張夢(mèng)筱，朱建偉，路慧麗

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抗體藥物表達(dá)技術(shù)最新進(jìn)展

張夢(mèng)筱，朱建偉，路慧麗

上海交通大學(xué) 藥學(xué)院 細(xì)胞工程及抗體藥物教育部工程研究中心，上海 200240

生物技術(shù)藥物是21世紀(jì)醫(yī)藥工業(yè)發(fā)展的中堅(jiān)力量，其中單克隆抗體類藥物是生物技術(shù)藥物的典型代表，是惡性腫瘤、自身免疫病等領(lǐng)域全球銷售額最高的藥品種類。在抗體藥物發(fā)展的幾十年里，隨著基因工程、蛋白質(zhì)工程等領(lǐng)域的發(fā)展，抗體生產(chǎn)的宿主細(xì)胞建立、表達(dá)、純化等各階段的技術(shù)均不斷取得突破，文中綜述和討論了抗體藥物生產(chǎn)所采用的真核哺乳動(dòng)物細(xì)胞表達(dá)系統(tǒng)、原核大腸桿菌表達(dá)系統(tǒng)、轉(zhuǎn)基因動(dòng)物反應(yīng)器、無(wú)細(xì)胞蛋白質(zhì)合成系統(tǒng)以及相關(guān)的關(guān)鍵技術(shù)進(jìn)展。

抗體藥物，表達(dá)系統(tǒng)，哺乳動(dòng)物細(xì)胞，生產(chǎn)，CRISPR

抗體藥物是利用人體免疫系統(tǒng)，通過(guò)抗原抗體的特異性反應(yīng)達(dá)到靶向阻斷或消滅攜帶抗原的細(xì)胞或抗原本身、達(dá)到治療疾病目的的大分子藥物。2000年之后，隨著腫瘤病理機(jī)制的研究不斷深入，人們陸續(xù)發(fā)現(xiàn)大量的疾病治療新靶標(biāo)，例如CTLA-4、PD-1/PD-L1[1]、CD27[2]、TNF[3]和IL-6[4]等。針對(duì)這些靶點(diǎn)，以單克隆抗體為主的大分子藥物用于臨床，成為“精準(zhǔn)醫(yī)療”的重要組成成分。在腫瘤研究領(lǐng)域，有多種特異性殺傷腫瘤細(xì)胞的經(jīng)典抗體藥物如Trastuzumabinjection (羅氏，商品名Herceptin)[5]，Bevacizumab (羅氏，商品名為Avastin)[6]等，以及近年獲批的通過(guò)激活腫瘤免疫發(fā)揮作用的PD-1單克隆抗體Nivolumab (百時(shí)美施貴寶，商品名Opdivo)[7]和PD-L1單克隆抗體Atezolizumab (基因泰克，商品名Tencentriq)[8]等。而在自身免疫性疾病治療方面，以抗體為主的生物藥物更是占主導(dǎo)地位。例如治療類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎的阿達(dá)木單抗 (艾伯維，商品名Humira)[9]，從2012年開(kāi)始，它連續(xù)多年蟬聯(lián)世界上最暢銷的藥物榜首[10]。由于出色的臨床效果和市場(chǎng)占有率，較早上市的一批抗體藥物的專利保護(hù)逐漸到期，抗體藥物的類似藥發(fā)展也如火如荼，使得越來(lái)越多的抗體藥物加速涌入市場(chǎng)。

單克隆抗體技術(shù)是在1975年由英國(guó)科學(xué)家Milstein和Kohler所發(fā)明，并獲得1984年諾貝爾醫(yī)學(xué)獎(jiǎng)[11]。而在隨后的短短40年內(nèi)，抗體的工業(yè)生產(chǎn)得到了長(zhǎng)足發(fā)展。目前的單克隆抗體主要分為鼠源性單克隆抗體，人鼠嵌合抗體 (由鼠源的可變區(qū)和人源的恒定區(qū)組成)[12]，人源化單克隆抗體[13]，人源性單克隆抗體等[14]；從分子形式上又可分為全長(zhǎng)抗體，抗原結(jié)合片段 (Antigen-binding fragment，F(xiàn)ab)[15]，單鏈抗體 (Single chain antibody fragment，scFv)[16]，單域抗體，最小識(shí)別單位等。此外，隨著技術(shù)進(jìn)步，出現(xiàn)了能夠識(shí)別兩個(gè)或多個(gè)靶點(diǎn)的雙特異性抗體[17]、多特異性抗體[18]，以及抗體偶聯(lián)小分子藥物[19](Antibody-drug conjugates，ADC) 或免疫毒素[20](Immunotoxin) 等新型抗體藥物。

機(jī)體分泌抗體的細(xì)胞是B細(xì)胞，將其與骨髓瘤細(xì)胞融合在一起就可獲得既能夠產(chǎn)生單克隆抗體又具有永生化能力的雜交瘤細(xì)胞，從而實(shí)現(xiàn)抗體的長(zhǎng)期制備[21-22]。然而，雜交瘤細(xì)胞基因組通常不穩(wěn)定，且天然免疫動(dòng)物產(chǎn)生的抗體注射到人體內(nèi)易產(chǎn)生免疫原性[23]，目前雜交瘤技術(shù)所制備的抗體多用于診斷試劑類產(chǎn)品，而臨床應(yīng)用的抗體類藥物則需采用穩(wěn)定性較好的工程系統(tǒng)進(jìn)行制備，包括哺乳動(dòng)物細(xì)胞表達(dá)系統(tǒng)、大腸桿菌表達(dá)系統(tǒng)、轉(zhuǎn)基因動(dòng)物反應(yīng)器與無(wú)細(xì)胞系統(tǒng)。而這些領(lǐng)域的關(guān)鍵技術(shù)在最近幾年取得令人矚目的進(jìn)展，文中將對(duì)其進(jìn)行綜述和分析。

