王曉曉，饒慧瑛，劉 峰

(北京大學(xué)人民醫(yī)院 北京大學(xué)肝病研究所 丙型肝炎和肝病免疫治療北京市重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，北京 100044)

非酒精性脂肪性肝病(non-alcoholic fatty liver disease,NAFLD)是包括非酒精性脂肪肝(non-alcoholic fatty liver，NAFL)、非酒精性脂肪性肝炎(non-alcoholic steatohepatitis,NASH)、肝纖維化、肝硬化和肝細(xì)胞癌的一組疾病[1]。NAFLD的全球發(fā)病率約為24%，發(fā)病率最高的地區(qū)是南美(31%)和中東(32%)，其次是亞洲(27%)、美國(24%)和歐洲(23%)，且其發(fā)病率與肥胖和 2型糖尿病的發(fā)病率呈正相關(guān)[2]。NAFLD一旦進(jìn)展至肝纖維化和肝硬化，肝臟相關(guān)疾病的死亡率將大大增加，因此NASH-肝硬化被認(rèn)為是繼慢性丙型肝炎后第2位常見的肝移植指征[3]。目前NAFLD的發(fā)病機(jī)制尚不清楚且無有效治療措施，探討NAFLD的發(fā)病機(jī)制進(jìn)而尋找有效防治措施對(duì)解決NAFLD面臨的經(jīng)濟(jì)負(fù)擔(dān)至關(guān)重要。盡管研究認(rèn)為“多重打擊”學(xué)說已經(jīng)能夠比較完整地解釋NAFLD的復(fù)雜性，但是天然免疫在其中扮演的重要角色仍沒有完全闡明?，F(xiàn)著重對(duì)巨噬細(xì)胞在NAFLD發(fā)生、發(fā)展中的重要作用進(jìn)行論述。

1 傳統(tǒng)意義上NASH的發(fā)病機(jī)制

1.1“二重打擊”學(xué)說 早期研究人員用“二重打擊”學(xué)說來解釋NASH的發(fā)病機(jī)制。這一學(xué)說認(rèn)為在疾病的起始階段，肝臟脂肪沉積是第一重打擊，表現(xiàn)為肝臟三酰甘油聚集和胰島素抵抗，當(dāng)肝臟受到其他因素(如炎癥細(xì)胞因子大量釋放、線粒體損傷和氧化應(yīng)激等)帶來的“二重打擊”時(shí)會(huì)加重NASH的進(jìn)展。脂肪變性的肝臟比較容易受到這些“二重打擊”因素的影響，肝臟進(jìn)一步進(jìn)展為壞死性炎癥和纖維化，并最終發(fā)展為肝硬化[4-5]。然而，隨著研究的深入“二重打擊”學(xué)說已不能全面揭示NAFLD發(fā)病機(jī)制的復(fù)雜性。在NAFLD的發(fā)生、發(fā)展中，有眾多信號(hào)分子蛋白通路的參與，而且并不確定NASH僅是發(fā)生在NAFL的基礎(chǔ)上。此外，對(duì)眾多NAFLD患者而言，NAFLD發(fā)生的致病驅(qū)動(dòng)基因并不總是一致的，導(dǎo)致疾病發(fā)生的機(jī)制和患者的臨床表現(xiàn)具有高度的異質(zhì)性[6]。

1.2“多重打擊”學(xué)說 目前被廣泛接受的是“多重打擊”學(xué)說，由于遺傳和環(huán)境因素的相互作用以及不同器官和組織(包括脂肪組織、胰腺、腸道和肝臟)之間的相互關(guān)聯(lián)，“多重打擊”學(xué)說將更廣泛的代謝功能障礙機(jī)制囊括在內(nèi)[7]。在NAFL和NASH背景下，肝臟處理主要代謝能量代謝物、碳水化合物和脂肪酸的能力受損，導(dǎo)致毒性脂類物質(zhì)的堆積[8-9]。這些毒性脂類的堆積可誘導(dǎo)肝細(xì)胞氧化應(yīng)激壓力、損傷和死亡，導(dǎo)致纖維形成，并進(jìn)一步導(dǎo)致肝硬化和肝細(xì)胞癌[10]。因此，肝細(xì)胞內(nèi)脂類毒性物質(zhì)是NASH發(fā)生、發(fā)展的關(guān)鍵。NASH時(shí)肝細(xì)胞損傷以內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激壓力、炎性小體激活、凋亡通路激活等特點(diǎn)為主[11-13]。其他因素，如細(xì)胞因子和脂肪因子功能失調(diào)、ATP缺乏、尿酸毒性、睡眠呼吸暫停時(shí)的周期性缺氧以及腸道微生物的產(chǎn)物也可能參與調(diào)節(jié)肝細(xì)胞的脂毒性應(yīng)激、損傷和炎癥的發(fā)展，但對(duì)NASH發(fā)生、發(fā)展的影響尚不完全清楚[14]。而在NAFLD的發(fā)生、發(fā)展的眾多影響因素(尤其是毒性脂類的堆積)中，天然免疫細(xì)胞激活的重要作用不容忽視。

