合抗原，在鈣離子濃度低的內(nèi)涵體中釋放抗原，游離的抗原隨后被溶酶體降解，改造抗體則被FcRn捕獲再循環(huán)到胞外，釋放回血液中。因?yàn)槿搜獫{環(huán)境和內(nèi)涵體環(huán)境中鈣離子濃度巨大的差異，成功改造的鈣離子依賴性抗原結(jié)合再循環(huán)抗體能夠產(chǎn)生更大的親和力落差，更有利于內(nèi)涵體中抗原抗體復(fù)合物的分離，達(dá)到更好的抗體循環(huán)效果[17]。

相較于較早問(wèn)世的鈣離子依賴性抗原結(jié)合抗體 (抗體識(shí)別由鈣離子濃度差引起的抗原構(gòu)象變化)[23-25]，針對(duì)抗體可變區(qū)的改造，使抗體具有鈣離子依賴性抗原結(jié)合特性的方法，可以突破絕大多數(shù)抗原表位不具鈣離子結(jié)合特性的局限，有更大的應(yīng)用空間[22]。

2 再循環(huán)抗體的研究進(jìn)展

單克隆抗體的靶標(biāo)抗原可以分為兩類：膜抗原和可溶性抗原。針對(duì)這兩種不同的抗原，再循環(huán)抗體有相似的作用機(jī)制。

2.1 針對(duì)膜抗原

圖2A顯示了傳統(tǒng)抗體與膜抗原的結(jié)合情況。膜抗原表達(dá)在細(xì)胞膜表面，像IL-6R、EGFR、CD4、CD40等都是表達(dá)在膜上的抗原。天然抗體和膜抗原結(jié)合后被內(nèi)化進(jìn)細(xì)胞，在分揀內(nèi)涵體作用下，抗原抗體復(fù)合物被轉(zhuǎn)運(yùn)到溶酶體，最終二者因蛋白分解作用而降解。這就意味著傳統(tǒng)抗體只與抗原結(jié)合一次。并且靶向膜抗原的抗體因抗原介導(dǎo)的抗體清除作用，使其在體內(nèi)呈現(xiàn)非線性的清除效果[26-29]。如果靶向的膜抗原在機(jī)體有很高的表達(dá)水平，抗體在血液中又快速被清除，這就造成在很長(zhǎng)一段時(shí)間內(nèi)需要高劑量的抗體去中和該抗原。

圖2B展示了pH依賴性抗體結(jié)合膜抗原的情況。再循環(huán)抗體在細(xì)胞膜表面結(jié)合膜抗原后，被內(nèi)化進(jìn)細(xì)胞，在分揀內(nèi)涵體的酸性內(nèi)環(huán)境下，再循環(huán)抗體與抗原解離，抗原被分揀呈遞至溶酶體而被降解，“自由”的抗體被內(nèi)涵體中的FcRn捕獲而循環(huán)到胞外，在血漿的中性環(huán)境下，F(xiàn)cRn將抗體釋放，使其回流到血液中。通過(guò)重復(fù)這個(gè)循環(huán)，再循環(huán)抗體克服了傳統(tǒng)抗體只能與抗原結(jié)合一次的限制，實(shí)現(xiàn)多個(gè)抗原的結(jié)合，并且再循環(huán)抗體避免了抗原介導(dǎo)帶來(lái)的抗體清除，實(shí)現(xiàn)了更長(zhǎng)的藥物代謝。

Igawa團(tuán)隊(duì)首次于2010年利用組氨酸突變的方法將抗IL-6R的抗體 (妥珠單抗) 改造成了pH依賴性抗原結(jié)合抗體 (循環(huán)妥珠單抗SA237)，改造體保留了親本pH 7.4下的抗原親和力，增加了pH 6.0下與抗原快速解離的能力，在正常小鼠中，二者的藥物代謝相似，表明改造不會(huì)影響抗體的非特異性清除；在轉(zhuǎn)基因小鼠中，再循環(huán)抗體的抗原清除效果和抗體半衰期均優(yōu)于親本抗體[12]。該臨床研究結(jié)果進(jìn)一步證實(shí)了再循環(huán)抗體的功效。

