林 志 高錫強(qiáng) 霍桂桃 張 頔 楊艷偉 呂建軍 李 波 屈 哲

淋巴細(xì)胞發(fā)育或成熟過程中的調(diào)節(jié)異常會導(dǎo)致自身免疫性疾病的發(fā)生。在中樞免疫耐受中，胸腺細(xì)胞發(fā)育成熟的重要調(diào)節(jié)點(diǎn)是依賴于T細(xì)胞受體和B細(xì)胞受體的信號通路。在周圍免疫耐受中，自身反應(yīng)性B細(xì)胞和T細(xì)胞的清除則依賴于恰當(dāng)?shù)男盘柾贰⒓?xì)胞凋亡和存活因子、轉(zhuǎn)錄因子以及效應(yīng)細(xì)胞分化的表觀調(diào)控等。此外，Treg細(xì)胞的穩(wěn)態(tài)平衡對于限制成熟B細(xì)胞以及效應(yīng)T細(xì)胞的激活至關(guān)重要[1，2]。所有這些耐受機(jī)制中最重要的是蛋白級聯(lián)表達(dá)中細(xì)微的擾動(dòng)，而多種表觀遺傳學(xué)機(jī)制參與了這種定量控制，包括微小RNA(miRNAs)的調(diào)控[3]。

miRNAs是一類內(nèi)源性的約21～23個(gè)核苷酸的非編碼小分子單鏈RNA分子，它們參與了轉(zhuǎn)錄后的基因調(diào)控。miRNAs通過與靶mRNA的3′端非翻譯區(qū)、編碼區(qū)或5′端非翻譯區(qū)結(jié)合，抑制mRNA的翻譯或引發(fā)其降解，從而阻遏基因轉(zhuǎn)錄后的翻譯過程。已證實(shí)miRNAs占人類整個(gè)基因組的3%，但是卻參與人類基因組中30%以上蛋白編碼基因的轉(zhuǎn)錄，因此被認(rèn)為是細(xì)胞生命活動(dòng)中重要的負(fù)性調(diào)控因子。

免疫系統(tǒng)中miRNAs的變化非常明顯，它們調(diào)控了淋巴細(xì)胞的發(fā)育和成熟。miRNAs的失調(diào)會導(dǎo)致多種自身免疫性疾病的發(fā)生和發(fā)展。研究證實(shí)，在人類眾多的自身免疫性疾病，包括紅斑狼瘡、類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎和多發(fā)性硬化癥中多種miRNAs出現(xiàn)明顯的改變。因此，本文主要探討了miRNAs調(diào)節(jié)淋巴細(xì)胞的發(fā)育、成熟，其異常導(dǎo)致的免疫耐受失衡，闡明在自身免疫性疾病中miRNAs的異常造成對淋巴細(xì)胞逃脫免疫耐受的分子機(jī)制，為自身免疫性疾病的診斷及治療提供潛在的分子標(biāo)志物以及新的治療靶點(diǎn)。

一、miRNAs對中樞免疫耐受的調(diào)控

miRNAs是淋巴細(xì)胞發(fā)育、成熟關(guān)鍵節(jié)點(diǎn)的重要調(diào)控因子，它們確保中樞免疫系統(tǒng)中淋巴細(xì)胞進(jìn)行正確地重組抗原受體基因，通過TCR或BCR信號通路選擇促使強(qiáng)自身反應(yīng)細(xì)胞發(fā)生凋亡。因此，miRNAs的異常會導(dǎo)致TCR或BCR信號通路的失調(diào)，從而增加自身反應(yīng)性淋巴細(xì)胞的產(chǎn)生，促使自身免疫性疾病的發(fā)生。

研究表明，miRNAs的生物合成途徑是早期B細(xì)胞發(fā)育的關(guān)鍵，Dicer的消失幾乎導(dǎo)致祖B細(xì)胞到前B細(xì)胞轉(zhuǎn)變的完全阻滯。祖B細(xì)胞重要功能就是BCR基因V(D)J重組，形成功能性的抗原受體。盡管Dicer不能改變V(D)J區(qū)重組的基本機(jī)制，但是它的確改變了所產(chǎn)生的BCR序列，這表明miRNAs在調(diào)節(jié)潛在自身反應(yīng)性B細(xì)胞的存活中起著重要的作用。此外，miRNAs17～92簇也證實(shí)在B細(xì)胞發(fā)育中也起著重要的作用。miRNAs17～92簇是由6個(gè)miRNAs組成，屬于4個(gè)miRNAs家族，即miR-17、miR-18、miR-19、miR-92。BIM是通過PI3K信號通路誘導(dǎo)，并且直接受miRNAs17～92簇靶向調(diào)控。一種潛在的PI3K通路的負(fù)性調(diào)節(jié)因子腫瘤抑制因子PTEN也是受miRNAs17～92簇靶向調(diào)控。當(dāng)miRNAs17～92簇從發(fā)育中B細(xì)胞內(nèi)敲除后，PTEN和BIM表達(dá)升高并出現(xiàn)細(xì)胞凋亡，導(dǎo)致B細(xì)胞缺乏。相反，miRNAs17～92簇過表達(dá)時(shí)，將誘導(dǎo)T細(xì)胞或B細(xì)胞存活率增高，從而促進(jìn)淋巴組織增生以及自身免疫性疾病的發(fā)生[4]。