2 天然免疫巨噬細(xì)胞與NAFLD發(fā)生、發(fā)展的相關(guān)性

肝臟是重要的免疫器官，肝臟的免疫功能主要?dú)w功于各種免疫細(xì)胞，包括巨噬細(xì)胞、樹突狀細(xì)胞、中性粒細(xì)胞和肥大細(xì)胞等。巨噬細(xì)胞是肝臟天然免疫的第一道防線，在NAFLD的發(fā)生、發(fā)展中起關(guān)鍵作用。

在正常人的肝臟中，每100個(gè)肝細(xì)胞就有20～40個(gè)巨噬細(xì)胞伴隨存在，是機(jī)體單核吞噬細(xì)胞中數(shù)量最多的細(xì)胞群體[15]。從細(xì)胞來源上講，肝臟中巨噬細(xì)胞包括肝臟固有的巨噬細(xì)胞(Kupffer細(xì)胞)和單核細(xì)胞來源的巨噬細(xì)胞(monocyte-derived macrophages,MoMFs)。從細(xì)胞功能上講，肝臟中巨噬細(xì)胞可分為M1型(促炎型)和M2型(抗炎型)巨噬細(xì)胞，兩種細(xì)胞在抗炎和促纖維化方面各有不同。此外,根據(jù)巨噬細(xì)胞表面標(biāo)志物的表達(dá)差異巨噬細(xì)胞也被賦予了不同的特點(diǎn)。

2.1“細(xì)胞來源”角度 肝臟中巨噬細(xì)胞是一種異質(zhì)性的細(xì)胞群，包括肝臟固有的Kupffer細(xì)胞和從外周血招募進(jìn)入肝臟的MoMFs。MoMFs主要通過CC趨化因子受體2(CC chemokine receptor 2，CCR2)-CC趨化因子配體2(CC chemokine ligand 2，CCL2)相互作用被招募進(jìn)入肝臟[16]，其他趨化因子信號(hào)通路，如CXC趨化因子受體3-CXC趨化因子配體10、CCR1-CCL5或CCR8-CCL1也參與單核細(xì)胞的聚集[17-19]。在肝臟疾病或損傷狀態(tài)下，單核細(xì)胞迅速分化為巨噬細(xì)胞，成為主要的巨噬細(xì)胞群，與真正的Kupffer細(xì)胞無法區(qū)分，但又不同于循環(huán)中的單核細(xì)胞[20]，這些巨噬細(xì)胞定位于肝竇內(nèi)，能優(yōu)先與外源性免疫反應(yīng)物質(zhì)或內(nèi)源性信號(hào)分子接觸，吞噬、加工和呈遞抗原，并分泌多種促炎介質(zhì)，如細(xì)胞因子、前列腺素、氧化氮和活性氧中間體[21]。

2.2“細(xì)胞功能”角度 為了保持穩(wěn)定狀態(tài)，巨噬細(xì)胞能對(duì)外界刺激物做出應(yīng)答，極化為M1型(促炎型巨噬細(xì)胞)或M2型(抗炎型巨噬細(xì)胞)巨噬細(xì)胞亞型[22]。M1型巨噬細(xì)胞的功能是促進(jìn)炎癥細(xì)胞因子以及活性氧類的產(chǎn)生增加，而M2型巨噬細(xì)胞的主要功能為進(jìn)行免疫調(diào)節(jié)、抑制寄生蟲感染和加強(qiáng)組織重塑[23]。Kupffer細(xì)胞本身具有與M1型巨噬細(xì)胞相似的功能，可增加促炎細(xì)胞因子(如腫瘤壞死因子-α、白細(xì)胞介素-6等)的產(chǎn)生，促進(jìn)肝臟疾病的進(jìn)展，并通過分泌炎癥細(xì)胞因子參與脂肪酸氧化、肝臟脂質(zhì)儲(chǔ)存和胰島素抵抗等[24]。由此可見，巨噬細(xì)胞的不同極化狀態(tài)可能參與NAFLD不同階段的疾病進(jìn)展。

