盧光琇

2018年12月20日，國際著名期刊《科學(xué)》公布了2018年度國際上的十大科學(xué)突破及三大惡劣科學(xué)事件，其中南方科技大學(xué)的賀建奎副教授團隊?wèi)?yīng)用CRISPR/Cas9技術(shù)進行以妊娠為目的的基因編輯事件被評選為影響最惡劣的三大科學(xué)事件之一[1]，作為2018年11月26日賀建奎在“第二屆人類基因編輯國際峰會”上宣稱其通過基因編輯出生的雙胞胎能天然抵抗艾滋病的“科研成果”的評判。實際上，賀建奎的基因編輯事件發(fā)生以來，已引起舉世關(guān)注和業(yè)界震驚。在中國，從包括衛(wèi)健委和科技部在內(nèi)的政府監(jiān)管機構(gòu)，到科學(xué)界以及大眾媒體，都對賀建奎副教授不負(fù)責(zé)任的臨床實踐表示強烈譴責(zé)?；蚓庉嫷降资鞘裁矗繛槭裁淳庉嬋祟惻咛CR5(C-C chemokine receptor type 5)基因預(yù)防艾滋病會引起如此大的擔(dān)憂？通過此事件我們需要總結(jié)什么經(jīng)驗教訓(xùn)？帶著這些問題，本文試圖反思CRISPR/Cas9技術(shù)對人類胚胎進行CCR5基因編輯的事件，總結(jié)相應(yīng)教訓(xùn)，規(guī)范科研行為。

1 國際上的研究顯示基因編輯安全性和有效性沒有得到充分證明

基因編輯，就是對生物體自身的基因進行有目的、精確的改造，包括插入新基因、敲除原有的自身基因和 “矯正”生物體有缺陷的基因等[2]?；蚓庉嫷陌l(fā)展可以追溯到50多年前人類對于遺傳病基因治療的探索。1963年，諾貝爾獎獲得者喬舒亞·萊德伯格(Joshua Lederberg)第一次提出了基因交換和基因優(yōu)化的概念，設(shè)想通過引入外源DNA進行基因修飾以有效治療人類遺傳疾病。1968年，美國醫(yī)生羅杰斯(Stanfield Rogers)證明病毒可以作為載體攜帶基因，1970年，他應(yīng)用含有精氨酸酶的乳頭瘤病毒載體來治療一對姐妹的精氨酸血癥，但試驗以失敗告終。1980年，美國克萊因教授應(yīng)用DNA重組技術(shù)將β-珠蛋白基因?qū)胍粋€患地中海貧血的重癥患者的骨髓細(xì)胞中，然后回輸?shù)襟w內(nèi)，但試驗還是以失敗告終。同時，由于該項目沒有通過倫理審查，違反美國聯(lián)邦法規(guī)，克萊因本人因此受到了包括被剝奪了系主任以及基金申請資格在內(nèi)的嚴(yán)厲懲罰。

20 世紀(jì)七八十年代，基因治療的基礎(chǔ)研究進展較快，發(fā)現(xiàn)了限制性內(nèi)切酶、DNA 連接酶和逆轉(zhuǎn)錄酶等與基因治療密切相關(guān)的關(guān)鍵酶，基因重組工程技術(shù)得到了前所未有的發(fā)展；90年代初，臨床前疾病模型的成功建立，標(biāo)志著基因治療技術(shù)體系的初步建立，由此啟動了病毒載體基因治療的臨床試驗。