鈣離子依賴性抗原結(jié)合類再循環(huán)抗體膜抗原的結(jié)合情況見(jiàn)圖2C。再循環(huán)抗體在血漿中的高鈣離子環(huán)境下結(jié)合膜抗原，隨后被內(nèi)化進(jìn)細(xì)胞，在內(nèi)涵體低鈣離子濃度環(huán)境下，再循環(huán)抗體與抗原解離，抗原被分揀呈遞至溶酶體而被降解，“自由”的抗體被內(nèi)涵體中的FcRn捕獲而循環(huán)到胞外，在血漿的中性環(huán)境下，F(xiàn)cRn將抗體釋放，使其回流到血液中，再結(jié)合下一個(gè)抗原。

Igawa團(tuán)隊(duì)于2015年通過(guò)噬菌體展示的方法從人的天然抗體庫(kù)中篩選得到1株抗IL-6R的鈣離子依賴性抗原結(jié)合再循環(huán)抗體6RL#9，該抗體在3 μmol/L CaCl2的環(huán)境中基本不與抗原結(jié)合，且共聚焦免疫熒光和小鼠動(dòng)物實(shí)驗(yàn)結(jié)果進(jìn)一步證實(shí)該抗體可以在內(nèi)涵體中解離抗原并能加速血漿中抗原的清除；通過(guò)對(duì)6RL#9-Fab和鈣離子復(fù)合物的結(jié)構(gòu)解析，他們還發(fā)現(xiàn)了一個(gè)新的連接鈣離子的氨基酸組合 (D，D，E)[22]。

圖2 抗體改造原理圖

2.2 抗可溶性抗原

天然抗體結(jié)合到可溶性抗原上的情況如圖2D所示。天然抗體在血液中與可溶性抗原結(jié)合后通過(guò)非特異性胞吞或胞飲進(jìn)入細(xì)胞，抗原抗體復(fù)合物被轉(zhuǎn)運(yùn)到分揀內(nèi)涵體，在分揀內(nèi)涵體的酸性條件下，抗體的Fc區(qū)段會(huì)與FcRn結(jié)合，隨后FcRn將抗原抗體復(fù)合物循環(huán)到細(xì)胞表面，在血液的中性pH下，復(fù)合物與FcRn分離回到血液中。在這個(gè)過(guò)程中抗體以抗原抗體復(fù)合物的形式被循環(huán)，所以循環(huán)出去的抗體不能與下一個(gè)抗原結(jié)合，和針對(duì)膜抗原一樣，抗體也只能結(jié)合抗原一次。并且嚴(yán)重的是，大多數(shù)靶標(biāo)抗原不會(huì)與FcRn結(jié)合(只有IgG和白蛋白會(huì)與FcRn結(jié)合)，在沒(méi)有抗體的情況下，可溶性抗原一般會(huì)被轉(zhuǎn)運(yùn)至溶酶體被降解，但與抗體結(jié)合后，抗體會(huì)抑制這條降解途徑，所以這種循環(huán)會(huì)造成抗體介導(dǎo)的抗原濃度累積效應(yīng)，這種效應(yīng)在IL-6、MCP1、β-淀粉樣蛋白、鐵調(diào)素等其他抗原中也有報(bào)道[30-35]。當(dāng)機(jī)體內(nèi)的可溶性抗原大量存在時(shí)，抗原的累積會(huì)導(dǎo)致抗原抗體結(jié)合位點(diǎn)的快速飽和，使可與抗原結(jié)合的抗體消失。