1 哺乳動(dòng)物細(xì)胞表達(dá)系統(tǒng)

重組蛋白生產(chǎn)系統(tǒng)分為原核表達(dá)系統(tǒng)和真核表達(dá)系統(tǒng)，真核表達(dá)系統(tǒng)包括昆蟲細(xì)胞表達(dá)系統(tǒng)、植物細(xì)胞表達(dá)系統(tǒng)、酵母細(xì)胞表達(dá)系統(tǒng)和哺乳動(dòng)物細(xì)胞表達(dá)系統(tǒng)等。哺乳動(dòng)物細(xì)胞是臨床抗體藥物產(chǎn)品使用的主要的真核重組蛋白生產(chǎn)系統(tǒng)類型，與原核及其他真核表達(dá)系統(tǒng)相比具有以下優(yōu)勢(shì)：1) 能夠完成產(chǎn)物的翻譯后修飾，可形成正確的二硫鍵和高級(jí)結(jié)構(gòu)，且分泌表達(dá)便于下游純化；2) 生產(chǎn)過(guò)程無(wú)內(nèi)毒素污染；3) 技術(shù)成熟，單克隆抗體表達(dá)水平高，產(chǎn)量可達(dá)10?20 g/L[24-25]。常用的哺乳動(dòng)物細(xì)胞有中國(guó)倉(cāng)鼠卵巢細(xì)胞 (Chinese hamster ovary cells，CHO)，人類胚胎腎 (Human embryonic kidney cell，HEK) 293細(xì)胞，小鼠骨髓淋巴瘤細(xì)胞 (NS0和Sp2/0-Ag14)等[26]。

對(duì)于哺乳動(dòng)物細(xì)胞表達(dá)系統(tǒng)，人們?nèi)灾铝τ谔岣弋a(chǎn)量及產(chǎn)品的質(zhì)量穩(wěn)定性，從各個(gè)方面不斷進(jìn)行研究，主要包括：1) 通過(guò)基因編輯對(duì)細(xì)胞翻譯修飾和分泌能力進(jìn)行改進(jìn)，包括靶向參與糖基化相關(guān)基因來(lái)提高抗體依賴性細(xì)胞毒性 (Antibody dependent cell mediated cytotoxicity，ADCC) 等的功能或整合目標(biāo)基因至特定位點(diǎn)，提高細(xì)胞株穩(wěn)定性；2) 延長(zhǎng)細(xì)胞存活及生產(chǎn)時(shí)間，從而提高產(chǎn)量，如通過(guò)靶向促凋亡基因，改變細(xì)胞代謝和采用生產(chǎn)過(guò)程控制[27]；3) 在瞬時(shí)轉(zhuǎn)染系統(tǒng)中優(yōu)化表達(dá)載體，提高抗體工業(yè)生產(chǎn)中哺乳動(dòng)物細(xì)胞的生產(chǎn)滴度，并研究瞬時(shí)表達(dá)系統(tǒng)的穩(wěn)定性，實(shí)現(xiàn)快速臨床前樣品的制備和篩選[28]。

1.1 基因編輯技術(shù)改造哺乳動(dòng)物細(xì)胞

基因編輯技術(shù)是對(duì)基因組進(jìn)行精確修飾的一種生物技術(shù)，通過(guò)DNA雙鏈的斷裂，引發(fā)DNA修復(fù)系統(tǒng)進(jìn)行非同源末端連接 (Non-homologous end joining，NHEJ) 或同源重組 (Homologous recombination，HR)[29]從而導(dǎo)致基因的定點(diǎn)突變、敲除和插入。常用的三大基因編輯技術(shù)包括鋅指核酸酶技術(shù) (Zinc finger nucleases，ZFNs)、轉(zhuǎn)錄激活效應(yīng)因子核酸酶技術(shù) (Transcription activator-like effector nucleases，TALENs) 和規(guī)律成簇的間隔短回文重復(fù) (Clustered regularly interspaced short palindromic repeats，CRISPR) 基因編輯技術(shù)[30]。研究人員目前能夠采用基因編輯技術(shù)高效地改造哺乳動(dòng)物細(xì)胞基因組，從而使其獲得理想的表達(dá)性能。

單個(gè)ZFNs單位是由3?4個(gè)鋅指蛋白串聯(lián)而成的DNA識(shí)別域與一個(gè)非特異性限制性內(nèi)切酶單體融合產(chǎn)生的。兩個(gè)鋅指核酸酶單位通過(guò)結(jié)合DNA的兩條相反鏈，使該非特異性限制性內(nèi)切酶形成二聚體，從而對(duì) DNA鏈進(jìn)行切割，再通過(guò)DNA修復(fù)系統(tǒng)進(jìn)行修復(fù)，從而達(dá)到基因編輯的目的[31]。但ZFNs容易形成同源二聚體，也存在單個(gè)ZFNs單位切割的現(xiàn)象。雖然研究人員對(duì)其特異性進(jìn)行了相關(guān)改造，但還是存在脫靶現(xiàn)象和細(xì)胞毒性。單個(gè)TALENs單位由能特異性識(shí)別DNA序列的TAL效應(yīng)子和核酸酶組成。其DNA識(shí)別域識(shí)別單個(gè)核苷酸，故在構(gòu)建TALENs質(zhì)粒載體時(shí)需要根據(jù)靶位點(diǎn)編碼區(qū)構(gòu)建DNA識(shí)別模塊[32]。TALENs相比ZFNs有更長(zhǎng)的識(shí)別區(qū)域，但其識(shí)別區(qū)域模塊化的組裝復(fù)雜且昂貴，大多依靠相關(guān)公司進(jìn)行構(gòu)建和生產(chǎn)。在2013年，張鋒團(tuán)隊(duì)開(kāi)發(fā)出了CRISPR/Cas9基因編輯技術(shù)，是目前最簡(jiǎn)便高效的基因編輯系統(tǒng)[30]。該技術(shù)利用一種來(lái)源于原核生物中的抵抗外源基因入侵的獲得性免疫系統(tǒng)，由RNA指導(dǎo)的Cas蛋白對(duì)靶基因進(jìn)行修飾[29]，可以實(shí)現(xiàn)多位點(diǎn)編輯。雖然CRISPR/Cas9伴隨著不容忽視的脫靶效應(yīng)，但它操作簡(jiǎn)便、成功率高，是至今為止最先進(jìn)的基因編輯技術(shù)和生物醫(yī)藥領(lǐng)域的研究熱點(diǎn)。