在胸腺T細(xì)胞發(fā)育的早期階段，通過新形成的TCR信號為T細(xì)胞的發(fā)育、成熟提供重要的生存信號，而自身反應(yīng)性抗原顯示強(qiáng)TCR信號則會誘導(dǎo)凋亡。因此，miRNAs通過調(diào)節(jié)TCR信號的強(qiáng)弱，促使自身反應(yīng)性T細(xì)胞逃脫清除機(jī)制。其中，miRNAs181通過靶向作用于多個(gè)蛋白的磷酸化而改變TCR信號的強(qiáng)度，包括PTPN22、SHP-2、DUSP5、DUSP6和PTEN[5]。在胸腺T細(xì)胞發(fā)育的早期，雙陰性胸腺細(xì)胞高表達(dá)miRNAs181，促使其對前TCR和TCR信號具有高敏感性。當(dāng)胸腺細(xì)胞成熟進(jìn)入雙陽T細(xì)胞和單陽性T細(xì)胞后，miRNAs181的表達(dá)下降，在胸腺細(xì)胞的陰性和陽性選擇中降低其與TCR結(jié)合的敏感度[6]。miRNAs181的異常會導(dǎo)致正常的自身反應(yīng)性T細(xì)胞逃脫TCR信號介導(dǎo)的凋亡。研究證實(shí)，急性期和慢性期多發(fā)性硬化以及自身免疫性腦脊髓炎患者腦白質(zhì)中miRNA181a和miRNA181b表達(dá)水平顯著性降低[7]。因此，miRNAs181可能是調(diào)節(jié)T細(xì)胞介導(dǎo)的自身免疫性疾病的發(fā)生和發(fā)展的關(guān)鍵。

二、miRNAs對周圍免疫耐受的調(diào)控

外周免疫耐受機(jī)制可以嚴(yán)格限制B細(xì)胞產(chǎn)生自身抗體以及自身反應(yīng)性T細(xì)胞造成的組織炎癥和損傷，而這些機(jī)制是受到miRNAs的調(diào)控。異常的miRNAs可以導(dǎo)致外周淋巴細(xì)胞的激活、存活、增生、分化以及具有效應(yīng)功能，從而誘導(dǎo)自身免疫性疾病的發(fā)生。

未成熟B細(xì)胞離開骨髓進(jìn)入外周后完成自身的發(fā)育和選擇。耐受缺失以及受體編輯可以消除BCR與外周自身抗原的強(qiáng)烈反應(yīng)。中度的BCR信號促進(jìn)邊緣區(qū)或過渡性B細(xì)胞的產(chǎn)生，而弱BCR信號促進(jìn)濾泡B細(xì)胞的產(chǎn)生。相對于邊緣區(qū)和過渡性B細(xì)胞，濾泡B細(xì)胞中miRNA182和其他幾個(gè)miRNAs非常豐富。miRNA185的過度表達(dá)可以降低其靶點(diǎn)BCR下游轉(zhuǎn)導(dǎo)信號激酶BTK的表達(dá)[8]。此外，外周B細(xì)胞中Dicer的消融也會改變BCR的特征。雌性小鼠成熟B細(xì)胞中缺失Dicer會誘發(fā)自身抗體的產(chǎn)生以及腎臟免疫復(fù)合物的沉積[9]。

