張曉元，郝榮華，劉 飛,2,3*，袁丹丹，陳 勉，凌沛學(xué),2,3

（1. 山東省藥學(xué)科學(xué)院 山東省生物藥物重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室 山東省多糖類藥物工程實(shí)驗(yàn)室 多糖類藥物發(fā)酵與精制國家地方聯(lián)合工程實(shí)驗(yàn)室 博士后科研工作站，山東 濟(jì)南 250101；2. 山東大學(xué) 藥學(xué)院，山東 濟(jì)南 250012；3. 山東福瑞達(dá)醫(yī)藥集團(tuán)有限公司，山東 濟(jì)南 250101）

海藻糖合成酶（trehalose synthase）通過分子內(nèi)轉(zhuǎn)苷作用，可催化麥芽糖中兩個葡萄糖分子α,α-1,4 糖苷鍵轉(zhuǎn)變成葡萄糖α,α-1, 1 糖苷鍵，從而生成海藻糖。已報道利用生物酶法合成海藻糖存在TPS/TPP、TS、TreY/TreZ、TreP、TreT等5種途徑[1-2]。其中海藻糖合成酶途徑（TS途徑，又稱Tres途徑）僅需一種酶一步酶反應(yīng)，在海藻糖的工業(yè)化生產(chǎn)中，相比傳統(tǒng)酵母細(xì)胞提取法及其他生物合成途徑具有底物廉價、工藝簡單、易于調(diào)控等顯著優(yōu)點(diǎn)，是生物酶法工業(yè)化合成海藻糖的研究熱點(diǎn)[3-4]。

來源于灰色鏈霉菌Streptomyces griseus subsp.Griseus的海藻糖合成酶轉(zhuǎn)化效率高、反應(yīng)速度快，葡萄糖副產(chǎn)物少[5]。但該酶在天然的灰色鏈霉菌中屬胞內(nèi)酶，表達(dá)量極低，需濃縮上千倍才能檢測到海藻糖合成酶活性[5]。大腸桿菌（Escherichia coli）繁殖迅速、培養(yǎng)簡單、遺傳背景清楚、表達(dá)系統(tǒng)成熟，利用基因工程法構(gòu)建大腸桿菌工程菌株來表達(dá)灰色鏈霉菌海藻糖合成酶，有望解決這一問題。外源蛋白在大腸桿菌中的表達(dá)差異，除受表達(dá)條件的直觀影響外，外源基因自身特性的影響也至關(guān)重要。其中密碼子的選擇是左右表達(dá)量的參數(shù)之一, 基因表達(dá)水平高低與嗜好密碼子的使用程度之間存在較強(qiáng)的相關(guān)性。灰色鏈霉菌密碼子偏好性與大腸桿菌存在著很大差別，本研究旨在不改變灰色鏈霉菌海藻糖合成酶氨基酸組成的前提下，將編碼灰色鏈霉菌TreS蛋白的密碼子優(yōu)化為大腸桿菌的偏愛密碼子，以減少翻譯過程中產(chǎn)生的瓶頸效應(yīng)，實(shí)現(xiàn)外源蛋白在大腸桿菌體內(nèi)表達(dá)量的提高。

1 材料與儀器

1.1 儀器

Multitron通用型振蕩培養(yǎng)箱（伊孚森生物技術(shù)公司）；HPS-250生化培養(yǎng)箱（哈爾濱東聯(lián)）；GelDocXR+全自動凝膠成像系統(tǒng)（Bio-rad）；Power Pac BasicTM型蛋白電泳儀（Bio-rad）；生物樣品均質(zhì)器（Bertin）；1200型高效液相色譜儀（Agilent）。

1.2 質(zhì)粒與菌株

質(zhì)粒pET-26b(+)作為表達(dá)載體，大腸桿菌E.coliBL21（DE3）作為表達(dá)宿主，均為本實(shí)驗(yàn)室保藏。

1.3 培養(yǎng)基

LB種子培養(yǎng)基（g/L）：蛋白胨 10，酵母粉5，氯化鈉10，pH 7.0，固體培養(yǎng)基含1.5 %瓊脂粉。

液體發(fā)酵培養(yǎng)基（g/L）：蛋白胨12，酵母粉24，甘油4，KH2PO42.31，K2HPO412.54，pH 7.5。

1.4 試劑

限制性內(nèi)切酶，T4 DNA連接酶等（NEB）；低分子量標(biāo)準(zhǔn)蛋白（Fermentas）；質(zhì)粒小提試劑盒，DNA純化回收試劑盒，瓊脂糖凝膠回收試劑盒等（Tiangen）；其他化學(xué)試劑均為國產(chǎn)分析純。