圖2E和圖2F分別顯示了pH依賴性抗原結(jié)合再循環(huán)抗體和鈣離子依賴性抗原結(jié)合再循環(huán)抗體結(jié)合可溶性抗原的情況。在分揀內(nèi)涵體的酸性環(huán)境中，抗原抗體復(fù)合物中的再循環(huán)抗體會(huì)與可溶性抗原解離，使抗原轉(zhuǎn)運(yùn)到溶酶體被蛋白水解作用降解，與此同時(shí)，“自由”的再循環(huán)抗體通過(guò)FcRn而回到血液中。通過(guò)重復(fù)在血液中結(jié)合、內(nèi)涵體中解離、回流至血液這個(gè)循環(huán)，再循環(huán)抗體可以實(shí)現(xiàn)與多個(gè)可溶性抗原的結(jié)合，從而克服天然抗體的限制。再循環(huán)抗體形成的復(fù)合物能夠以非特異吞噬作用的速度，進(jìn)行抗原的降解，達(dá)到比天然抗體更有效的降解效果，而在體內(nèi)呈現(xiàn)減少的抗原累積和延長(zhǎng)的抗體半衰期[19]。

早前Devanaboyina等將噬菌體展示篩選得到抗IL-6的抗體 (0218)，進(jìn)行組氨酸定點(diǎn)突變，成功改造得到1株抗IL-6的pH依賴抗體 (VH4)。動(dòng)物實(shí)驗(yàn)分3組進(jìn)行，比較抗原清除的效果，分別是單獨(dú)注射可溶性抗原、0218和可溶性抗原、VH4和可溶性抗原，結(jié)果顯示：對(duì)比與單獨(dú)注射抗原組，0218顯著降低了IL-6的清除速率，VH4加速了血液中IL-6的清除速率[14]。Igawa團(tuán)隊(duì)也用抗原抗體共注射的方法評(píng)估IL-6的清除是否被再循環(huán)抗體加速，結(jié)果與Devanaboyina相似[12]，但是考慮到這種共注射模型并不能很好地模擬抗體注射時(shí)，機(jī)體內(nèi)抗原濃度已經(jīng)很高的狀況，Igawa團(tuán)隊(duì)對(duì)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)進(jìn)行了改進(jìn)：給小鼠植入一個(gè)抗原填充的灌流泵，使其持續(xù)不斷地向血液中輸入抗原，使血液中抗原濃度維持一個(gè)穩(wěn)定的水平。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示：相比于基線抗原水平，妥珠單抗的注射導(dǎo)致了近20倍的血液抗原濃度增加，而循環(huán)妥珠單抗只帶來(lái)了2倍的增加，顯著減少了抗體介導(dǎo)的抗原累積效應(yīng)[36]。Chaparro-Riggers等用組氨酸掃描的方法成功改造了一株抗PCSK9 (一種可溶性抗原，可以抑制LDL受體的降解從而減少LDL膽固醇在血液中的水平) 的抗體 (J10)。改造突變體 (J17) 在野生型的小鼠中有明顯延長(zhǎng)的半衰期，達(dá)14.4 d，而親本抗體只有2.9 d，在食蟹猴的實(shí)驗(yàn)中，突變體有7.4 d的半衰期，而親本只有0.9 d[13]。最近Henne等將弱pH依賴的抗PCSK9的抗體改造成再循環(huán)抗體，在野生小鼠實(shí)驗(yàn)中，抗體半衰期有2.6倍的延長(zhǎng)，并且在FcRn敲除的小鼠中，親本和突變體有一樣的0.7 d的半衰期，說(shuō)明再循環(huán)抗體的回流需要FcRn的參與[37]。不同于在抗體可變區(qū)中引入組氨酸達(dá)到改造效果的突變方法，F(xiàn)ukuzawa團(tuán)隊(duì)得到1株能特異地與酸性條件下結(jié)構(gòu)發(fā)生改變的C5分子進(jìn)行pH依賴性抗原結(jié)合的再循環(huán)抗體SKY59，在食蟹猴的效果評(píng)估中，SKY59單針注射可達(dá)到8周的抑制效果，而無(wú)該pH依賴結(jié)合特性的抗體在多針高劑量注射下只有5周的抑制效果，并且在靜脈和皮下結(jié)合的注射方式摸索結(jié)果顯示SKY59能有效地抑制PNH病人中溶血因子的活性[38]。