2.2.1M1型巨噬細(xì)胞參與NAFLD肝臟炎癥的進(jìn)展 巨噬細(xì)胞在NASH發(fā)生、發(fā)展中起關(guān)鍵作用。一方面，巨噬細(xì)胞通過與由肝臟脂肪沉積產(chǎn)生的損傷相關(guān)分子模式相互作用促進(jìn)NASH進(jìn)展[15]。由于巨噬細(xì)胞具有吸收和代謝多余脂質(zhì)的所有遺傳機(jī)制，它們參與NASH的發(fā)病機(jī)制很可能與脂質(zhì)累積有關(guān)[25]。如Leroux等[26]的研究已經(jīng)證明，高脂飲食小鼠的Kupffer細(xì)胞中脂質(zhì)沉積，這使脂質(zhì)代謝通路相關(guān)基因的表達(dá)發(fā)生改變。另一方面，因?yàn)閾p傷相關(guān)分子模式和病原體相關(guān)分子模式的存在可導(dǎo)致促炎性肝臟巨噬細(xì)胞形成，進(jìn)而參與NAFLD進(jìn)展[27]。在NASH的炎癥進(jìn)展期，肝臟巨噬細(xì)胞以M1型為主，這可能是脂滴和非酯化脂肪酸過量刺激的結(jié)果[28]。肝臟促炎型巨噬細(xì)胞的極化被認(rèn)為是NASH患者肝臟疾病進(jìn)展的標(biāo)志[29]。炎癥性巨噬細(xì)胞可通過幾種機(jī)制促進(jìn)NASH的進(jìn)展，包括影響肝細(xì)胞脂肪變、介導(dǎo)炎性淋巴細(xì)胞浸潤、刺激血管生成或加重肝纖維化[30]。

2.2.2M2型巨噬細(xì)胞參與NAFLD肝臟纖維化的進(jìn)展 雖然大多數(shù)研究表明M1型巨噬細(xì)胞在NAFLD發(fā)生中起重要作用[28-30]，但M2型巨噬細(xì)胞有助于阻止NAFLD時(shí)肝臟炎癥的進(jìn)展，并加重肝臟纖維化的形成[29]。在NASH患者中，肝纖維化是預(yù)測肝臟相關(guān)疾病總體死亡率的主要病理學(xué)特征[31]，其中一個(gè)主要原因是肝臟中與纖維化形成相關(guān)的M2型巨噬細(xì)胞顯著增多[32]。Kupffer細(xì)胞或受損的肝細(xì)胞膜表面表達(dá)各種趨化因子受體的配體，循環(huán)中的單核細(xì)胞通過多種趨化因子受體與這些配體相互作用被招募進(jìn)入肝臟[16,33]，浸潤的單核細(xì)胞在特定刺激下可分化為M2型巨噬細(xì)胞，進(jìn)而使肝星狀細(xì)胞激活成為成纖維細(xì)胞，分泌細(xì)胞外基質(zhì)，尤其是促進(jìn)膠原的產(chǎn)生[34]。

盡管調(diào)節(jié)NAFLD疾病狀態(tài)下M1/M2型巨噬細(xì)胞的比值可能是一種有效的治療方法，但目前尚不清楚M1和M2型巨噬細(xì)胞是否代表完全獨(dú)立的巨噬細(xì)胞群，如同時(shí)表達(dá)M1和M2兩種細(xì)胞表型標(biāo)志物的巨噬細(xì)胞屬性將無法判斷[1]。外源單核細(xì)胞可轉(zhuǎn)化為肝臟固有的Kupffer細(xì)胞，又不同于Kupffer細(xì)胞，說明在NAFLD背景下肝臟巨噬細(xì)胞庫至少包括3種不同的細(xì)胞群,但是目前仍無法明確區(qū)分肝臟固有的Kupffer細(xì)胞和外源的肝臟巨噬細(xì)胞[25,35]。

