蔣增海，王揚(yáng)偉，張桂榮，鄧同煒，盧建洲

（河南牧業(yè)經(jīng)濟(jì)學(xué)院動(dòng)物醫(yī)學(xué)院，河南 鄭州 450046；河南省豬病防控工程技術(shù)研究中心，河南 鄭州 450046）

豬鏈球菌病是鏈球菌屬中馬鏈球菌獸疫亞種、馬鏈球菌類馬亞種、Lancefied分群中D、E、L群鏈球菌以及豬鏈球菌引起豬的疫病的總稱，臨床上主要表現(xiàn)為淋巴結(jié)膿腫、腦膜炎、關(guān)節(jié)炎以及敗血癥等癥狀，其中，豬鏈球菌是世界范圍內(nèi)引致豬鏈球菌病最主要的病原[1]。

根據(jù)豬鏈球菌病莢膜多糖抗原的不同，可以將其分為35種血清型(血清型1～34和血清型1/2)，其中致病力最強(qiáng)的豬鏈球菌病2型是一種重要的人畜共患病病原，可通過呼吸道、消化道或皮膚傷口等途徑感染人，從而對人類健康和生命安全構(gòu)成潛在的危害[2]。在荷蘭，豬鏈球菌2型引起各類臨床癥狀中，42%為肺炎，18%為腦膜炎和心內(nèi)膜炎，10%多發(fā)性漿膜炎[1]。豬鏈球菌病常常與其他豬病如巴氏桿菌病、副豬嗜血桿菌病、豬瘟、豬偽狂犬病等混合感染[3-7]，增加診斷難度，造成更為嚴(yán)重的危害。近年來，全國各地時(shí)常有豬鏈球菌病的報(bào)道[3-8]，但是未見腹腔漿膜炎型豬鏈球菌病的報(bào)道。

2018年5 月，河南新密某養(yǎng)豬場，飼養(yǎng)黑豬19頭，體重40?kg左右，1周之內(nèi)，連續(xù)5頭仔豬發(fā)病，使用頭孢噻呋鈉，治愈3頭，死亡2頭。臨床癥狀表現(xiàn)為精神不振，體溫升高，呼吸急促，食欲下降，甚至不食，病初糞便干結(jié)，后期腹瀉。病死豬剖解，可見頜下淋巴結(jié)、腹股溝淋巴結(jié)、腸系膜淋巴結(jié)腫大、出血（圖1、圖2），肺臟出血（圖3），肝臟、脾臟、腸道表面大量蜘蛛網(wǎng)狀的纖維素性物質(zhì)覆蓋（圖4、圖5）。為了診斷與控制該病，課題組采集病料，進(jìn)行了細(xì)菌分離、鑒定及藥敏試驗(yàn)，現(xiàn)報(bào)告如下。

1 材料與方法

1.1 主要試劑

胰蛋白大豆瓊脂（TSA）、胰蛋白大豆肉湯（TSB）、煙酰胺腺 嘌 呤 二 核 苷 酸（NAD）、5%鮮血瓊脂平板、腦心浸液肉湯、2x?PCR?Taq?Master?Mix?with?dye、DNA?Marker?DL2?000、核酸染料、各種藥敏片、快速革蘭氏染色液。

1.2 細(xì)菌分離培養(yǎng)

無菌采集肺臟、心血，或者棉簽直接涂抹肝臟或者脾臟漿膜面，接種于TSA瓊脂平板（含終濃度為5%的新生牛血清、10μg/mL?NAD），37℃培養(yǎng)24～48?h，進(jìn)一步純化傳2～3代。將分離菌株，接種于血瓊脂平板，37?℃培養(yǎng)24～48?h，觀察生長情況。

1.3 染色、鏡檢

取潔凈玻片，滴一滴無菌蒸餾水于玻片中央，挑取純化后的分離菌株單菌落，涂抹于蒸餾水中，混合，自然干燥后，火焰上固定，按照快速革蘭氏染色說明書要求，進(jìn)行染色。油鏡下，觀察分離菌株的形態(tài)特征。

1.4 PCR 檢測

將分離菌株接種于TSB（含終濃度為5%的新生牛血清），過夜培養(yǎng)，水煮沸法提取分離菌株DNA模板。參考文獻(xiàn)[9]合成一對鏈球菌擴(kuò)增特異性引物（P1：GCAGCGTATTCTGTCAAACG，P2：CCATGGACAGATAAAGATGG，預(yù)期擴(kuò)增片段大小為689?bp），采用PCR法對分離菌株進(jìn)行特異性擴(kuò)增，擴(kuò)增產(chǎn)物在1%瓊脂糖凝膠中電泳后，凝膠成像系統(tǒng)檢測擴(kuò)增條帶與預(yù)期大小是否一致。

1.5 藥敏試驗(yàn)