1990年美國安德森(William French Anderson)醫(yī)生團隊成功地實施了歷史上首例基因療法的臨床試驗。他們在體外利用逆轉(zhuǎn)錄病毒載體基因轉(zhuǎn)移技術(shù)對從一個由于腺苷酸脫氨酶(adenosine deaminase，ADA)缺陷導(dǎo)致重癥聯(lián)合免疫缺陷病4歲女孩體內(nèi)分離的白細(xì)胞進行ADA基因治療，該女孩癥狀得到緩解，由此燃起了人們對于基因治療的期望。從1990年～2000年，全世界有4 000多名患者參與了500個基因治療臨床項目。但1999年，美國賓夕法尼亞大學(xué)對一位患有鳥氨酸氨甲?；D(zhuǎn)移酶缺乏癥的18歲美國男孩Jesse Gelsinger實施腺病毒載體注射的基因治療研究時，該男孩在接受注射4天后因免疫反應(yīng)帶來的細(xì)胞因子風(fēng)暴導(dǎo)致多器官衰竭死亡。此事件再次引起了人們對基因治療的安全性的擔(dān)憂，也促使基因治療的研究從亢奮回歸理性。之后，科學(xué)家們繼續(xù)開展一些零星的研究。2000年，法國阿蘭·費希爾(Alain Fisher)領(lǐng)導(dǎo)的研究組在2002年～2003年，對重癥聯(lián)合免疫缺陷綜合征患者實施ADA基因治療中，有2例出現(xiàn)了類白血病樣癥狀。其原因可能與采用的鼠白血病病毒載體的整合位點有關(guān)，導(dǎo)致某些細(xì)胞的失控性生長。這一事件導(dǎo)致基因治療臨床試驗受到了更嚴(yán)格的監(jiān)管，安全示范標(biāo)準(zhǔn)比其他治療方法設(shè)置的都要高出很多。

傳統(tǒng)的基因治療只是通過病毒載體導(dǎo)入基因，并不是精準(zhǔn)的定點整合基因修復(fù)，是隨機整合。近年來，科學(xué)家們經(jīng)過研究，發(fā)現(xiàn)在核酸酶的誘導(dǎo)下能有效地切割靶序列形成雙鏈斷裂，通過非同源末端連接(non-homologous end joining,NHEJ)實現(xiàn)特定片段或堿基的缺失或插入，或者在同源模板DNA的存在下，通過同源重組修復(fù)(homology directed repair,HDR)機制實現(xiàn)精確的基因修復(fù)[3]。目前已發(fā)展了三大基因編輯技術(shù)，包括鋅指核酸酶(zinc-finger nuclease,ZFN)、轉(zhuǎn)錄激活樣效應(yīng)因子核酸酶(transcription activator-like effector nuclease,TALEN)和常間回文重復(fù)序列叢集(clustered regularly interspaced short palindromic repeats，CRISPR)。ZFN基因編輯技術(shù)又稱第一代基因編輯技術(shù)，但ZFN技術(shù)需要為每個靶基因定制與其結(jié)合的效應(yīng)蛋白，因此限制了ZFN的廣泛應(yīng)用[4]。TALEN又稱第二代基因編輯技術(shù)，可以切割任何感興趣的DNA序列，但是TALEN方法仍然需要為每段DNA序列設(shè)計一對特定的核酸酶[5]。2012年，Doudna和Charpentier發(fā)現(xiàn)了細(xì)菌防御系統(tǒng)中的常間回文重復(fù)序列叢集/常間回文重復(fù)序列叢集相關(guān)蛋白9系統(tǒng)(CRISPR/Cas9)，并發(fā)展成第三代基因編輯技術(shù)，該技術(shù)可以通過一段特殊的引導(dǎo)RNA(gRNA)對感興趣的DNA位點進行有效編輯[6]。CRISPR/Cas9技術(shù)因具有操作簡單、成本低以及編輯效率高等優(yōu)點，被《科學(xué)》雜志列為2013年度十大科技進展之一。

盡管目前已發(fā)展到第三代基因編輯技術(shù)，但基因編輯的安全性和有效性仍未得到充分的證明。目前發(fā)表了大量應(yīng)用CRISPR技術(shù)編輯人類廢棄胚胎的文章，包括2017年在國際頂級期刊發(fā)表的文章[7-8]，我國學(xué)者也在這一領(lǐng)域進行了一系列開創(chuàng)性的研究，包括2018年我國科學(xué)家成功利用堿基編輯修復(fù)了人類胚胎中的馬凡綜合征(Marfan syndrome,MFS)致病性基因突變[9]?；谇捌诨蛑委熯^程中發(fā)生的一系列安全事故，人們對于基因編輯更加謹(jǐn)慎?？傮w而言，目前的共識是基因編輯只能用于研究的目的，不能用于單純生殖目的。