1.1.1 改善糖基化修飾提高抗體產(chǎn)品抗腫瘤活性

在免疫過(guò)程中，抗體常通過(guò)兩種途徑殺死靶細(xì)胞來(lái)執(zhí)行其免疫功能：1) Fc區(qū)被C1q結(jié)合，激活補(bǔ)體級(jí)聯(lián)并形成膜攻擊復(fù)合物的補(bǔ)體依賴性細(xì)胞毒性 (Complement dependent cytotoxicity，CDC)；2) Fc區(qū)與天然殺傷細(xì)胞 (Natural killer cell，NK) 的Fc受體FcgR Ⅲ識(shí)別，并釋放導(dǎo)致細(xì)胞溶解物質(zhì)的ADCC作用[33]。研究發(fā)現(xiàn)，人類lgG1抗體的N-聚糖中去除核心巖藻糖，能夠提高Fc與FcgRⅢ受體的親和力，從而可顯著提高ADCC[34]。

核心巖藻糖通常由兩個(gè)關(guān)鍵步驟合成：1) α-1.6-巖藻糖基轉(zhuǎn)移酶 (Fucosyltransferase-8，F(xiàn)UT-8) 能將核心巖藻糖轉(zhuǎn)移到抗體的N-聚糖上[35]；2)基因合成GDP-巖藻糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白，使GDP-巖藻糖轉(zhuǎn)運(yùn)到高爾基體中，使其核心巖藻糖化[33]。研究人員已成功使用CRISPR/Cas9基因編輯技術(shù)在CHO細(xì)胞中敲除合成FUT-8的基因[34]，并通過(guò)ZFNs、TALENs和CRISPR/Cas9基因編輯技術(shù)來(lái)敲除基因，以產(chǎn)生去巖藻糖基化抗體。通過(guò)比較這3種基因編輯技術(shù)在敲除基因中的作用，研究人員發(fā)現(xiàn)CRISPR/Cas9基因編輯技術(shù)雖然具有脫靶現(xiàn)象，但具有最高的基因修飾活性。與之相比，ZFNs由于受鋅指之間的串?dāng)_和3 bp目標(biāo)位點(diǎn)的重疊效應(yīng)引起的鋅指單元的上下依賴效應(yīng)而變得復(fù)雜，而TALENs技術(shù)由于不能在設(shè)計(jì)階段預(yù)知其作用的效果以及發(fā)揮作用的部分而受到限制[33]。

在Fc區(qū)的Asn297殘基處的雙觸角N-聚糖分支中的半乳糖對(duì)抗體功能也起著十分關(guān)鍵的作用，研究報(bào)道在此位點(diǎn)半乳糖的增加同樣可以提高ADCC和CDC的活性[36]。在野生型CHO細(xì)胞中，lgG的糖型主要是G0F和G1F。最近的一項(xiàng)研究中，研究人員利用CRISPR/Cas9技術(shù)敲除CHO細(xì)胞中Fc區(qū)的兩種α-2.3-唾液酸轉(zhuǎn)移酶位點(diǎn)，使Asn297殘基更容易接受糖基轉(zhuǎn)移酶，從而實(shí)現(xiàn)了80% G2F糖型的表達(dá)。但在后續(xù)敲除FUT-8后，總體完全半乳糖基化聚糖的相對(duì)比例下降，提示巖藻糖基轉(zhuǎn)移酶與半乳糖基轉(zhuǎn)移酶或N-乙酰葡萄糖氨基轉(zhuǎn)移酶的活性之間可能存在相關(guān)性[37]。

除了對(duì)糖基化程度的改造，研究人員還利用CRISPR/Cas9和TALENs技術(shù)進(jìn)行糖鏈缺陷型細(xì)胞系的開(kāi)發(fā)。CLEC-2通過(guò)唾液酸結(jié)合其內(nèi)源性受體hPDPN，從而參與血小板聚集和癌癥轉(zhuǎn)移。若hPDPN存在于癌細(xì)胞或者癌相關(guān)成纖細(xì)胞，則表明預(yù)后不良。該研究利用基因編輯技術(shù)，建立了聚糖缺陷的CHO-S 與HEK293K細(xì)胞系，并通過(guò)該細(xì)胞系確定唾液酸是新型抗hPDPN mAb LpMab-21的表位之一[38]。這為其他抗膜蛋白的新型抗體的表位是否具有唾液酸和N-聚糖研究提供了思路。

1.1.2 高產(chǎn)穩(wěn)轉(zhuǎn)細(xì)胞株的篩選和建立過(guò)程優(yōu)化

經(jīng)典方法建立高產(chǎn)穩(wěn)定細(xì)胞株依賴于外源基因?qū)λ拗骷?xì)胞基因組的隨機(jī)整合，因此很難保證插入位點(diǎn)表達(dá)水平以及細(xì)胞株生長(zhǎng)特性的穩(wěn)定。而采用CRISPR/Cas9等技術(shù)目前已經(jīng)能夠?qū)崿F(xiàn)將感興趣的目的基因 (Gene of interested，GOI) 定點(diǎn)整合到染色體基因組的特定位點(diǎn)。Grav等介紹了確定靶向基因序列、構(gòu)建sgRNA表達(dá)的質(zhì)粒、進(jìn)行轉(zhuǎn)染、利用流式細(xì)胞熒光分選技術(shù) (Fluorescence activated cell sorting，F(xiàn)ACS) 進(jìn)行陽(yáng)性篩選、擴(kuò)大克隆以及進(jìn)行基因分析等一系列操作，從而成功敲除CHO細(xì)胞中谷氨酰胺合成酶 (Glutamine synthetase，GS) 的過(guò)程，驗(yàn)證了這一可廣泛使用的單基因敲除通用方案[27]。

