張芳芳，劉 飛，袁 超，高 亮，王 羽，凌沛學(xué),, 朱希強(qiáng)*

（1. 山東大學(xué)藥學(xué)院，山東 濟(jì)南 250012；2. 山東省藥學(xué)科學(xué)院 山東省生物藥物重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室 山東省多糖類藥物工程實(shí)驗(yàn)室 多糖類藥物發(fā)酵與精制國(guó)家地方聯(lián)合工程實(shí)驗(yàn)室 博士后科研工作站，山東 濟(jì)南 250101；3. 山東省商業(yè)集團(tuán)有限公司，山東 濟(jì)南 250014；4. 山東農(nóng)業(yè)工程學(xué)院 環(huán)境科學(xué)與工程學(xué)院，山東 濟(jì)南 250100）

冠突散囊菌（Eurotium cristatum），又稱金花菌，是散囊菌目發(fā)菌科散囊菌屬的一類真菌。該菌是茯磚茶生產(chǎn)加工過程中的優(yōu)勢(shì)菌，是形成茯磚茶獨(dú)特品質(zhì)的關(guān)鍵因素[1]。目前冠突散囊菌發(fā)花優(yōu)劣已作為判斷茯磚茶品質(zhì)的理化指標(biāo)，列于國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)。有研究表明冠突散囊菌有調(diào)節(jié)血脂血糖[2-4]，改善人體腸道功能[5-7]，抗氧化[8-9]作用。在茯磚茶發(fā)花過程中，冠突散囊菌大量生長(zhǎng)，其它微生物則受到抑制，提示冠突散囊菌在生長(zhǎng)過程中產(chǎn)生了具有抑菌活性的物質(zhì)。目前已證實(shí)冠突散囊菌發(fā)酵液有一定抑菌作用[10]，但對(duì)冠突散囊菌抑菌產(chǎn)物的性質(zhì)研究較少。本實(shí)驗(yàn)采用幾種常用有機(jī)溶劑提取發(fā)酵液中的抑菌活性物質(zhì)，從而確定發(fā)酵液中抑菌物質(zhì)的極性分布范圍，為天然抗菌素的開發(fā)和利用提供參考。

1 材料

1.1 菌種

冠突散囊菌分離自湖南惟楚福瑞達(dá)生物科技有限公司所產(chǎn)黑茶[11]。藤黃微球菌（Micrococcus luteus），大腸桿菌 （Escherichia coli），枯草芽孢桿菌（Bacillus subtilis），白色念珠菌（Candida albicans），白色鏈霉菌（Streptomyces albus）均由山東省藥學(xué)科學(xué)院生物技術(shù)中心提供。

1.2 培養(yǎng)基及試劑

冠突散囊菌種子培養(yǎng)基為YEPD培養(yǎng)基（g/L）：葡萄糖20.0，酵母粉10.0，胰蛋白胨20.0，固體培養(yǎng)基含1.5 %瓊脂粉；發(fā)酵培養(yǎng)基（g/L）：茶粉6.0，葡萄糖20.0，酵母粉5.0，NaH2PO4·2H2O 1.2，K2HPO4·3H2O 3.0，MgCl2·6H2O 0.1，ZnSO4·7H2O 0.01，pH值自然。

藤黃微球菌，大腸桿菌采用LB培養(yǎng)基（g/L）：酵母粉5.0, 胰蛋白胨10.0，NaCl 10.0；培養(yǎng)白色念珠菌使用YEPD培養(yǎng)基；培養(yǎng)白色鏈霉菌使用YMG培養(yǎng)基（g/L）：酵母粉4.0，麥芽提取物10.0，葡萄糖4.0，固體培養(yǎng)基含1.5 %瓊脂粉。以上培養(yǎng)基均115 ℃，30 min高壓滅菌后備用。無水乙醇、石油醚、乙酸乙酯與正丁醇為分析純?cè)噭?/p>

1.3 儀器

HPS-20恒溫生化培養(yǎng)箱（哈爾濱東聯(lián)）、Multitron通用型震蕩培養(yǎng)箱（伊浮森）、HD-1360潔凈工作臺(tái)（北京東聯(lián)哈爾）、RE-52旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器（上海亞榮）、SHZ-D循環(huán)水式真空泵（鞏義予華）、TW12恒溫水浴鍋（JULABO）、SCIENTZ-1 8 N 冷凍干燥機(jī)（寧波新芝）、S O RVA L L RC-6PLUS高速冷凍離心機(jī)（Thermo Fisher Scientific）。

2 方法

2.1 供試菌的培養(yǎng)

在相應(yīng)的固體培養(yǎng)基上劃線培養(yǎng)供試菌，挑取單菌落在液體培養(yǎng)基中振蕩培養(yǎng)，其中藤黃微球菌、大腸桿菌、枯草芽孢桿菌37 ℃過夜培養(yǎng)；白色念珠菌、白色鏈霉菌于30 ℃培養(yǎng)2～3 d，搖床轉(zhuǎn)速均為220 r/min。使用無菌水將菌液配制成106～107CFU/ml的菌懸液，4 ℃冰箱保存待用。