單獨(dú)的組氨酸突變或組氨酸掃描的方法得到的再循環(huán)抗體，有很大的可能性會(huì)“犧牲”掉中性pH下與抗原的結(jié)合能力，而結(jié)合噬菌體展示或酵母展示可實(shí)現(xiàn)抗原高親和力和pH依賴性的同步篩選，減輕中性條件下抗原結(jié)合能力降低的程度。Mur-taugh等以抗RNase A 的單域抗體VHH與抗原復(fù)合物的結(jié)構(gòu)模擬為指導(dǎo)，對(duì)其CDR1和CDR3的所有氨基酸進(jìn)行了簡(jiǎn)并組氨酸突變，構(gòu)建了一個(gè)噬菌體庫(kù)，從這個(gè)庫(kù)中篩得的再循環(huán)抗體 (V#24) 在中性條件下與抗原的親和力是親本的5倍，在酸性條件下的解離常數(shù)比親本大約3倍，并在對(duì)比親本與突變體分別與抗原的復(fù)合物結(jié)構(gòu)中發(fā)現(xiàn)：酸性環(huán)境下組氨酸的質(zhì)子化使其與抗原形成的氫鍵斷裂，且組氨酸附近正電基團(tuán)的微環(huán)境對(duì)改造成功很關(guān)鍵[20]。Bonvin等從頭合成了一個(gè)重鏈CDR3富含組氨酸的抗CXCL10的pH依賴抗體的噬菌體庫(kù)，從中篩選得到的突變體在中性條件下與抗原的親和力能達(dá)到nmol/L級(jí)，但酸性條件下基本上不與抗原結(jié)合，兩個(gè)pH下解離常數(shù)的比值為22倍[39]。Schroter等以一株抗TNF的抗體為親本，通過(guò)對(duì)其CDR區(qū)進(jìn)行簡(jiǎn)并突變構(gòu)建了一個(gè)組合庫(kù)，并用酵母展示的方法進(jìn)行了3輪篩選，得到了pH依賴突變體，在親和力的檢測(cè)結(jié)果中，突變體在兩個(gè)pH值下解離常數(shù)的比值為785倍，而親本抗體只有9倍[21]。

這些研究證實(shí)了針對(duì)可溶性抗原的再循環(huán)抗體能更快地清除抗原，且能減少抗體介導(dǎo)的抗原累積效應(yīng)，因此降低了抗體的注射劑量。

3 再循環(huán)抗體的進(jìn)一步改造

針對(duì)可溶性抗原的再循環(huán)抗體可進(jìn)行進(jìn)一步的改造，達(dá)到抗原清除和抗體半衰期進(jìn)一步改善。

3.1 增強(qiáng)pH 6.0下與FcRn的親和力

IgG型抗體在酸性環(huán)境的內(nèi)涵體中，能被FcRn捕獲而循環(huán)到胞外，這也是此類型抗體免受非特異性清除的主要原因。已有研究針對(duì)增強(qiáng)與FcRn親和力的Fc改造，旨在使抗體的補(bǔ)救更有效，結(jié)果證實(shí)改造突變體能延長(zhǎng)抗體的半衰期[40]。本研究團(tuán)隊(duì)前期針對(duì)HBV的人源化IgG抗體，設(shè)計(jì)了5種突變組合來(lái)增強(qiáng)酸性條件下抗體與FcRn的親和力，經(jīng)過(guò)體外親和力的檢測(cè)后，選取YTE進(jìn)行動(dòng)物模型效果評(píng)估，突變體YTE在食蟹猴和轉(zhuǎn)HBV小鼠中的抗體血清半衰期較親本有2.5倍和1.5倍的延長(zhǎng)[41]。但是同樣也引起了后續(xù)的抗原清除速率變慢、抗原累積的現(xiàn)象，本團(tuán)隊(duì)后續(xù)也進(jìn)行了進(jìn)一步的pH依賴及清道夫抗體的改造。如前文所述，在FcRn敲除鼠或者非FcRn結(jié)合突變體的動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中，再循環(huán)抗體較親本在半衰期上并沒(méi)有展現(xiàn)較大的優(yōu)勢(shì)，說(shuō)明再循環(huán)抗體的回流需要FcRn的參與[12,37]。所以將再循環(huán)抗體的Fc區(qū)段進(jìn)行改造，增強(qiáng)與FcRn的親和力，給抗體的循環(huán)加上“雙保險(xiǎn)”，這無(wú)疑能更大地延長(zhǎng)半衰期。