而通過(guò)定點(diǎn)整合獲得高產(chǎn)的穩(wěn)轉(zhuǎn)細(xì)胞株，其前提是能夠插入到具有較高轉(zhuǎn)錄活性的位點(diǎn)。本實(shí)驗(yàn)室通過(guò)篩選不同位點(diǎn)，最終確認(rèn)CHO-S細(xì)胞位點(diǎn)的定點(diǎn)整合能夠獲得產(chǎn)量及穩(wěn)定性俱佳的重組細(xì)胞株，而且采用CRISPR/Cas9介導(dǎo)該位點(diǎn)的定點(diǎn)整合，能夠使穩(wěn)轉(zhuǎn)細(xì)胞株的構(gòu)建時(shí)間縮短到2個(gè)月[39]，具體方法如圖1所示。

圖1 目的基因插入特異性位點(diǎn)流程圖(改自Zhao等[39])

在CRISPR/Cas9技術(shù)實(shí)施過(guò)程中，合適的同源臂是介導(dǎo)成功整合的要素之一，日本的研究人員使用插入位點(diǎn)側(cè)翼極短的微同源臂，將ScFv-Fc抗體基因靶向敲入CHO細(xì)胞的hprt基因座，獲得了生產(chǎn)效率滿意的細(xì)胞株[40]。

為了能夠?qū)λa(chǎn)生的蛋白進(jìn)行定量，有報(bào)道利用CRISPR/Cas9技術(shù)在導(dǎo)入GOI的同時(shí)導(dǎo)入一個(gè)蛋白定量報(bào)告基因 (Protein quantitatively reports genes，PQR)，用熒光連續(xù)監(jiān)測(cè)內(nèi)源蛋白和重組蛋白的表達(dá)水平，從而實(shí)現(xiàn)蛋白產(chǎn)量熒光強(qiáng)度的量化[41]。此外，建立穩(wěn)轉(zhuǎn)細(xì)胞系的經(jīng)典過(guò)程一般采用攜帶重組抗體和選擇標(biāo)記基因質(zhì)粒載體轉(zhuǎn)染CHO細(xì)胞，然后利用選擇標(biāo)記進(jìn)行篩選，只要成功轉(zhuǎn)染并表達(dá)相應(yīng)抗性蛋白的細(xì)胞都可以被加壓篩選出來(lái)，但卻很難篩選出目的蛋白高產(chǎn)的細(xì)胞系。一項(xiàng)研究對(duì)CHO-K1細(xì)胞中的5種抗生素抗性基因以及CHO-DG44細(xì)胞中的二氫葉酸還原酶 (Dihydrofolate reductase，DHFR) 基因進(jìn)行優(yōu)化，提出可以減弱選擇標(biāo)記蛋白的表達(dá)水平，以篩選出質(zhì)粒整合到基因活性位點(diǎn)或者是具有高拷貝數(shù)的細(xì)胞系，從而篩選出高產(chǎn)細(xì)胞系[42]。雖然存在選擇標(biāo)記過(guò)度弱化將導(dǎo)致細(xì)胞存活率下降的問(wèn)題，但這給篩選高產(chǎn)細(xì)胞株提供了新思路。

1.2 細(xì)胞生長(zhǎng)和生產(chǎn)過(guò)程的優(yōu)化

哺乳動(dòng)物細(xì)胞對(duì)抗體的表達(dá)是一個(gè)整體的過(guò)程，在整個(gè)細(xì)胞培養(yǎng)和生產(chǎn)過(guò)程中，細(xì)胞生長(zhǎng)代謝直接決定產(chǎn)品產(chǎn)量和質(zhì)量，過(guò)程控制也影響到細(xì)胞的生理活動(dòng)，從而間接影響抗體工業(yè)生產(chǎn)。培養(yǎng)工藝的開(kāi)發(fā)通常涉及到培養(yǎng)的溫度[43]、pH[44]、培養(yǎng)介質(zhì)、培養(yǎng)基配方[45]以及氧的攝取與氨基酸的消耗[46]、滲透壓、乳酸生成等代謝產(chǎn)物的變化[47]并以此為基礎(chǔ)進(jìn)行各類優(yōu)化，最終實(shí)現(xiàn)抗體產(chǎn)量和質(zhì)量的提高。