近年來的白血病研究表明與自身免疫性疾病相關(guān)的BCR下游PI3K信號受到miRNAs的調(diào)控[10]。miRNA150的表達(dá)與慢性淋巴細(xì)胞白血病(CLL)的嚴(yán)重程度呈負(fù)相關(guān)。miRNA150調(diào)控靶點(diǎn)是Gab1基因，該基因依賴于BCR刺激可以促使PI3K轉(zhuǎn)移至胞膜[11]。miRNA34a調(diào)控靶點(diǎn)是Foxp1基因，它是PI3K信號的負(fù)反饋調(diào)節(jié)子，抑制B細(xì)胞的發(fā)育。PTEN被證實(shí)是多種miRNAs作用的靶點(diǎn)，在不同類型的免疫細(xì)胞具有不同的效應(yīng)。與CLL進(jìn)展相關(guān)的成熟B細(xì)胞的亞型細(xì)胞中miRNA22表達(dá)增加，它作用于PTEN靶點(diǎn)，導(dǎo)致PI3K活性增加并增殖[12]。研究發(fā)現(xiàn)，系統(tǒng)性紅斑狼瘡患者B細(xì)胞中miR22、miR7和miR21的增高可誘導(dǎo)PTEN表達(dá)降低，而miR146a和miR155則干擾了Toll樣受體7和9下游的細(xì)胞內(nèi)信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路，導(dǎo)致細(xì)胞亞群分化異常、B細(xì)胞活化以及自身抗體的產(chǎn)生[13]。

當(dāng)脾臟和淋巴結(jié)中B細(xì)胞成熟成為抗體分泌細(xì)胞時(shí)，T細(xì)胞也會分化成為不同的效應(yīng)細(xì)胞，如CD4+T輔助細(xì)胞(Th1、Th2、Th17)和細(xì)胞毒性CD8+T細(xì)胞。miRNAs參與這些細(xì)胞的分化成熟。目前的研究熱點(diǎn)集中在Th17細(xì)胞，該類細(xì)胞被認(rèn)為參與了多發(fā)性硬化以及其他自身免疫性疾病的發(fā)生、發(fā)展[14，15]。小鼠缺乏miR155的T細(xì)胞不會誘導(dǎo)發(fā)生嚴(yán)重的實(shí)驗(yàn)性自身免疫性腦脊髓炎(EAE)，并且IL-17A顯著性地減低，而miRNA-30a則可通過降低IRF4的表達(dá)，抑制Th17分化[16]。miR155缺陷小鼠可以抵制膠原性關(guān)節(jié)炎的發(fā)生，并且通過STAT3信號通路損害Th17細(xì)胞的分化。更多的研究證實(shí)，miR155誘導(dǎo)Th17細(xì)胞分化的確是通過靶向作用于Jarid2基因[17]。不同于miR155是促進(jìn)Th17的分化，miR210是限制Th17分泌IL-17，從而參與小鼠炎性腸病模型中的自身免疫性疾病發(fā)生機(jī)制。老年小鼠中miR210抑制了自身抗體的產(chǎn)生。過表達(dá)的miR210可以降低類別轉(zhuǎn)化重組以及調(diào)節(jié)缺氧誘導(dǎo)因子-1α(HIF-1α)的表達(dá)，因此認(rèn)為其可以限制T細(xì)胞和B細(xì)胞的自身免疫反應(yīng)性應(yīng)答[18]。

miR17～92簇也通過靶基因Pten和Ikzf4參與了Th17細(xì)胞分化和功能[19]。敲除miR17～92簇可抑制Th17細(xì)胞的分化，并減少EAE的發(fā)病。但是，miR17家族成員miR-20b可以通過靶基因Rorc和Stat3抑制Th17培養(yǎng)細(xì)胞分泌IL-17[20]。T細(xì)胞中過表達(dá)miR17～92可誘導(dǎo)抗雙鏈DNA自身抗體的產(chǎn)生、多個(gè)器官的炎癥、脾臟和淋巴結(jié)的腫大。這可能與miR17～92促進(jìn)濾泡中Th細(xì)胞(Tfh)分化相關(guān)，部分是通過基因Pten和PKB磷酸酶Phlpp2靶向作用[21]。

三、miRNAs對Treg細(xì)胞的調(diào)控

miRNAs通過調(diào)控Treg細(xì)胞的穩(wěn)態(tài)及功能在維持外周免疫耐受中發(fā)揮重要作用。FOXP3是Treg細(xì)胞的標(biāo)志性分子，F(xiàn)oxp3基因突變能引起嚴(yán)重的自身免疫性疾病。小鼠FOXP3表達(dá)的細(xì)胞中Dicer或Drosha遺傳性消融會誘導(dǎo)致死性系統(tǒng)自身免疫性疾病。研究表明這些小鼠中Treg細(xì)胞在胸腺可以發(fā)育，但是具有miRNAs缺陷的Treg細(xì)胞維持穩(wěn)態(tài)的能力明顯降低，不能充分發(fā)揮其抑制功能。