采用K-B紙片瓊脂擴(kuò)散法，對分離菌株進(jìn)行藥敏試驗(yàn)。將分離菌株接種于腦心浸液肉湯培養(yǎng)基中，37℃過夜培養(yǎng)。比濁法將菌液濃度，先調(diào)整為0.5麥?zhǔn)蠁挝唬?.5×108CFU/mL）。用滅菌棉簽，蘸取稀釋好分離菌液，緊貼試管內(nèi)壁在液體上方旋轉(zhuǎn)拭子數(shù)次，這樣能除去棉簽上多余的液體，然后均勻涂抹于血瓊脂平板，蓋子可半開3～5?min，使得瓊脂吸取多余水分。將藥敏紙片貼于平板上，藥敏片之間的距離以1～2?cm為宜，藥敏紙片距平皿邊緣約1.5?cm，置于37℃培養(yǎng)箱培養(yǎng)18～24?h后，測定抑菌圈的直徑。參照2013版美國臨床實(shí)驗(yàn)室標(biāo)準(zhǔn)化協(xié)會(huì)(Clinical?and?Laboratory?Standards?Institute，CLSI)手冊解釋標(biāo)準(zhǔn)[10]對藥敏試驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行判定。

圖1 頜下淋巴結(jié)腫大出血

圖2 腹股溝淋巴結(jié)腫大出血

圖3 肺臟出血

圖4 肝臟、腸管覆蓋纖維素性物質(zhì)

圖5 脾臟、腸管覆蓋纖維素性物質(zhì)

2 結(jié)果

2.1 細(xì)菌分離培養(yǎng)結(jié)果

無菌采集肺臟、心血，或者棉簽直接涂抹肝臟或者脾臟漿膜面，接種于TSA瓊脂平板，37℃培養(yǎng)24～48?h，生長為圓形、白色、針尖大小菌落，菌落很純，無雜菌（圖6）。將分離菌株，接種于血瓊脂平板后，同樣生長為圓形、針尖大小菌落，呈α溶血（草綠色溶血）（圖 7）。

2.2 染色、鏡檢

將分離菌株革蘭氏染色后，油鏡下放大1?000倍觀察，菌體呈革蘭氏陽性，球形，鏈狀排列(圖8)。

2.3 PCR 檢測結(jié)果

水煮法提取DNA模板，采用PCR法擴(kuò)增豬鏈球菌特異性片段，擴(kuò)增結(jié)果顯示，擴(kuò)增片段大?。▓D9）與預(yù)期大小689?bp一致，表明分離菌株為豬鏈球菌。

2.4 藥敏試驗(yàn)結(jié)果

選取10種抗菌藥物，采取K-B紙片瓊脂擴(kuò)散法，對分離菌株進(jìn)行藥敏試驗(yàn)。藥敏試驗(yàn)結(jié)果表明分離菌株對青霉素類、四環(huán)素類藥物、喹諾酮可藥物、大環(huán)內(nèi)脂內(nèi)藥物均敏感，對林可胺、氯霉素類藥物耐藥（表1）。通過藥敏試驗(yàn)結(jié)果，我們可以看出，養(yǎng)殖戶選擇頭孢噻呋鈉治療，應(yīng)該是可行的，因?yàn)轭^孢噻呋鈉一般比青霉素類藥物更有效。

圖6 TSA平板白色、圓形菌落

圖7 血瓊脂平板生長的圓形、白色、α溶血菌落

圖8 分離菌株革蘭氏陽性，球形，鏈狀排列

圖9 分離菌株P(guān)CR鑒定結(jié)果

表?1?分離菌株藥敏試驗(yàn)結(jié)果

3 討論與分析

豬鏈球菌病是一種人畜共患傳染病，世界上廣泛分布，在臨床上主要引起敗血型、腦膜炎型、關(guān)節(jié)炎型和淋巴結(jié)化膿型。本次病例，通過細(xì)菌分離、染色鏡檢形態(tài)觀察和PCR檢測，確診為豬鏈球菌??；根據(jù)腹腔肝臟、脾臟和腸管覆蓋大量纖維素性物質(zhì)，判定為漿膜炎型豬鏈球菌病。該類型豬鏈球菌病，在臨床上容易被誤診為副豬嗜血桿菌病，應(yīng)引起廣大獸醫(yī)工作者和養(yǎng)殖戶重視，注意鑒別診斷。

通過藥敏試驗(yàn)，分離菌株對林可霉素和氯霉素耐藥，由于氯霉素在我國禁止使用，推測與氯霉素同類的藥物氟苯尼考對分離菌株具有耐藥性，如果使用這些藥物治療，會(huì)導(dǎo)致治療失??；分離菌株對青霉素、阿莫西林、氨芐西林、強(qiáng)力霉素、恩諾沙星、環(huán)丙沙星均敏感。根據(jù)藥敏試驗(yàn)結(jié)果，我們指導(dǎo)養(yǎng)殖戶，強(qiáng)力霉素拌料飼喂5～7?d，發(fā)病豬只使用大劑量青霉素肌肉注射，很快控制病情。

本次試驗(yàn)中，選擇TSA瓊脂平板（含終濃度為5%的新生牛血清、10μg/mL?NAD）作為分離病原菌的培養(yǎng)基，是因?yàn)樵撆囵B(yǎng)基適合多種豬病原細(xì)菌的生長，例如副豬嗜血桿菌、胸膜肺炎放線桿菌、豬丹毒桿菌、巴氏桿菌、大腸桿菌、沙門氏菌等。試驗(yàn)中均未分離到上述病原菌，進(jìn)一步確診本次發(fā)病是由豬鏈球菌引起，無其他病原菌混合感染。