1.2.1 細(xì)胞代謝優(yōu)化

對(duì)于細(xì)胞而言攝食不足會(huì)導(dǎo)致胞內(nèi)營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)消耗和生產(chǎn)力下降，而過(guò)度攝食就會(huì)導(dǎo)致代謝副產(chǎn)物的不良積累和高滲透壓。為了在哺乳動(dòng)物細(xì)胞系統(tǒng)中實(shí)現(xiàn)有效的合成代謝，Gupta等發(fā)現(xiàn)工程細(xì)胞中的丙酮酸鹽通量改變可減少細(xì)胞培養(yǎng)物中的乳酸積累。其在CHO細(xì)胞中過(guò)度表達(dá)酵母細(xì)胞質(zhì)丙酮酸羧化酶2 (Pyruvate carboxylase 2，PYC2) 以增加丙酮酸流向三羧酸循環(huán) (Tricarboxylic acid cycle，TCA) 的通量，發(fā)現(xiàn)隨著酵母細(xì)胞質(zhì)PYC2表達(dá)量的增加，丙酮酸通量增加，乳酸積累可減少達(dá)4倍，細(xì)胞密度和壽命都有顯著增加。與親本相比，該工程細(xì)胞將抗體產(chǎn)量提高了70%[36]。此外，細(xì)胞內(nèi)外的氧化環(huán)境對(duì)于細(xì)胞的氧化應(yīng)激[48]、未折疊蛋白反應(yīng)途徑 (Unfolded protein response，UPR) 的活化[49]、蛋白質(zhì)二硫鍵異構(gòu)酶 (Protein disulfide isomerase，PDI) 表達(dá)[50]以及mRNA的水平[51]都是至關(guān)重要的。研究人員通過(guò)在細(xì)胞中引入氧化還原修飾劑，使得哺乳動(dòng)物細(xì)胞增加了對(duì)培養(yǎng)基中胱氨酸的攝取，從而合成更多的谷胱甘肽，細(xì)胞在第14天培養(yǎng)結(jié)束時(shí)仍然保持氧化狀態(tài)，并且在表達(dá)抗體方面減少了20%的聚體生成[52]。

為了改善細(xì)胞生長(zhǎng)狀況，可在培養(yǎng)過(guò)程中采用瞬時(shí)表達(dá)導(dǎo)入需要表達(dá)的基因，或者是導(dǎo)入改善細(xì)胞生長(zhǎng)的基因?qū)?xì)胞生長(zhǎng)狀況進(jìn)行調(diào)控。其中，抑制細(xì)胞凋亡是延長(zhǎng)細(xì)胞壽命、增加產(chǎn)量的最顯著的策略。有研究報(bào)道在生產(chǎn)人源化抗TNF-αmAb的CHO穩(wěn)定細(xì)胞中瞬時(shí)表達(dá)抗凋亡蛋白Bcl-XL，顯著提高了TNF-αmAb的產(chǎn)量[53]。有望用于大規(guī)模抗體生產(chǎn)，節(jié)約成本、提高生產(chǎn)效率。

1.2.2 生產(chǎn)過(guò)程的優(yōu)化

除了對(duì)細(xì)胞的代謝調(diào)控，對(duì)溫度、氧含量、滲透壓等過(guò)程參數(shù)的控制是大規(guī)模生產(chǎn)中重要的優(yōu)化策略。Lee等在生產(chǎn)過(guò)程中探究不同培養(yǎng)溫度對(duì)細(xì)胞生存狀況和產(chǎn)物的影響。該研究利用CHO細(xì)胞在轉(zhuǎn)染后比較了在生理溫度下 (36.5 ℃) 和轉(zhuǎn)染24 h中溫度由36.5 ℃變?yōu)?2 ℃的特異性單克隆抗體生產(chǎn)力和糖基化程度，結(jié)果表明在32 ℃培養(yǎng)過(guò)程中，糖基化產(chǎn)物通過(guò)N-乙酰葡萄糖氨基轉(zhuǎn)移酶Ⅱ表達(dá)增加從而促進(jìn)聚糖結(jié)構(gòu)的產(chǎn)生。在比較每種條件下半乳糖基化單克隆抗體的特定生產(chǎn)速率時(shí)，32 ℃下的半乳糖基化程度更高，但其對(duì)培養(yǎng)基中葡萄糖的消耗率比在36.5 ℃下培養(yǎng)高出60%[54]。相關(guān)研究人員通過(guò)監(jiān)測(cè)在線培養(yǎng)物的氧吸收并將該生理參數(shù)與產(chǎn)物形成速率聯(lián)系起來(lái)獲得關(guān)于細(xì)胞生理學(xué)的實(shí)時(shí)信息，并定量測(cè)定每個(gè)細(xì)胞和時(shí)間單位的蛋白表達(dá)速率。在該項(xiàng)研究中，開(kāi)發(fā)出一種控制策略，其中包括特定的生產(chǎn)力作為參數(shù)，并研究特定生產(chǎn)力與重組產(chǎn)物的糖基化模式之間的相互作用。研究表明酪氨酸消耗可導(dǎo)致細(xì)胞代謝活性和生產(chǎn)力下降，且觀察到當(dāng)pH從7.2變?yōu)?.9時(shí)，高甘露糖化糖型增加[55]。該項(xiàng)研究為開(kāi)發(fā)新的控制策略，以及控制產(chǎn)品質(zhì)量屬性方面提供了新方法。此外，重組蛋白的最終濃度受細(xì)胞密度、存活細(xì)胞培養(yǎng)壽命和重組蛋白的特定生產(chǎn)速率的影響。滲透壓對(duì)這3個(gè)重要參數(shù)有強(qiáng)烈作用。超滲透壓抑制細(xì)胞生長(zhǎng)。為了減少高滲透壓對(duì)于細(xì)胞生產(chǎn)的負(fù)面影響，研究人員在超滲透壓下傳代培養(yǎng)CHO細(xì)胞，開(kāi)發(fā)了高滲透抗性的CHO細(xì)胞系，其最大存活細(xì)胞濃度是野生型細(xì)胞的132%[56]。