2.2.3不同表面標(biāo)記的巨噬細(xì)胞與NAFLD進(jìn)展的相關(guān)性 在NAFLD患者中，CCR2被認(rèn)為是單核細(xì)胞來源的巨噬細(xì)胞的主要標(biāo)志物，NAFLD的不同進(jìn)展階段都有CCR2+巨噬細(xì)胞的聚集，且主要存在于匯管區(qū)。在NASH-纖維化和肝硬化階段CCR2+巨噬細(xì)胞顯著增多，甚至可以浸潤到肝小葉內(nèi)[36]。S100A9+巨噬細(xì)胞是CCR2+巨噬細(xì)胞的一種促炎表型，隨著NASH進(jìn)展，S100A9+巨噬細(xì)胞數(shù)也顯著增加[37]。CD68是一種溶酶體相關(guān)跨膜糖蛋白，參與低密度脂蛋白的代謝，是經(jīng)典的Kupffer細(xì)胞表面標(biāo)志物，CD68+巨噬細(xì)胞主要定位于肝小葉，在NASH的不同進(jìn)展階段不如CCR2+巨噬細(xì)胞變化明顯。Kupffer細(xì)胞也表達(dá)CD163，是抗炎型巨噬細(xì)胞的標(biāo)志物，在NASH纖維化或肝硬化患者中顯著增多[36]。近年來，CLEC5A(C-type lectin domain family 5 member A)被認(rèn)為是單核細(xì)胞來源的促炎型的巨噬細(xì)胞，CD163L(可溶性的CD163配體)也被認(rèn)為是肝臟固有巨噬細(xì)胞的標(biāo)志物，兩種陽性細(xì)胞增多分別與肝臟炎癥和纖維化進(jìn)展相關(guān)[38]。在NAFLD小鼠模型的研究中，Ly6C+巨噬細(xì)胞被認(rèn)為是單核細(xì)胞來源的巨噬細(xì)胞，其可在肝臟疾病情況下分化成Kupffer細(xì)胞，并加重脂肪性肝炎和纖維化[30]。

3 巨噬細(xì)胞參與NAFLD發(fā)生、發(fā)展的分子機(jī)制

3.1模式識(shí)別受體與NAFLD發(fā)生、發(fā)展的相關(guān)性 肝臟巨噬細(xì)胞可以通過激活模式識(shí)別受體促進(jìn)免疫炎癥反應(yīng)。常見的模式識(shí)別受體有Toll樣受體和清道夫受體等。在各種飲食誘導(dǎo)的NASH小鼠模型(如膽堿缺乏的氨基酸飲食、蛋氨酸/膽堿缺乏飲食和高脂飲食)中，多余的代謝產(chǎn)物(如膽固醇結(jié)晶、飽和脂肪酸)和相關(guān)氧化應(yīng)激產(chǎn)物可激活膜表面Toll樣受體(如Toll樣受體2和Toll樣受體4)，進(jìn)一步促進(jìn)核因子κB發(fā)生核轉(zhuǎn)位，刺激肝臟炎癥細(xì)胞因子的轉(zhuǎn)錄和合成[39]。在膽堿缺乏的氨基酸飲食和高脂飲食飲食誘導(dǎo)的NASH模型中，內(nèi)質(zhì)網(wǎng)Toll樣受體蛋白(如Toll樣受體9)可結(jié)合損傷肝細(xì)胞釋放的線粒體DNA，并進(jìn)一步加速炎癥反應(yīng)[39]。另外，高脂飲食和蛋氨酸/膽堿缺乏飲食誘導(dǎo)的NASH模小鼠型中，過量的代謝產(chǎn)物可激活并促進(jìn)Kupffer細(xì)胞中Nod樣受體蛋白3炎性小體復(fù)合物的組裝，并進(jìn)一步促進(jìn)細(xì)胞因子的成熟和釋放[40-41]。

Kupffer細(xì)胞的吞噬功能極強(qiáng)，能通過清道夫受體和溶酶體介導(dǎo)的吞噬功能從門靜脈循環(huán)中清除微粒物質(zhì)[42-44]。在營養(yǎng)過剩的情況下，過量的代謝物以及易位的細(xì)菌產(chǎn)物可以激活清道夫受體并引發(fā)促炎反應(yīng)。如NASH時(shí)Kupffer細(xì)胞中清道夫受體(如CD36和清道夫受體-A)上調(diào)，清道夫受體上調(diào)可增加溶酶體中過量的氧化型低密度脂蛋白和膽固醇晶體的運(yùn)輸、積累和捕獲，導(dǎo)致溶酶體損傷，進(jìn)一步導(dǎo)致Kupffer細(xì)胞產(chǎn)生促炎癥細(xì)胞因子[42-43]。

