閆 爍，薄彧坤，李景琦，張慧彬，王麗娟，張慧文,2*

（1. 包頭醫(yī)學(xué)院，內(nèi)蒙古 包頭 014040；2. 內(nèi)蒙古醫(yī)科大學(xué)，內(nèi)蒙古 呼和浩特 010110）

阿那日-4，又名四味石榴散或申布如西巴，在《四部醫(yī)典·后續(xù)部》、《金匱方釋》、《蒙醫(yī)成方選》和《高世格梅林方》等蒙醫(yī)著作中均有記載[1]，由君藥全石榴、臣藥肉桂、佐藥白豆蔻和使藥蓽茇組成，用于祛“巴達(dá)干協(xié)日”，對(duì)胃潰瘍、消化不良等均有較好療效[2-3]。有研究證實(shí)阿那日-4可提高胃漿中的NO含量，對(duì)小鼠乙醇及應(yīng)激反應(yīng)引起的胃潰瘍有一定治療作用，并對(duì)幽門結(jié)扎性胃潰瘍大鼠具有胃黏膜保護(hù)作用[4-5]。在臨床上，以阿那日-4為基礎(chǔ)形成了阿那日系列復(fù)方，如阿那日-5[6]、阿那日-8[7]和阿那日-14[8]等，目前在市場(chǎng)有售，有深入研究?jī)r(jià)值[9]。通過查閱文獻(xiàn)資料僅見報(bào)道阿那日-5、阿那日-8和阿那日-14中的胡椒堿和微量元素含量測(cè)定[10-12]，阿那日-4的活性成分和質(zhì)量控制方法研究尚屬空白，亟待完善。阿那日-4中全石榴的活性成分是鞣花酸，有良好的抗氧化和抗腫瘤活性[13-14]；肉桂中的桂皮醛有抗?jié)儭⒖鼓[瘤和加強(qiáng)胃腸道運(yùn)動(dòng)功能[15-16]；蓽茇的活性成分是胡椒堿，有抗胃潰瘍和免疫調(diào)節(jié)作用[17-18]。本實(shí)驗(yàn)建立了高效液相色譜法（HPLC）同時(shí)檢測(cè)蒙藥阿那日-4中鞣花酸、桂皮醛和胡椒堿含量的方法，為制定阿那日-4質(zhì)量控制方法提供參考。

1 儀器與試藥

Shimadzu高效液相色譜儀（日本島津，包括紫外可見光檢測(cè)器）；LabSolutions色譜工作站；Agilent ZORBAX Eclipse XDB-C18色譜柱（250 mm× 4.6 mm，5 μm）；Sartorius BSA224S-CW型電子天平（賽多利斯）；AS-10200型超聲清洗器（天津奧特賽恩斯）；SHZ-3型循環(huán)水真空泵（上海亞榮）；RE-52AA型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器（上海亞榮）。

阿那日-4及陰性樣品均由內(nèi)蒙古科技大學(xué)包頭醫(yī)學(xué)院藥學(xué)院藥劑教研室提供。對(duì)照品鞣花酸（批號(hào)：C10024692，上海麥克林）、桂皮醛（批號(hào)：J1619008，上海阿拉丁）、胡椒堿（批號(hào)：MUST-13080202，成都曼斯特）。甲醇、乙腈（HPLC級(jí)，美國(guó)Fisher），純凈水（娃哈哈），其他試劑為分析純。

2 方法與結(jié)果

2.1 溶液配制

2.1.1 混合對(duì)照品溶液 精密稱取鞣花酸、桂皮醛和胡椒堿對(duì)照品，分別加甲醇制成含鞣花酸5.0 mg/ml、桂皮醛3.0 mg/ml、胡椒堿3.0 mg/ml對(duì)照品儲(chǔ)備液。分別精密量取上述3種儲(chǔ)備液各0.5 ml，置入5 ml量瓶，用甲醇定容，搖勻，得含鞣花酸0.50 mg/ml、桂皮醛0.30 mg/ml、胡椒堿0.30 mg/ml混合對(duì)照品溶液。

2.1.2 供試品溶液 精密稱取阿那日-4約1 g，置入50 ml圓底燒瓶，加10 ml甲醇，超聲（功率300 W，頻率50 kHz）30 min，放至室溫，轉(zhuǎn)移至10 ml量瓶，用甲醇定容，搖勻后用0.22 μm微孔濾膜濾過，取續(xù)濾液，即得。

2.1.3 陰性供試溶液 按阿那日-4處方，分別制備缺石榴，缺肉桂，缺蓽茇的陰性樣品粉末1 g，按“2.1.2”項(xiàng)下方法，超聲提取30 min，上清用0.22 μm微孔濾膜過濾作為陰性樣品溶液。

2.2 色譜條件

Agilent ZORBAX Eclipse XDB-C18（250 mm ×4.6 mm，5 μm）色譜柱；流動(dòng)相：甲醇（A）-0.1 %磷酸水溶液（B），梯度洗脫（0 ～ 40 min，5 % A～100 % A）；流速1.0 ml/min；檢測(cè)波長(zhǎng)為271 nm；柱溫30 ℃；進(jìn)樣量20 μl。在上述色譜條件下，鞣花酸、桂皮醛和胡椒堿的分離度均大于1.5，理論板數(shù)均大于5 000。