1.3 瞬時(shí)表達(dá)系統(tǒng)的應(yīng)用

瞬時(shí)轉(zhuǎn)染 (Transient transfection) 通常利用質(zhì)粒載體將GOI轉(zhuǎn)染入宿主細(xì)胞，而基因不整合入宿主細(xì)胞染色體，在短時(shí)間內(nèi)就能使宿主細(xì)胞產(chǎn)生所需的性狀表達(dá)。該表達(dá)系統(tǒng)從操作到收獲時(shí)間周期短，不用對(duì)細(xì)胞進(jìn)行長(zhǎng)期的篩選和克隆[57]。雖然在臨床上還未有利用瞬時(shí)轉(zhuǎn)染技術(shù)在HEK293細(xì)胞表達(dá)重組抗體藥物的先例，但其在未來(lái)的工業(yè)生產(chǎn)中具有很大的發(fā)展空間。本實(shí)驗(yàn)室利用瞬時(shí)轉(zhuǎn)染技術(shù)在HEK293細(xì)胞表達(dá)9批重組lgG抗體，證明利用該方法生產(chǎn)的抗體在活細(xì)胞密度、存活力、凋亡狀態(tài)、抗體產(chǎn)量的可再現(xiàn)性以及物理性質(zhì)和不同批次的糖基化程度上都具有高度一致性[28]，證實(shí)瞬時(shí)轉(zhuǎn)染系統(tǒng)可為抗體生產(chǎn)提供快速可靠的策略，節(jié)約穩(wěn)轉(zhuǎn)細(xì)胞株構(gòu)建的成本，對(duì)需要進(jìn)行多個(gè)產(chǎn)品驗(yàn)證和篩選的情況尤為合適。

在瞬時(shí)轉(zhuǎn)染系統(tǒng)中，為獲得蛋白的高效表達(dá)可對(duì)轉(zhuǎn)入的質(zhì)粒載體進(jìn)行修飾。表達(dá)載體多采用單順?lè)醋?、多順?lè)醋踊蛘呤欠词交パa(bǔ)策略來(lái)對(duì)GOI進(jìn)行優(yōu)化，同時(shí)也對(duì)啟動(dòng)子、終止子、增強(qiáng)子等調(diào)控表達(dá)的載體功能元件的功能進(jìn)行提高[58]。在哺乳動(dòng)物表達(dá)系統(tǒng)中使用的質(zhì)粒載體通常由兩部分組成，即細(xì)菌骨架和真核表達(dá)盒。研究表明細(xì)菌骨架可能由于炎性非甲基化CpG基序與多種細(xì)胞因子相互作用，從而導(dǎo)致相關(guān)基因沉默。針對(duì)該現(xiàn)象，研究人員利用噬菌體ΦC31整合酶介導(dǎo)的重組效應(yīng)在大腸桿菌中構(gòu)建了攜帶增強(qiáng)型綠色熒光蛋白 (Enhanced green fluorescent protein，EGFP) 報(bào)告基因的新型微環(huán)DNA載體，不但可以避免基因沉默，且其在CHO-K1細(xì)胞與HEK細(xì)胞中瞬轉(zhuǎn)可表達(dá)至14代[59]。另一項(xiàng)研究開(kāi)發(fā)了一種含有惡臭假單胞菌的基因誘導(dǎo)的CHO BRI/rcTA細(xì)胞系，該細(xì)胞系攜帶反式激活子誘導(dǎo)系統(tǒng)的組分，當(dāng)利用瞬轉(zhuǎn)系統(tǒng)轉(zhuǎn)染基因開(kāi)關(guān)啟動(dòng)子的質(zhì)粒載體，就可驅(qū)動(dòng)該質(zhì)粒載體DNA的表達(dá)[60]。

2 原核大腸桿菌表達(dá)系統(tǒng)

從1973年左右質(zhì)粒DNA技術(shù)開(kāi)始得到發(fā)展[61]。這使得人們能夠?qū)⒛康幕虿迦胭|(zhì)粒轉(zhuǎn)入大腸桿菌中使其進(jìn)行擴(kuò)增，并利用熱誘導(dǎo)或化學(xué)誘導(dǎo)控制基因表達(dá)啟動(dòng)子使其進(jìn)行表達(dá)[62]。20世紀(jì)80年代，F(xiàn)DA批準(zhǔn)了由大腸桿菌生產(chǎn)的胰島素用于治療糖尿病。目前，F(xiàn)DA批準(zhǔn)的包括抗體片段、細(xì)胞因子等近30%的治療性蛋白是在大腸桿菌中生產(chǎn)的，例如利尿素鈉、白介素-2、白介素-11、白介素-ⅠRα、甲狀腺激素 (1–34) 以及干擾素α、β和γ等[63]。

大腸桿菌原核表達(dá)系統(tǒng)缺乏翻譯后修飾所需的酶，因此較適合無(wú)需糖基化的抗體片段類藥物的生產(chǎn)，例如scFv、Fab等。此外，大多數(shù)抗體產(chǎn)品含有二硫鍵，對(duì)維持其空間結(jié)構(gòu)和生物學(xué)活性非常重要，而大腸桿菌胞內(nèi)的氧化還原環(huán)境難以滿足二硫鍵折疊的需要，因此大多數(shù)情況下以包涵體形式進(jìn)行產(chǎn)品的表達(dá)，并需要對(duì)包涵體進(jìn)行變復(fù)性處理，或者采用分泌型信號(hào)肽，將其運(yùn)輸?shù)街苜|(zhì)進(jìn)行折疊，實(shí)現(xiàn)可溶性的表達(dá)，并形成正確的二硫鍵結(jié)構(gòu)[64]。研究人員將靶向卵巢上皮癌CA125位點(diǎn)的scFv基因亞克隆至pET-22b (+) 載體中，利用Pel B前導(dǎo)肽進(jìn)行周質(zhì)定位，通過(guò)優(yōu)化密碼子使scFv抗體可溶表達(dá)增加了14倍[65]。大腸桿菌表達(dá)系統(tǒng)具有低成本、易放大以及生產(chǎn)周期短等優(yōu)點(diǎn)，在不需復(fù)雜修飾的抗體片段類產(chǎn)品的生產(chǎn)中具有很大潛力。

3 轉(zhuǎn)基因動(dòng)物反應(yīng)器

轉(zhuǎn)基因動(dòng)物反應(yīng)器是利用轉(zhuǎn)基因技術(shù)改造動(dòng)物基因，使其在特定器官產(chǎn)生所需生物藥物的動(dòng)物。目前可在轉(zhuǎn)基因動(dòng)物的血液、尿液、精液、乳汁或者是蛋清甚至是蠶繭中得到所需的生物藥物[66]。