2 我國的探索也顯示目前胚胎水平的基因修飾仍存在安全性問題

我國學(xué)者盧惠霖在20世紀(jì)70年代就提出了積極性優(yōu)生的設(shè)想，即可以在配子和胚胎進行遺傳學(xué)改造，避免遺傳缺陷患兒的出生，實現(xiàn)積極性優(yōu)生。按照這個設(shè)想，人們早期試圖通過轉(zhuǎn)基因手段來實現(xiàn)遺傳病的治療。以顯微注射的方法，先后構(gòu)建EB病毒、EB病毒潛伏膜蛋白基因、人類淀粉樣前體蛋白基因瑞典型突變等轉(zhuǎn)基因小鼠，發(fā)現(xiàn)顯微注射方法制備的轉(zhuǎn)基因小鼠，基因隨機整合，存在位置效應(yīng),可能插入到其他染色體，破壞重要的基因并可能導(dǎo)致新的疾病，因此，轉(zhuǎn)基因不是基因治療的理想方法。接下來，人們試圖建立基于小鼠同源重組的基因治療技術(shù)，即基因打靶策略。在建立小鼠基因打靶技術(shù)平臺時，國際上出現(xiàn)了人類胚胎干細(xì)胞(human embryonic stem cell,hES)技術(shù)。人們想到人類胚胎干細(xì)胞建系與建庫是另一種治療遺傳病的可行思路：將來一些遺傳病患者，有可能通過人ES細(xì)胞誘導(dǎo)成所需要的細(xì)胞與器官來治愈遺傳缺陷，就像汽車零件壞了可以配一個零件進行修理，將來也可以通過干細(xì)胞誘導(dǎo)分化為人體“新零件”來進行修復(fù)。筆者2001年首次建成了國內(nèi)的第一株人ES細(xì)胞系，2004年被批準(zhǔn)成立人類干細(xì)胞國家工程研究中心，2009年在CellStemCell雜志上報道構(gòu)建了世界上最大的ES細(xì)胞庫，建立了174株人ES細(xì)胞，即可以滿足湖南省6 700萬人口進行細(xì)胞與器官移植的組織配型需求[10]。

現(xiàn)有研究證實了基因編輯的有效性。2014年，Zhou等[11]通過ZFN基因編輯技術(shù)，在體外敲除p53基因同時過表達NeuroD2基因，成功將人的成纖維細(xì)胞“誘導(dǎo)”為功能性神經(jīng)元，實現(xiàn)了從一種終末細(xì)胞向另一種終末細(xì)胞的轉(zhuǎn)分化，有望為脊髓損傷、帕金森病、阿爾茨海默病的神經(jīng)細(xì)胞替代治療提供新的細(xì)胞來源，同時避免免疫排斥的問題。

但基因編輯如果應(yīng)用于人類的基因治療，其安全性如何？還需要大量的基礎(chǔ)研究。因此，目前人們從預(yù)防入手，應(yīng)用產(chǎn)前診斷和胚胎植入前遺傳學(xué)診斷(preimplantation genetic diagnosis，PGD)避免遺傳性出生缺陷患兒出生。1990年，筆者建立了國內(nèi)最早的植入前遺傳學(xué)診斷鼠胚模型，1998年應(yīng)用于人類，2003年對染色體羅氏易位攜帶者實施PGD，出生了健康的子代。2017年8月，國際著名期刊Nature以China's push for better babies為題，肯定了包括筆者醫(yī)院在內(nèi)的中國生殖醫(yī)學(xué)界通過PGD預(yù)防遺傳性出生缺陷的工作[12]。迄今為止，筆者已完成11 588個PGD周期，出生了3 023個健康孩子，還有1 000多個孩子正在妊娠中。

3 基因編輯胚胎CCR5基因?qū)τ陬A(yù)防艾滋病目前技術(shù)上不成熟

艾滋病是由于HIV病毒感染引起的，包括HIV-1與HIV-2兩種亞型，艾滋病以HIV-1感染為主。編輯CCR5基因來預(yù)防艾滋病來自于20多年前的發(fā)現(xiàn)。1996年科學(xué)家發(fā)現(xiàn)，10%歐洲人群中存在CCR5-Δ32基因變異,這種變異表現(xiàn)為CCR5基因的32個堿基缺失導(dǎo)致的蛋白質(zhì)翻譯提前終止，并且攜帶這種變異的人群可以顯著抵抗HIV-1感染。