Treg細(xì)胞中miR155高表達(dá)呈FOXP3依賴的方式，miR155的缺失會損害Treg細(xì)胞的發(fā)育和動(dòng)態(tài)平衡。缺失miR155的Treg細(xì)胞中其相應(yīng)靶基因細(xì)胞因子信號1抑制因子(suppressor of cytokine signaling 1, Socs1)的表達(dá)升高，從而降低對IL-2的應(yīng)答。IL-2是Treg細(xì)胞維持穩(wěn)態(tài)的關(guān)鍵調(diào)節(jié)因子。但是，miR155并不是Treg細(xì)胞抑制功能所必須的，因?yàn)閙iR155缺失的Treg細(xì)胞也能預(yù)防小鼠的自身免疫性疾病[15]。

在體外，miR17～92簇聯(lián)合miR17和miR19作用限制Treg(iTreg)細(xì)胞分化。在體內(nèi)，盡管miR17～92簇不是胸腺Treg細(xì)胞發(fā)育和維持穩(wěn)態(tài)所必須的，但卻是自身免疫性腦脊髓炎中抗原特異性Treg細(xì)胞產(chǎn)生了IL-10的關(guān)鍵作用因子[22]。miR10a通常表達(dá)于Treg細(xì)胞，與小鼠自身免疫性疾病的易感性呈負(fù)相關(guān)[23]。高易感性的小鼠其miR10a的表達(dá)最低，而抵抗性的小鼠中miR10a的表達(dá)最高。miR10a穩(wěn)定Treg細(xì)胞是通過靶向作用于轉(zhuǎn)錄抑制物Bcl6和Ncor2，從而促使Treg細(xì)胞產(chǎn)生持續(xù)高表達(dá)的Foxp3。因此，miR10a遺傳性消融并不能造成Treg缺陷或自身免疫。這也證實(shí)其他miRNAs如miR10b或者相關(guān)的miR99/100家族可能部分參與了Treg細(xì)胞功能調(diào)控。

盡管多個(gè)研究證實(shí)了特定的miRNAs參與了Treg細(xì)胞功能的調(diào)控，但是如何調(diào)控Treg細(xì)胞的信號通路仍然未知。其中PI3K通路受到多種miRNAs的調(diào)控，是CD4+T細(xì)胞分化成效應(yīng)T細(xì)胞或Treg細(xì)胞的中心節(jié)點(diǎn)[24]。CD4+T細(xì)胞Dicer消融能增加哺乳動(dòng)物雷帕霉素靶蛋白(mammalian target of rapamycin，mTOR)的活性和對TCR刺激的敏感度。mTOR由PI3K通路活化，是抗原受體、細(xì)胞因子受體和TLRs的一個(gè)關(guān)鍵集成整合分子。小鼠PI3K信號增加導(dǎo)致效應(yīng)CD4+T細(xì)胞增殖。實(shí)際上，增強(qiáng)PI3K信號可以阻斷Treg細(xì)胞中FOXP3的表達(dá)。PI3K信號提前終止會改變Treg細(xì)胞FOXP3的表達(dá)以及其相應(yīng)的功能行為。這表明了PI3K信號的時(shí)間周期操控可以導(dǎo)致Treg細(xì)胞和效應(yīng)T細(xì)胞之間平衡的改變?？傊?，這些通路的負(fù)性調(diào)節(jié)作用促進(jìn)了Treg基因的表達(dá)程序，通過對PI3K通路、NF-κB和MAPK通路的研究會發(fā)現(xiàn)更多的miRNAs參與Treg細(xì)胞的發(fā)育和穩(wěn)態(tài)功能作用的調(diào)控。

四、展 望

miRNAs作為一類在動(dòng)植物及病毒中廣泛存在的單鏈非編碼小分子RNA，近年來已經(jīng)成為表觀遺傳學(xué)領(lǐng)域研究的熱點(diǎn)。越來越多的研究表明miRNAs參與了自身免疫性疾病的發(fā)生和發(fā)展。盡管有很多的文章討論了不同自身免疫性疾病包括SLE、MS和EAE中多種miRNAs表達(dá)的改變以及對疾病發(fā)病機(jī)制的作用，但是本文著重于機(jī)體免疫耐受建立過程中miRNAs的調(diào)控作用，闡述了miR17～92、miR181、miR150、miR22、miR155、miR10a等對于T細(xì)胞、B細(xì)胞發(fā)育成熟以及相關(guān)功能的關(guān)鍵性調(diào)控作用。這些miRNAs表達(dá)的異常導(dǎo)致了自身免疫耐受機(jī)制的受損，致使自身反應(yīng)性淋巴細(xì)胞的產(chǎn)生或功能活躍，最終促進(jìn)自身免疫性疾病的發(fā)生和發(fā)展。總之，miRNAs是可行的的藥物靶點(diǎn)，深入認(rèn)識miRNAs在自身免疫性疾病中的病理作用機(jī)制，設(shè)計(jì)序列特異性miRNAs抑制劑有望成為治療自身免疫性疾病的新型藥物。