早在20世紀(jì)90年代初，研究人員就研制成功利用轉(zhuǎn)基因動(dòng)物的乳腺大規(guī)模生產(chǎn)供人類疾病治療的生物活性物質(zhì)和藥用蛋白[67]。其生產(chǎn)的外源蛋白種類廣泛，從小分子肽到大分子復(fù)雜蛋白質(zhì)，從生物活性酶到抗體、病毒抗原蛋白均可有效生產(chǎn)，通常用于生產(chǎn)重組人蛋白和單克隆抗體[68]。該技術(shù)通常使用顯微注射技術(shù)直接注射線性化的DNA到成熟的卵細(xì)胞中[69]，而在反芻動(dòng)物中，使體外培養(yǎng)的受精卵發(fā)育到囊泡期再進(jìn)行顯微注射[70]。2006年由EMA批準(zhǔn)的第一個(gè)轉(zhuǎn)基因動(dòng)物生物制藥產(chǎn)品重組抗凝血酶Atryn?被批準(zhǔn)用于人類醫(yī)療用途，并于2009年被FDA批準(zhǔn)。在2014年，一種重組人C1酯酶抑制劑蛋白藥物Ruconest?得到FDA的批準(zhǔn)[71]。這驗(yàn)證了轉(zhuǎn)基因動(dòng)物反應(yīng)器的動(dòng)物平臺(tái)，增加了重組蛋白生產(chǎn)系統(tǒng)的可靠性。

該技術(shù)生產(chǎn)的藥物產(chǎn)量和活性一般都較高。有報(bào)道稱在其構(gòu)建的轉(zhuǎn)基因奶牛中生產(chǎn)人重組白蛋白產(chǎn)量可達(dá)到1?5 mg/mL[72]，產(chǎn)物無(wú)污染、成本低廉。但也存在一些問(wèn)題，如顯微注射難度大，不便于普及，且需要通過(guò)進(jìn)一步完善表達(dá)載體來(lái)提高表達(dá)量。除轉(zhuǎn)基因動(dòng)物反應(yīng)器適宜于單克隆抗體的生產(chǎn)，也出現(xiàn)了乳腺瞬時(shí)表達(dá)系統(tǒng)，但下游純化等開(kāi)發(fā)過(guò)程十分昂貴[71]，且不同個(gè)體的動(dòng)物所產(chǎn)生的藥物在質(zhì)量均一性上可能存在差異，不便于對(duì)藥物質(zhì)量進(jìn)行控制。此外，對(duì)于大動(dòng)物來(lái)說(shuō)，待其能夠生產(chǎn)藥物需要幾年時(shí)間，且存在動(dòng)物倫理方面和基因污染的問(wèn)題，因此該系統(tǒng)仍需進(jìn)一步研究和完善。

4 無(wú)細(xì)胞蛋白質(zhì)合成系統(tǒng)

近年來(lái)，無(wú)細(xì)胞蛋白質(zhì)合成系統(tǒng) (The cell-free protein synthesis system，CFPS) 已經(jīng)成為一個(gè)強(qiáng)大的技術(shù)平臺(tái)，以滿足日益增長(zhǎng)的簡(jiǎn)單和高效制備蛋白質(zhì)生產(chǎn)的需求。CFPS技術(shù)是指在進(jìn)行蛋白表達(dá)時(shí)將DNA或所需要的基因作為模板加入由RNA聚合酶、核糖體等其他細(xì)胞提取物組成的反應(yīng)混合物中，添加能量源與需要的氨基酸、一些輔助因子和提高原核無(wú)細(xì)胞體系的生產(chǎn)力的翻譯延伸因子和轉(zhuǎn)錄因子[73]。該系統(tǒng)表達(dá)迅速，表達(dá)時(shí)間通常為數(shù)小時(shí)到數(shù)天。有研究利用Hela細(xì)胞與CHO細(xì)胞提取物進(jìn)行反應(yīng)，以利用CFPS系統(tǒng)進(jìn)行綠色熒光蛋白 (Green fluorescent protein，GFP) 與鏈激酶 (Streptokinase，SK) 的表達(dá)，并使用自切割內(nèi)含子技術(shù)對(duì)鏈激酶產(chǎn)物進(jìn)行純化[74]。該系統(tǒng)在生產(chǎn)結(jié)構(gòu)簡(jiǎn)單的蛋白產(chǎn)物方面的確具有十分迅速、高產(chǎn)以及產(chǎn)品無(wú)差異的優(yōu)點(diǎn)，但是其在具有二硫鍵和高級(jí)結(jié)構(gòu)的復(fù)雜蛋白生產(chǎn)方面還具有較大缺陷，目前主要應(yīng)用于科學(xué)研究。近年來(lái)，它的應(yīng)用擴(kuò)大到了IgGs和抗體衍生物的生產(chǎn)，以及抗體-藥物共軛物、疫苗、膜蛋白、金屬蛋白和病毒蛋白的研究型制備[75]，雖然生產(chǎn)類型廣泛，但其試劑昂貴，難以規(guī)模放大。

5 其他表達(dá)系統(tǒng)