2.3 專屬性試驗(yàn)

分別取混合對(duì)照品溶液、樣品溶液、各陰性供試溶液，按照“2.2”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測(cè)定。供試品溶液的色譜峰與混合對(duì)照品溶液相應(yīng)成分峰的保留時(shí)間一致，陰性供試溶液無相應(yīng)色譜峰。結(jié)果表明，樣品中其他成分對(duì)鞣花酸、桂皮醛和胡椒堿3種活性成分測(cè)定無干擾，方法專屬性良好。

圖1 專屬性試驗(yàn)色譜圖

2.4 線性關(guān)系考察

分別精密量取各對(duì)照品儲(chǔ)備液適量置入5 ml量瓶，加甲醇，定容，得混合對(duì)照品溶液，然后逐級(jí)稀釋得一系列混合對(duì)照品工作溶液，分別按“2.2”項(xiàng)下色譜條件測(cè)定。以峰面積-對(duì)照品質(zhì)量濃度進(jìn)行線性回歸，各對(duì)照品的線性方程、線性范圍和相關(guān)系數(shù)見表1。

表1 3種成分的線性方程、相關(guān)系數(shù)、線性范圍

2.5 精密度試驗(yàn)

取混合對(duì)照品溶液，按“2.2”項(xiàng)下色譜條件連續(xù)測(cè)定5次，記錄各對(duì)照品的峰面積，其RSD（n=5）分別為0.49 %，0.63 %，0.41 %，表明儀器精密度良好。

2.6 重復(fù)性試驗(yàn)

取同一批次阿那日-4（批號(hào)為20170501），按“2.1.2”項(xiàng)下方法平行制備5份樣品溶液，按“2.2”項(xiàng)下色譜條件測(cè)定，并分別計(jì)算含量；結(jié)果鞣花酸、桂皮醛和胡椒堿含量的平均值（n=5）分別為3.15，2.53，1.77 mg/g，RSD分別為2.86 %，2.17 %，1.22 %，表明該方法重復(fù)性良好。

2.7 穩(wěn)定性試驗(yàn)

取阿那日-4按“2.1.2”項(xiàng)下方法制備樣品溶液，室溫放置，按“2.2”項(xiàng)下色譜條件分別于0，4，8，12，24 h 進(jìn)樣，鞣花酸、桂皮醛和胡椒堿峰面積的RSD（n=5）分別為2.09 %，1.47 %，1.55%，表明樣品溶液在24 h 內(nèi)穩(wěn)定。

2.8 加樣回收率試驗(yàn)

取已知各成分含量的同一批次阿那日-4（批號(hào)為20170501）6份，每份0.5 g，精密稱定后每份分別加入5.0 mg/ml鞣花酸0.315 ml，3.0 mg/ml桂皮醛0.422 ml，3.0 mg/ml胡椒堿0.295 ml（各對(duì)照品與已知樣品中成分量比為1:1），甲醇補(bǔ)足至10 ml，按“2.1.2”項(xiàng)下方法制備，按“2.2”項(xiàng)下方法測(cè)定，用外標(biāo)法計(jì)算各相應(yīng)成分的含量，計(jì)算回收率及RSD。結(jié)果表明，鞣花酸、桂皮醛和胡椒堿回收率在98.55 % ～ 101.68 %，RSD均＜3 %，符合含量測(cè)定的準(zhǔn)確性要求。

表2 加樣回收率試驗(yàn)的結(jié)果（n=6）

2.9 樣品測(cè)定

取5批次阿那日-4，分別按“2.1.2”項(xiàng)下方法制備樣品溶液，樣品中3種待測(cè)成分的含量見表3。

表3 5批次樣品的3個(gè)成分含量測(cè)定（n=5）

3 討論

3.1 測(cè)定波長(zhǎng)的選擇

鞣花酸、桂皮醛和胡椒堿3種成分的紫外吸收光譜存在差異，最大吸收波長(zhǎng)分別是254，290 和343 nm，通過實(shí)驗(yàn)比較，鞣花酸、桂皮醛和胡椒堿均在271 nm 波長(zhǎng)處有較大吸收，且靈敏度高，故將檢測(cè)波長(zhǎng)定為271 nm。

3.2 流動(dòng)相的選擇

實(shí)驗(yàn)中對(duì)甲醇-水、甲醇-水（含0.1 %磷酸）、甲醇-水（含0.1 %甲酸）、乙腈-水、乙腈-水（含0.1 %磷酸）和乙腈-水（含0.1 %甲酸）流動(dòng)相系統(tǒng)進(jìn)行了考察，結(jié)果顯示以甲醇-水（含0.1 %磷酸）為流動(dòng)相時(shí)，供試品中鞣花酸、桂皮醛和胡椒堿分離效果較好。

3.3 供試品處理方法的選擇

實(shí)驗(yàn)中分別以純水、20 % 甲醇、40 % 甲醇、60 %甲醇、80 %甲醇水溶液和甲醇為溶劑，并分別采取超聲20，30，40 min和回流提取30，60，90 min處理供試品，結(jié)果以甲醇為溶劑超聲30 min，3種成分含量最高。