張民秀 謝芝勛 羅思思 謝麗基 謝志勤 劉加波 鄧顯文 曾婷婷

廣西壯族自治區(qū)獸醫(yī)研究所/廣西獸醫(yī)生物技術重點實驗室，南寧530001

H9-AIV的感染主要引起禽類發(fā)生呼吸系統(tǒng)疾病，H9-AIV 在家禽中廣泛流行并且難以控制，嚴重危害禽類的健康[1]。HA蛋白是AIV 表面的主要囊膜糖蛋白，是最重要的保護性抗原，該蛋白既能誘導宿主產生中和抗體，又能刺激宿主產生細胞毒性淋巴細胞反應[1]?？乖砦患纯乖瓫Q定簇，抗原決定簇能夠刺激機體引發(fā)體液或細胞免疫，篩選預測AIV HA蛋白抗原表位對AIV 表位疫苗的設計具有重要的意義。本研究以H9-AIV HA蛋白為基礎，采用生物信息學工具分析和預測HA蛋白的B細胞表位，為研究H9-AIV的表位疫苗提供參考。

1 材料與方法

從GenBank 上獲得1994-2016年公布的321條H9-AIV HA氨基酸序列（均為國內毒株），運用Clustalx 1.8 進行多序列比對，采用EMBOSS 中的plotcon 程序對比對結果計算序列間任一點的相似性分值；使用MEGA 4.1 構建系統(tǒng)發(fā)育樹；根據(jù)系統(tǒng)發(fā)育樹選定預測線性抗原表位的模板毒株，運用Kolaskar&Tongaonkar antigenicity （簡 稱KTA）和Bepipred linear Epitope Prediction（簡稱BLEP）算法對模板毒株HA蛋白的線性抗原表位進行預測。采用ExPASy 服務器中的ProtScale 工具預測HA蛋白的優(yōu)勢親水性、可及性、β-轉角區(qū)域，IEDB Analysis Resource 預測柔韌性。參考文獻[2]中線性抗原表位的篩選原則和評分標準篩選出較好的抗原表位。

2 結果與分析

2.1 HA蛋白多序列比對及系統(tǒng)發(fā)育樹的構建

將所得HA氨基酸序列進行比對，氨基酸位點的總突變率為38.92%。Plotcon 計算HA蛋白序列間的任一點相似性均值為1.663，大于該均值的保守性區(qū)域位置為：20-30、51-62、72-87、105-115、128-142、150-164、169-179、187-196、220-231、238-250、285-294、346-354、358-370、400-409、423-432、447-457、473-488、490-499和540-559。根據(jù)系統(tǒng)發(fā)育樹結果，A/chicken/Beijing/1/1994 起源較早為本研究的模板毒株，簡稱Beijing94。

2.2 HA蛋白線性表位的預測

1）HA蛋白抗原性區(qū)域的預測。運用1 中提到的2種算法預測出Beijing94 HA蛋白的抗原表位位 置， 如 KTA 法：4-15、19-25、40-53、66-73、80-90、95-101、119-136、148-154、168-174、222-228、241-248、261-267、284-291、303-309、311-332、434-441、475-485、523-540；BLEP 法：28-45、108-115、144-151、164-180、191-200、203-219、224-237、263-283、444-452、492-506。

2）HA蛋白線性抗原表位篩選參數(shù)的計算。運用ProtScale和IEDB Analysis Resource 網站預測得到Beijing94 HA蛋白的優(yōu)勢親水性區(qū)域為：18-39、149-154、176-182、248-256、271-282、331-339、371-389、443-452、480-521；優(yōu)勢可及性區(qū)域為：26-42、143-155、174-183、243-249、275-283、333-340、374-393、441-471、491-507、512-524；柔韌性區(qū)域為：26-41、144-150、176-183、246-251、277-285、333-339、375-391、441-448、489-522；具有β-轉角二級結構的區(qū)域：26-31、52-61、78-95、102-119、124-128、144-154、166-171、175-182、190-193、225-237、244-261、266-276、281-287、292-301、308-620、330-343、346-355、361-373、444-448、450-459、461-478、492-506、513-521、549-556。

3）優(yōu)勢線性抗原表位預測結果。綜合以上參數(shù)預測結果得到4個抗原表位，分別是第166-179aa：DN AYPVQDAQYTNN、第225-238aa：IGPRPPVNGQQGRI、第26-39aa：QSTNSTETVDTLTE、第490-499aa：IRNGTYNRRK。

3 討論

H9-AIV的感染對家禽的產蛋率、成活率和死亡率都具有重要的影響[1]。近年來在免疫壓力下，H9-AIV HA蛋白的抗原性發(fā)生改變，導致病毒可以躲避抗體的中和[3]，加快AIV 新疫苗的研發(fā)對AIV的防控具有重要作用。表位疫苗是人工合成或體外表達病原體抗原表位的一類疫苗，能夠刺激機體產生免疫反應，基于流感病毒抗原表位研制的多表位串聯(lián)疫苗在一定程度上能夠抵抗流感病毒的感染[4]。構建表位疫苗的前提是準確篩選出重要的特異性抗原表位[5]，目前預測和篩選抗原表位的常用方法是運用生物信息學手段分析重要氨基酸序后篩選出候選的抗原表位。KTA 法對B細胞抗原表位的預測準確率達75%，而BLEP 方法是結合多個表位數(shù)據(jù)庫并運用Markov 模型法預測B細胞抗原表位[5]，采用這2種算法提高了預測的準確性。β-轉角凸出于蛋白表面，有利于與抗體結合，易形成抗原表位，蛋白的親水性、可及性和柔韌性共同決定肽段的免疫原性。本研究綜合可及性方案、抗原性方案、親水性方案、可塑性方案和二級結構預測方案預測HA蛋白B細胞抗原表位，得到4個候選的抗原表位，但是否能誘導機體產生中和抗體，還需要進一步驗證。