Henne等將改造得到的抗PCSK9的再循環(huán)抗體的Fc區(qū)段進(jìn)行改造，在與FcRn親和力的檢測(cè)中，突變體是親本的7倍，且在食蟹猴中的半衰期是親本的2倍，說(shuō)明Fc針對(duì)增強(qiáng)酸性條件與FcRn親和力的改造能改善抗體半衰期[32]。

但這種改造需要注意的是，在針對(duì)膜抗原的再循環(huán)抗體上，酸性pH下親和力的提升帶來(lái)的中性pH下的親和力提升，這就會(huì)使抗體不能被釋放，而限制了再循環(huán)抗體與別的膜抗原結(jié)合。

3.2 進(jìn)一步改造成清道夫抗體

抗體的pH依賴抗原結(jié)合改造和再循環(huán)抗體針對(duì)酸性條件下增強(qiáng)與FcRn親和力的改造，都是在抗原抗體復(fù)合物內(nèi)化進(jìn)細(xì)胞時(shí)發(fā)揮作用，而細(xì)胞非特異性地吞噬抗原抗體復(fù)合物的速率很慢，即抗原清除受限的關(guān)鍵原因是復(fù)合物的捕獲，如果能將再循環(huán)抗體進(jìn)一步改造(即清道夫抗體)，使其錨定在細(xì)胞表面，當(dāng)抗體一抓到抗原后，復(fù)合物即刻被內(nèi)化進(jìn)細(xì)胞，無(wú)疑能更進(jìn)一步地加快抗原的清除和延長(zhǎng)抗體的半衰期。

3.2.1 增強(qiáng)中性pH下與FcRn的親和力

野生型IgG1在pH 7.4與FcRn的結(jié)合很微弱，通過(guò)改造增強(qiáng)中性環(huán)境下抗體與FcRn 的親和力，使其成為清道夫抗體而錨定在胞外，達(dá)到抗原清除效果和抗體半衰期的進(jìn)一步提升 (圖2G)。Igawa團(tuán)隊(duì)得到了一株經(jīng)過(guò)Fc改造的再循環(huán)抗體，適度增強(qiáng)在中性條件下與FcRn的親和力，突變體較親本有約700倍的增強(qiáng)，其形成的抗原抗體復(fù)合物能在FcRn的介導(dǎo)下快速地進(jìn)入細(xì)胞，因此較再循環(huán)抗體能降解更多的抗原。在人FcRn轉(zhuǎn)基因鼠的體內(nèi)研究顯示，突變體的可溶性抗原清除速率較親本加快了近50倍，同時(shí)抗體能維持野生型IgG1抗體相近的藥代。但是他們發(fā)現(xiàn)，與適度增強(qiáng)與FcRn親和力的清道夫抗體相比，另一個(gè)在中性pH下顯著增強(qiáng)與FcRn親和力的清道夫突變體 (2 500倍增強(qiáng))，有更快的抗原清除，但也伴隨抗體清除的增加[36]。早年Vaccaro就有報(bào)道發(fā)現(xiàn)，對(duì)IgG1型抗體的Fc區(qū)段進(jìn)行改造，增強(qiáng)中性條件下與FcRn親和力，會(huì)改變內(nèi)涵體中抗體的濃度[42]。所以中性條件下與FcRn的親和力并不是越大越好，還取決于不同靶標(biāo)可溶性抗原的特性。