除了傳統(tǒng)的表達(dá)系統(tǒng)，在抗體生產(chǎn)方面還有一些比較有特色的表達(dá)系統(tǒng)，例如枯草芽孢桿菌系統(tǒng)，由于其生產(chǎn)蛋白不形成包涵體、分泌能力強(qiáng)、產(chǎn)物易純化，被認(rèn)為是大腸桿菌表達(dá)系統(tǒng)的理想替代品[76]。在真核表達(dá)系統(tǒng)中植物表達(dá)系統(tǒng)由于其不會(huì)感染人源病毒，在抗體制備中具有很高的安全性，具有十分廣闊的發(fā)展空間[77]。但植物和哺乳動(dòng)物在O型糖基化水平及多糖結(jié)構(gòu)上有所不同[78]，有研究報(bào)道其產(chǎn)生的抗體可產(chǎn)生致敏作用[79]。另一個(gè)常用的系統(tǒng)是酵母表達(dá)系統(tǒng)，其表達(dá)水平一般經(jīng)過(guò)5 d發(fā)酵可以達(dá)到2?5 g/L，且表達(dá)產(chǎn)物不含內(nèi)毒素。雖然酵母具有一定的糖基化能力，但糖基化模式與人類細(xì)胞不同，阻礙了其在抗體生產(chǎn)領(lǐng)域的應(yīng)用[80]。而在昆蟲表達(dá)系統(tǒng)中，應(yīng)用最廣泛的是昆蟲細(xì)胞-桿狀病毒表達(dá)載體系統(tǒng)。該表達(dá)系統(tǒng)表達(dá)蛋白可以從細(xì)菌到人體組織等任何有機(jī)體表達(dá)任何細(xì)胞位置的基因產(chǎn)品，且桿狀病毒對(duì)脊椎動(dòng)物的非傳染性保證了該表達(dá)系統(tǒng)的安全性。該系統(tǒng)的特點(diǎn)是依賴于工程載體的優(yōu)化，而不是宿主細(xì)胞系的建立，且其工程載體可以容納長(zhǎng)達(dá)20 kb的外源DNA片段[81]。

6 總結(jié)與展望

抗體藥物特異性強(qiáng)，快速準(zhǔn)確，具有良好的治療效果?？贵w生產(chǎn)技術(shù)發(fā)展了幾十年，根據(jù)不同的需求，開(kāi)發(fā)了不同的生產(chǎn)模式，包括文中所總結(jié)的各類表達(dá)系統(tǒng)的使用。臨床上主要采用哺乳動(dòng)物細(xì)胞和原核細(xì)胞發(fā)酵技術(shù)來(lái)獲得抗體藥物。由于哺乳動(dòng)物細(xì)胞表達(dá)系統(tǒng)的復(fù)雜性，工業(yè)上針對(duì)該系統(tǒng)開(kāi)展的工作較多，主要通過(guò)改變細(xì)胞代謝和采用生產(chǎn)過(guò)程控制以延長(zhǎng)細(xì)胞生長(zhǎng)和生產(chǎn)的有效時(shí)間，從而提高抗體產(chǎn)量。近年來(lái)，以CRISPR/Cas9為代表的新興技術(shù)正廣泛用于工程細(xì)胞株的開(kāi)發(fā)，且該技術(shù)本身正經(jīng)歷不斷更新和優(yōu)化。有研究人員開(kāi)發(fā)出新的Cas蛋白表達(dá)系統(tǒng)xCas9，不但能夠識(shí)別更為廣泛地候選識(shí)別位點(diǎn)的毗鄰基序 (Protospacer adjacent motif, PAM) 序列[82]，擴(kuò)大CRISPR/Cas9適用范圍，同時(shí)極大減少脫靶效應(yīng)。各類新技術(shù)的發(fā)展將大大推動(dòng)抗體藥物生產(chǎn)水平及產(chǎn)品質(zhì)量的提高。

抗體工業(yè)蓬勃發(fā)展的同時(shí)仍存在一些尚未解決的問(wèn)題，例如抗體分子結(jié)構(gòu)上存在多種翻譯后修飾形式、具有顯著的“非均一性”、高產(chǎn)細(xì)胞株的篩選困難等問(wèn)題，產(chǎn)生了各種針對(duì)高產(chǎn)穩(wěn)定細(xì)胞株篩選的組學(xué)研究，并帶動(dòng)了相關(guān)基礎(chǔ)研究的發(fā)展[83]。隨著抗體藥物相關(guān)種類被納入中國(guó)醫(yī)保目錄，在將來(lái)的一段時(shí)間內(nèi)，抗體藥物在國(guó)內(nèi)將會(huì)有更好的市場(chǎng)和發(fā)展前景。同時(shí)這也對(duì)抗體藥物生產(chǎn)發(fā)展、工藝優(yōu)化、質(zhì)量檢測(cè)等提出了更高的要求。

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Advances in antibody drug expression techniques

Mengxiao Zhang, Jianwei Zhu, and Huili Lu

Engineering Research Center of Cell & Therapeutic Antibody, Ministry of Education, School of Pharmacy, Shanghai Jiao Tong University, Shanghai 200240, China

The 21st century is regarded as the century of biotechnological drugs, among which monoclonal antibodies and their derived targeting drugs have established themselves as the leading modality of biopharmaceutical pharmaceutics for a wide range of indications covering malignant tumors and autoimmune disorders. Since the manufacturing of the first antibody drug from hybridoma cells, the technologies have been intensely studied and there emerged numerous breakthroughs in recombinant cell line establishment, antibody expression and purification, quality control and other related areas. This article summarizes the critical progresses of antibody drugs expression technologies, especially of mammalian cell expression system,expression system, the transgenic animal reactor and the cell free protein synthesis system, to give a detailed illustration of the recent advances in antibody drugs development.

antibody drugs, expression system, mammalian cells, manufacturing, CRISPR

May 11, 2018;

July 2, 2018

National Natural Science Foundation of China (No. 81773621), Shanghai Scientific and Technological Innovation Project (No. 17431904500).

HuiliLu. Tel: +86-21-34204631; E-mail: roadeer@sjtu.edu.cn

國(guó)家自然科學(xué)基金 (No. 81773621)，上海市科委科技創(chuàng)新行動(dòng)計(jì)劃項(xiàng)目 (No. 17431904500) 資助。

2018-07-20

10.13345/j.cjb.180201

http://kns.cnki.net/kcms/detail/11.1998.Q.20180720.1006.003.html

(本文責(zé)編 陳宏宇)