CCR5是一種G蛋白偶聯(lián)受體，與多種下游信號蛋白相互作用，在免疫系統(tǒng)中作為趨化因子受體而發(fā)揮作用。HIV-1感染人類時，需要通過CD4分子及其輔助受體趨化因子受體CCR5或CXCR4發(fā)生相互作用 (CXCR4也是HIV感染CD4+T細(xì)胞的幾種趨化因子受體之一)[13]。因此，當(dāng)CCR5基因失去功能時，CCR5受體的功能被阻斷，HIV-1病毒不能感染人的CD4細(xì)胞。因此，編輯CCR5基因，使在理論上治療與預(yù)防艾滋病成為可能。

2014年,Tebas團隊[14]發(fā)表在《新英格蘭醫(yī)學(xué)雜志》上的報道稱，他們從12名艾滋病病毒感染者體內(nèi)提取未被感染的 T 細(xì)胞，并對該細(xì)胞的 CCR5 基因進行改造，將編輯后的細(xì)胞回輸?shù)桨滩』颊唧w內(nèi)后顯著提高了機體對艾滋病病毒的抵抗能力。2015年中國深圳啟動了基因編輯治療艾滋病的“863計劃”課題，用CRISPR/Cas9技術(shù)對艾滋病患者造血干細(xì)胞或T細(xì)胞的基因組進行編輯，將敲除CCR5基因的T細(xì)胞再回輸?shù)桨滩』颊呱砩?，以此切斷HIV病毒進入細(xì)胞的通道。2016年，廣州醫(yī)科大學(xué)研究團隊報道使用CRISPR/Cas9技術(shù)對人類異常受精卵CCR5基因進行編輯，并獲得了能有效免疫艾滋病毒的CCR5-Δ32突變的胚胎[15]。2017年我國科學(xué)家通過CRISPR技術(shù)對人HSPC細(xì)胞的CCR5基因進行編輯，移植到小鼠體內(nèi)后能產(chǎn)生正常的免疫細(xì)胞，進而阻止HIV的擴散，這是首次利用CRISPR技術(shù)在動物模型中成功地讓HSPC細(xì)胞發(fā)生持久的CCR5突變[16]。

但以往編輯CCR5基因用于預(yù)防和治療艾滋病，是在體細(xì)胞水平，是針對艾滋病患者本身進行的基因治療，這不導(dǎo)致患者本身基因組的改變，在安全性已經(jīng)經(jīng)過了大量的基礎(chǔ)研究，是傳統(tǒng)基因治療的一種方式，在倫理上也比較容易接受。而在胚胎水平對基因進行編輯，目前在技術(shù)上還是不行的，主要表現(xiàn)在基因編輯的安全性問題沒有得到很好地解決，涉及在以下四個方面。

第一，艾滋病病毒進入人體的方式是多種多樣的，CCR5只是其中一個非常重要的受體，但病毒仍然可以繞過它并通過其他機制進入細(xì)胞。所以，即使完全敲除CCR5基因，也不能徹底阻斷艾滋病病毒進入細(xì)胞。

我們知道，在全社會固定資產(chǎn)投資中，按資金來源劃分為預(yù)算內(nèi)資金、金融機構(gòu)貸款、外商投資和自籌投資、其他投資五個部分，前三個部分都有明確的界定和相對制度化的融資機制，而自籌投資和其他投資則十分復(fù)雜。因此，要準(zhǔn)確對一個國家(或地區(qū))的社會游資總量進行測算是非常困難的。浙江省到底有多少社會游資，這是一個大家比較關(guān)注的話題。目前，關(guān)于游資的度量，理論文獻尚未提出合理的測算方法。二戰(zhàn)后，經(jīng)濟學(xué)界曾試圖對地下經(jīng)濟的規(guī)模做出估量，并提出了一些估算方法，如固定比率法、加特曼法、現(xiàn)金比率法等。我國學(xué)者運用這些方法對國內(nèi)的社會游資總量進行了測算。