3.2.2 增強(qiáng)與FcγⅡb的親和力

既然FcRn的清道夫抗體能極大限度地降低血液中抗原的濃度，那么其他受體介導(dǎo)的再循環(huán)IgG抗體可能也有這個(gè)功效 (圖2H)。研究發(fā)現(xiàn)IgG抗體的Fc區(qū)段能與FcγRs結(jié)合[43]，人的FcγRs分為6個(gè)亞類：FcγⅠ、FcγⅡa、FcγⅡb、FcγⅡc、FcγⅢa、FcγⅢb[44]，其中FcγⅡb有一個(gè)免疫受體酪氨酸抑制基序 (ITIM)，是抑制型受體，在人的B細(xì)胞、肥大細(xì)胞、肝細(xì)胞上都有表達(dá)[35-46]，它在激活B細(xì)胞、移除免疫復(fù)合物中發(fā)揮關(guān)鍵作用[17]。鼠的FcγRs分為4類：FcγⅠ、FcγⅡ、FcγⅢ、FcγⅣ，其中FcγⅡ是抑制型受體[17,47]。

Igawa團(tuán)隊(duì)針對(duì)這類受體的抗可溶性IL-6R的再循環(huán)抗體展開(kāi)研究，他們首先構(gòu)建了針對(duì)鼠FcγRs的突變體，這個(gè)突變體就FcγⅡ和FcγⅢ兩個(gè)受體有100倍的親和力提升，且顯著地降低了IL-6R的濃度，在這兩個(gè)受體分別敲除的鼠實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)，F(xiàn)cγⅡ?yàn)槊庖邚?fù)合物捕獲的主要受體，基于這個(gè)結(jié)果，該團(tuán)隊(duì)隨后構(gòu)建了針對(duì)人FcγⅡb的抗可溶性IL-6R的再循環(huán)抗體 (V12)，在人FcγⅡb轉(zhuǎn)基因鼠的實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，V12突變體在維持與再循環(huán)抗體相當(dāng)?shù)乃幬锎x動(dòng)力學(xué)同時(shí)，有更快的抗原清除效果[48]。

4 總結(jié)與展望

靶標(biāo)機(jī)體內(nèi)高基線濃度或合成速率的膜抗原或可溶性抗原的抗體，高的皮下注射劑量及頻繁的給藥頻率才能中和靶標(biāo)分子，而再循環(huán)抗體的“循環(huán)特性”使抗體分子能多次結(jié)合抗原，從而達(dá)到天然抗體無(wú)法達(dá)到的長(zhǎng)半衰期，因此可以在一定程度上降低注射劑量，減少給藥頻率，給患者的治療帶來(lái)便利。

需要注意的是再循環(huán)抗體改造的是抗體的可變區(qū)，改造很有可能會(huì)造成中性條件下與抗原親和力的缺失或下降，并且可變區(qū)的改造難度大，適應(yīng)性不強(qiáng)，抗體蛋白的性質(zhì) (如產(chǎn)量、穩(wěn)定性、表達(dá)水平、表達(dá)宿主等) 很可能也會(huì)受到影響，還可能增加免疫原性等諸多非預(yù)期“副作用”，變體要既能維持與親本相當(dāng)?shù)目乖Y(jié)合能力，又要具有再循環(huán)特性，這就對(duì)改造方法提出了很高的要求。此外，再循環(huán)抗體臨床前動(dòng)物實(shí)驗(yàn)評(píng)估階段，因?yàn)閯?dòng)物模型的稀缺與評(píng)價(jià)手段的不完善，外來(lái)抗原的異源性會(huì)對(duì)抗體改造效果的評(píng)估帶來(lái)很大干擾[19]。

再循環(huán)抗體經(jīng)過(guò)Fc改造的清道夫抗體，在維持與親本相當(dāng)?shù)陌胨テ诘耐瑫r(shí)能有更快的抗原清除速率。雖然Fc的改造適用性強(qiáng)，基本不會(huì)帶來(lái)嚴(yán)重的免疫原性，但是針對(duì)不同可變區(qū)的同一有效突變改造，也可能存在改造效果的差異。并且近年來(lái)的研究表明，抗體的帶電性質(zhì) (如表面電荷的分布、等電點(diǎn)的大小) 及抗體的親疏水性等性質(zhì)對(duì)抗體的半衰期也有很明顯影響[49-51]。因此，在再循環(huán)抗體的可變區(qū)改造和在再循環(huán)抗體基礎(chǔ)上進(jìn)行Fc的清道夫抗體的改造前，對(duì)候選分子的理化性質(zhì)分析，及改造后分子理化性質(zhì)的綜合評(píng)估，使其在抗體天然特征的正常水平范圍內(nèi)，無(wú)疑更能確保改造的成功性[50]。所以清道夫抗體的改造要求更高，難度更大，臨床前評(píng)估更難。