3.2補(bǔ)體激活參與NAFLD的發(fā)生、發(fā)展 肝細(xì)胞中巨噬細(xì)胞通過清除補(bǔ)體蛋白和釋放細(xì)胞因子促進(jìn)局部免疫反應(yīng)。代謝壓力下，Kupffer細(xì)胞釋放大量細(xì)胞因子和趨化因子(如白細(xì)胞介素-1、腫瘤壞死因子-α、單核細(xì)胞趨化蛋白-1等)，這些細(xì)胞因子促進(jìn)肝細(xì)胞產(chǎn)生和釋放補(bǔ)體蛋白，當(dāng)與循環(huán)中的病原體抗原結(jié)合后，補(bǔ)體蛋白被裂解成激活的補(bǔ)體片段。Kupffer細(xì)胞結(jié)合補(bǔ)體受體(如補(bǔ)體受體1、補(bǔ)體受體3、補(bǔ)體受體4等)并吞噬結(jié)合了病原體抗原的補(bǔ)體復(fù)合物，進(jìn)一步加重嚴(yán)重反應(yīng)[42-43]。

3.3干擾素基因激活蛋白(stimulator of interferon gene,STING)與NAFLD進(jìn)展的相關(guān)性 STING是由379個(gè)氨基酸組成的具有4個(gè)跨膜區(qū)域的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)跨膜蛋白[45-47]。STING是經(jīng)典的天然免疫信號(hào)通路調(diào)節(jié)蛋白[45,48]。研究人員發(fā)現(xiàn)小鼠和人肝臟中STING的表達(dá)與NAFLD肝臟脂肪變和炎癥相關(guān)，即STING在NAFLD的進(jìn)展中起破壞作用[49-50]。從理論上來講，肝細(xì)胞和巨噬細(xì)胞這兩大類細(xì)胞會(huì)在NAFLD肝臟脂肪變和炎癥的發(fā)生、發(fā)展中起重要作用。因此，肝細(xì)胞和(或)巨噬細(xì)胞中的STING可能參與NAFLD的進(jìn)展。然而，多項(xiàng)研究發(fā)現(xiàn)人和小鼠的肝細(xì)胞不表達(dá)STING，STING僅在非實(shí)質(zhì)細(xì)胞表達(dá)，尤其是在巨噬細(xì)胞表達(dá)[50-52]。

在蛋氨酸/膽堿缺乏飲食和高脂飲食小鼠模型的研究發(fā)現(xiàn)中，巨噬細(xì)胞中STING表達(dá)對(duì)營養(yǎng)過剩狀態(tài)下NAFLD的進(jìn)展是必要的。證據(jù)有以下兩點(diǎn)：一方面敲除骨髓巨噬細(xì)胞中的STING，高脂飲食和蛋氨酸/膽堿缺乏飲食小鼠肝臟脂肪變和炎癥程度比STING未敲除的小鼠模型明顯減輕；另一方面僅敲除骨髓巨噬細(xì)胞的STING與STING完全敲除的小鼠模型相比，對(duì)NAFLD的損傷程度減輕相似[50,52]。除動(dòng)物實(shí)驗(yàn)的證據(jù)外，NAFLD患者中，肝臟巨噬細(xì)胞中STING的表達(dá)也與NAFLD的進(jìn)展相關(guān)[50]。這充分說明了天然免疫巨噬細(xì)胞中特異性的STING表達(dá)對(duì)NAFLD進(jìn)展的重要性。這一作用可能的機(jī)制是STING的激活顯著增加了巨噬細(xì)胞的促炎狀態(tài)，分泌的細(xì)胞因子反過來又增加肝細(xì)胞的脂肪沉積和促炎反應(yīng)，并增加肝星狀細(xì)胞的活性，進(jìn)而促進(jìn)肝臟脂肪變、炎癥甚至是纖維化的進(jìn)展[50]。

4 小 結(jié)

不同研究者對(duì)NAFLD發(fā)病機(jī)制的解釋多種多樣，“多重打擊”學(xué)說被認(rèn)為是比較符合NAFLD發(fā)病機(jī)制復(fù)雜性的解釋，這其中天然免疫又是參與NAFLD發(fā)生、發(fā)展不可或缺的部分。當(dāng)機(jī)體脂質(zhì)代謝平衡被打破時(shí)，過多脂類毒性物質(zhì)的產(chǎn)生以及雙鏈核酸的釋放可影響巨噬細(xì)胞的遷移、聚集和極化。而模式識(shí)別受體、補(bǔ)體激活和STING作為主要的巨噬細(xì)胞蛋白分子促進(jìn)NAFLD的發(fā)生、發(fā)展。這將為NAFLD細(xì)胞及分子生物學(xué)發(fā)病機(jī)制的研究提供新的方向。未來仍需探討天然免疫信號(hào)通路的臨床價(jià)值，并在具有不同臨床體征的NAFLD患者(如肥胖或不肥胖，是否合并代謝綜合征等)進(jìn)行驗(yàn)證，為研究NAFLD的發(fā)病機(jī)制、尋找新的診斷治療方案提供幫助。