第二，HIV-1有多種亞型，不同的亞型感染細(xì)胞時可能涉及到不同的輔助受體(CCR5或CXCR4)，而中國人主要流行的是CRF01_AE亞型[17-18]，其感染途徑主要通過CXCR4受體(X4艾滋病毒株侵入受體)，而歐洲主要為B亞型，其感染途徑主要通過CCR5受體(R5艾滋病毒株侵入受體)，因此，敲除CCR5基因應(yīng)用到中國人群理論上也只能避免部分人感染艾滋病病毒。

第三，CCR5基因是經(jīng)過長期進化，在各種物種中高度保守的基因，在骨髓、淋巴組織和腦等多種組織中有表達，這提示CCR5對于維持正常生理功能有重要意義。CCR5可以結(jié)合β-趨化因子以保護神經(jīng)元，所以對CCR5進行基因編輯可能會使得一些相關(guān)功能丟失。CCR5基因在幾種腦炎病毒(如西尼羅病毒、鼠肝炎病毒和單純性皰疹病毒)感染招募T細(xì)胞時起重要作用，因此基因編輯過的嬰兒可能會面臨一系列可能的感染[19]。敲除CCR5基因固然降低了人們感染艾滋病病毒的風(fēng)險，但同時增加了感染其他病毒的風(fēng)險。

第四，CRISPR/Cas9基因編輯技術(shù)的脫靶問題還沒有完全解決。所謂脫靶，就是基因編輯這把手術(shù)刀沒有精確地按設(shè)計進行手術(shù)，敲除CCR5可能會影響到其他基因，進而影響到細(xì)胞功能。筆者也曾以胚胎干細(xì)胞為材料，應(yīng)用CRISPR/Cas9技術(shù)研究基因編輯CCR5基因的安全性，研究結(jié)果顯示目前還不能確保其安全性。筆者利用10枚經(jīng)過CCR5基因編輯后發(fā)育至囊胚階段的胚胎分離胚胎干細(xì)胞系，共獲得2株胚胎干細(xì)胞，編輯后進行基因測序，結(jié)果提示其中1株胚胎干細(xì)胞系可能存在嵌合，并發(fā)現(xiàn)有可疑的脫靶位點，因此，在完全排除基因編輯的脫靶問題的情況下，將基因編輯技術(shù)應(yīng)用于臨床為時過早。

4 基因編輯仍前景廣闊，不應(yīng)因噎廢食

賀建奎宣布成功“培育”出基因編輯嬰兒受到廣泛質(zhì)疑與猛烈批評，同時也引發(fā)了科學(xué)界對于基因編輯的發(fā)展會因此受到阻滯的擔(dān)憂[20-21]。哈佛醫(yī)學(xué)院科學(xué)家喬治·戴利(George Daley)表示，不希望因此次事件讓人們放棄對CRISPR技術(shù)的興趣，更不希望基因編輯技術(shù)未來的發(fā)展受到影響。

任何醫(yī)療新技術(shù)的出現(xiàn)及應(yīng)用，都不是一帆風(fēng)順的，要經(jīng)歷螺旋式前進、遇挫甚至是倒退和再前進的過程，最終才能以更穩(wěn)健的面目走上歷史舞臺。早期的基因治療技術(shù)，其發(fā)展經(jīng)歷了多次的艱難。從充滿希望到一度被禁止，再到目前因為基因編輯技術(shù)的出現(xiàn)而對人類一些遺傳疾病的預(yù)防給予“綠燈”放行，經(jīng)歷了慢長的過程。目前有多種嚴(yán)重致畸、致殘、致死的遺傳病，例如，臺-薩氏綜合征(Tay-Sachs diesease)或囊腫性纖維化等遺傳疾病，已經(jīng)被包括美國食品藥品監(jiān)督管理局在內(nèi)的機構(gòu)批準(zhǔn)實施基因治療。但目前人們對于基因編輯的臨床應(yīng)用主要還是限于體細(xì)胞基因編輯以治療遺傳缺陷或者腫瘤等重大疾病。