2.2 冠突散囊菌發(fā)酵產(chǎn)物制備

將甘油保存的冠突散囊菌菌種在YEPD固體培養(yǎng)基上劃線培養(yǎng)3 d，用刮刀刮取固體平板上的孢子于無菌水中混懸（108個(gè)/ml），按2 %接種到100 ml發(fā)酵培養(yǎng)基中，30 ℃，220 r/min搖床發(fā)酵培養(yǎng)5 d。將發(fā)酵液上清和菌絲體分離，發(fā)酵液上清加入乙醇至濃度為80 %，靜置過夜以除掉蛋白，多糖等雜質(zhì)，醇沉后上清濃縮至一定體積，依次用石油醚、乙酸乙酯、正丁醇提取，各提取3遍后合并提取液，減壓濃縮至浸膏，4 ℃保存待用。

2.3 抑菌活性檢測(cè)

在無菌條件下分別吸取100 μl活化后的供試菌菌懸液，加入100 ml熔化冷卻的培養(yǎng)基中，混合均勻后倒入一次性平板，在冰箱中活化2 h后，用無菌打孔器在各平板上打孔。將各待測(cè)液用DMSO配制成50 mg/ml的溶液，吸取50 μl無菌濾膜過濾的各樣品溶液置于培養(yǎng)基小孔中。待樣品完全擴(kuò)散入培養(yǎng)基后，將各平板倒置于恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。藤黃微球菌、大腸桿菌及枯草芽孢桿菌放置于37 ℃培養(yǎng)箱中過夜，白色鏈霉菌和白色念珠菌放置于30℃恒溫培養(yǎng)箱中48 h，以DMSO為陰性對(duì)照，測(cè)量各抑菌圈的大小，每組平行測(cè)定3次。

2.4 抑菌作用熱穩(wěn)定性

取適量乙酸乙酯提取物，平均分成4組，分別在40，60，80，100，121 ℃溫度下處理30 min，冷卻至室溫后，以未處理的乙酸乙酯相提取物為對(duì)照，以抑菌效果明顯的枯草芽孢桿菌為指示菌，用打孔法測(cè)定各處理液的抑菌活性，每個(gè)處理重復(fù)3次，將平板置于37 ℃過夜培養(yǎng)后測(cè)量抑菌圈直徑。

2.5 抑菌作用酸堿穩(wěn)定性

取適量乙酸乙酯提取物，采用1 mol/L 鹽酸溶液和1 mol/L 氫氧化鈉溶液分別調(diào)pH至2.0，3.0，4.0，5.0，6.0，7.0，8.0，9.0，10.0，11.0，放置2 h，以未處理的樣品為對(duì)照，以枯草芽孢桿菌為供試菌，進(jìn)行抑菌活性檢測(cè)，每個(gè)處理重復(fù)3次，將平板置于37 ℃過夜培養(yǎng)后測(cè)量抑菌圈直徑。

3 結(jié)果

3.1 抑菌活性

冠突散囊菌不同溶劑提取相對(duì)細(xì)菌、真菌、放線菌的抑菌作用見表1。

表1 發(fā)酵液各提取相對(duì)供試菌的抑菌圈直徑

結(jié)果表明，發(fā)酵液對(duì)枯草芽孢桿菌、白色鏈霉菌有較強(qiáng)的抑制作用，對(duì)大腸桿菌、白色念珠菌的抑制作用不明顯。發(fā)酵液各提取相的抑菌作用顯示，抑菌活性物質(zhì)主要集中在乙酸乙酯相中，證明抑菌活性物質(zhì)具有與乙酸乙酯相似的極性。

3.2 抑菌作用熱穩(wěn)定性

發(fā)酵液乙酸乙酯提取物不同溫度處理后的抑菌作用，見圖1。

圖1 溫度對(duì)抑菌作用的影響

結(jié)果表明，隨著溫度升高（25～121 ℃），抑菌作用略有下降。抑菌圈直徑的浮動(dòng)范圍為14.10～13.75 mm，可見抑菌物質(zhì)具有良好的熱穩(wěn)定性。

3.3 抑菌作用酸堿穩(wěn)定性

不同pH值下冠突散囊菌發(fā)酵液乙酸乙酯提取相的抑菌作用，見圖2。

圖2 酸堿處理對(duì)抑菌作用的影響

結(jié)果表明，抑菌作用在pH 4～8范圍內(nèi)浮動(dòng)較小，在過酸或過堿的條件下抑菌作用變大，通過調(diào)整溶劑的pH值檢測(cè)抑菌作用，結(jié)果表明，與溶劑本身的酸堿度有關(guān)，可見抑菌物質(zhì)有良好的酸堿穩(wěn)定性。

4 討論

本文研究了冠突散囊菌發(fā)酵液不同溶劑提取物對(duì)細(xì)菌、真菌、放線菌的抑菌作用，發(fā)現(xiàn)乙酸乙酯提取相對(duì)革蘭陽(yáng)性菌、放線菌的抑制作用明顯優(yōu)于其它提取相，表明抑菌物質(zhì)與乙酸乙酯有相似的極性，乙酸乙酯可有效地濃縮富集冠突散囊菌發(fā)酵液中的抑菌活性物質(zhì)。研究還表明，抑菌物質(zhì)有良好的熱穩(wěn)定性和酸堿穩(wěn)定性，這是分離純化冠突散囊菌發(fā)酵液中抑菌活性代謝產(chǎn)物的前提條件，有利于冠突散囊菌功能產(chǎn)品的應(yīng)用性開發(fā)。