清道夫抗體較再循環(huán)抗體，如抗IgE的抗 體[52]、抗C5的抗體[53-54]，它的注射劑量需求進(jìn)一步下降，可能改變某些靜脈給藥的抗體為皮下注射，極大地便利了患者的治療，且緩解了醫(yī)院床位的壓力。某些病變組織或癌癥組織中高表達(dá)的可溶性抗原也是清道夫抗體的潛在靶標(biāo)，如膠質(zhì)母細(xì)胞瘤囊液中的VEGF[55]、腫瘤中高濃度的IL-6[56]、MIF[57]、類肝素表皮生長(zhǎng)因子的生長(zhǎng)因子[58]、類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎患者滑液中高濃度的核因子?B配體[59]、哮喘患者支氣管肺泡灌洗液中高濃度的IL-13[60]、阿茲海默癥患者腦中聚集的β-淀粉樣蛋白[17]。并且清道夫可以靶向非中和表位，通過(guò)直接從血液中移除可溶性抗原，達(dá)到抑制抗原活性的效果[28]。針對(duì)具有多中和表位的可溶性抗原，單一天然抗體只能中和其中一個(gè)表位，其余中和表位仍在，“空”表位的信號(hào)增強(qiáng)可能給機(jī)體帶來(lái)不良反應(yīng)，清道夫抗體能很好地阻斷這種效應(yīng)的發(fā)生。同樣的策略可以應(yīng)用于不具功能的表位、不能通過(guò)天然抗體靶向治療的毒性抗原上，如LDL和脫唾液酸糖蛋白，功效類似于LDL受體和脫唾液酸糖蛋白受體從血漿中移除毒性抗原，從而減緩病癥[61-62]。因此，清道夫抗體也許能拓寬針對(duì)靶向抗原的抗體治療的空間，給抗體治療帶來(lái)新紀(jì)元。

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Advance in research on recycling antibody

Can Wen1, Yuanzhi Chen2, and Wenxin Luo2

1 National Institute of Diagnostics Vaccine Development in Infectious Disease, School of Life Sciences, Xiamen University, Xiamen 361102, Fujian, China 2School of Public Health, Xiamen University, Xiamen 361102, Fujian, China

Monoclonal antibodies have become the main type of antibody drug because of their high specificity and strong affinity to antigen. However, with the intensive study of the natural monoclonal antibody, many defects have faced, such as the limit times of binding to antigen, the unanticipated antibody clearance and antigen accumulation. Therefore, studies are no longer limited to the natural antibody screening, but rather to improve the efficiency of antibody drugs by engineering. In recent years, the bottlenecks in the development of conventional antibody have been solved effectively since the discovery of a novel recycling antibody. Recycling antibody binds to an antigen in plasma and dissociates from the antigen in endosome, thus maximizing the use of antibody and reducing antigen-mediated antibody clearance and antibody-mediated antigen accumulation. In addition, recycling antibodies can enhance the affinity with Fc receptors through further Fc modification. This paper reviews the research progress of circulating antibodies, including its characteristics, transformation methods and prospects.

monoclonal antibodies, recycling antibody, antibody engineering

May 11, 2018;

August 14, 2018

National Natural Science Foundation of China (No. 31600748), Natural Science Foundation of Fujian Province (No. 2017J01066), Major Projects of Infectious Diseases (No. 2017ZX10202203-001-001).

Wenxin Luo. Tel/Fax: +86-592-2184113; E-mail: wxluo@xmu.edu.cn

10.13345/j.cjb.180202

國(guó)家自然科學(xué)基金 (No. 31600748)，福建省自然科學(xué)基金 (No. 2017J01066)，傳染病重大專項(xiàng) (No. 2017ZX10202203-001-001)資助。

(本文責(zé)編 郝麗芳)