科學(xué)經(jīng)常會引起倫理的爭議，但在法律規(guī)定和倫理規(guī)范的監(jiān)管下會得到更好的發(fā)展。2015年4月，我國中山大學(xué)的黃軍就科研團隊利用CRISPR/Cas9技術(shù)，修改人類胚胎中可能導(dǎo)致β型地中海貧血的基因[22]，并將成果發(fā)表于正式的學(xué)術(shù)雜志《蛋白質(zhì)與細(xì)胞》上，起初遭到國際生物醫(yī)學(xué)界的反對，《自然》和《科學(xué)》雜志認(rèn)為其研究可能引發(fā)難以預(yù)料的風(fēng)險，強調(diào)應(yīng)對人類胚胎研究加以嚴(yán)格限制，以避免其應(yīng)用導(dǎo)致不安全和不合倫理的后果。但由于他所進行的研究選用的是三原核受精卵胚胎，這是輔助生殖技術(shù)臨床應(yīng)用中不能用于移植的廢棄胚胎，并沒有違反國家的法律與法規(guī)。不久他的研究價值得到肯定，并在年底轉(zhuǎn)而被《自然》雜志評為年度人物。黃軍就的研究引發(fā)的沖突促成了相關(guān)國際倫理制約機制的建設(shè)。2015年12月，中英美等國共同成立了“人類基因編輯：科學(xué)、醫(yī)學(xué)和倫理委員會”，并在其后起草的報告《人類基因編輯：科學(xué)、倫理學(xué)和治理》中原則上承認(rèn)了胚胎基因編輯在倫理上的可接受性。而今年7月英國納菲爾德生命倫理學(xué)理事會所發(fā)布的報告進一步指出，在充分考慮科學(xué)技術(shù)及其社會影響的條件下，通過基因編輯技術(shù)修改人類胚胎、精子或卵細(xì)胞細(xì)胞核中的DNA在“倫理上可接受”。

5 我們應(yīng)吸取的教訓(xùn)

賀建奎事件為什么引起人們的震驚，并被廣泛的譴責(zé)，在于他不但不能從技術(shù)上確保方案的安全性與有效性，突破了國際上對于基因編輯倫理的紅線，而且同時突破了中國的倫理與法律底線。我國頒布了《人類輔助生殖技術(shù)管理辦法》，其中的輔助生殖技術(shù)倫理原則對于胚胎研究及基因編輯有明確規(guī)定，包括：醫(yī)務(wù)人員不得進行各種違反倫理、道德原則的配子和胚胎實驗研究及臨床工作?？梢砸匝芯繛槟康?，對人體胚胎實施基因編輯和修飾，但體外培養(yǎng)期限自受精或者核移植開始不得超過14天。在胚胎水平進行基因編輯，只限于研究目的，應(yīng)用廢棄胚胎。而基于生殖目的，應(yīng)用基因編輯技術(shù)出生孩子，是中國的法律與倫理絕對禁止的。筆者認(rèn)為基因編輯對于遺傳病的研究還是很有價值的，但徹底的基因編輯方式還是應(yīng)該從精子、卵子或者單細(xì)胞受精卵來進行，同時需要在臨床前進行大量的動物實驗和臨床前試驗，通過國家級的批準(zhǔn)以及技術(shù)各方面安全性、有效性等的評估，才能用于生殖細(xì)胞。

如何確保生命科學(xué)領(lǐng)域的新技術(shù)，真正安全有效地服務(wù)于人類，是擺在包括科學(xué)家與政府在內(nèi)全人類的共同問題。新技術(shù)需要在科學(xué)上確保安全性與有效性，在法律上遵守國家法律的底線，同時受到倫理的約束與監(jiān)管。建議我國，對于重大的科學(xué)技術(shù)的臨床應(yīng)用，不能以市級、省級甚至是某一個醫(yī)院的批準(zhǔn)來執(zhí)行，而應(yīng)該在國家層面上進行包括科學(xué)界、法律界、倫理界、患者、群眾代表等成員參與的廣泛聽證，新技術(shù)應(yīng)用的申請者可以充分闡述其申請的理由，參與聽證的成員需在各個層面深入探討新技術(shù)應(yīng)用的利與弊，以國家認(rèn)可的方式實施，并接受國家層面的嚴(yán)格監(jiān)管。這樣，既不會因某個事件導(dǎo)致科學(xué)技術(shù)的停滯，打壓科學(xué)創(chuàng)新，又能使新技術(shù)在符合倫理與法律的框架實施，不會導(dǎo)致新技術(shù)被某些醫(yī)療機構(gòu)濫用，或者被某些科學(xué)“狂人”利用。