2 方法

2.1 海藻糖合成酶基因密碼子優(yōu)化

根據(jù)http://www.kazusa.or.jp/codon、CodonW 1.4.2與GenScript Rare Codon Analysis Tool對編碼灰色鏈霉菌海藻糖合成酶基因序列（Genbank：HQ915641.1）密碼子組成、GC含量組成、密碼子使用頻率等進(jìn)行分析，發(fā)現(xiàn)灰色鏈霉菌海藻糖合成酶基因存在多處大腸桿菌稀有密碼子。利用密碼子優(yōu)化軟件Jcat等進(jìn)行序列優(yōu)化，優(yōu)化前提：不改變氨基酸序列，密碼子偏好性參考大腸桿菌K12 MG1655。

2.2 大腸桿菌表達(dá)載體構(gòu)建、轉(zhuǎn)化及篩選

優(yōu)化前、優(yōu)化后海藻糖合成酶基因序列tres、tres1由濟(jì)南博尚生物科技有限公司合成，序列首尾分別設(shè)計引入NcoI、XhoI酶切位點(diǎn)。NcoI/XhoI雙酶切tres、tres1全基因序列與同樣處理過的pET-26b(+)質(zhì)粒在T4 DNA 連接酶作用下進(jìn)行連接，得重組質(zhì)粒載體pET-26b(+)-tres、pET-26b(+)-tres1。構(gòu)建好的重組質(zhì)粒采用CaCl2法轉(zhuǎn)化大腸桿菌E. coliBL21(DE3)感受態(tài)細(xì)胞，37 ℃，LB平板培養(yǎng)18～24 h，直至長出轉(zhuǎn)化子。挑取單菌落接種于含50 μg/ml卡那霉素的LB液體培養(yǎng)基中，37 ℃，220 r/min培養(yǎng)過夜，提取質(zhì)粒雙酶酶切及序列測定驗(yàn)證讀碼框正確性。

2.3 海藻糖合成酶基因工程菌誘導(dǎo)表達(dá)

將經(jīng)電泳及測序鑒定正確的陽性轉(zhuǎn)化子，過夜培養(yǎng)活化后，按1 %的接種量轉(zhuǎn)接于含50 μg/ml卡那霉素的LB 液體培養(yǎng)基中培養(yǎng)，37 ℃、220 r/min振蕩培養(yǎng)至OD600=1.0時，加入異丙基硫代半乳糖苷（IPTG）至終濃度1 mmol/L，25 ℃、每2 h取1.5 ml培養(yǎng)液至18 h，所取樣品采用生物樣品均質(zhì)器Precellys 24均質(zhì)破碎，均質(zhì)速度5500 r/min，3個循環(huán)，每個循環(huán)運(yùn)行時間為15 s，循環(huán)間隔10 s。均質(zhì)液12 000 r/min離心后上清即為粗酶液。

2.4 海藻糖合成酶的酶活性測定

將不同時間取樣制備的粗酶液進(jìn)行酶活性測定，取200 μl酶液，加入200 μl 10 %麥芽糖溶液（0.1 mol/L pH 6.5磷酸鹽緩沖液配制），24 ℃水浴反應(yīng)1 h后，沸水浴10 min終止反應(yīng)。酶反應(yīng)產(chǎn)物進(jìn)行高效液相色譜（HPLC）分析。HPLC條件：分離柱ZORBAX NH2，4.6 mm×250 mm，5 μm，流動相為乙腈:水=75:25，柱溫：50 ℃，流速 1.0 ml/min。海藻糖合酶酶活力1 U定義：24 ℃、pH 6.5反應(yīng)條件下，以10 % 麥芽糖溶液為底物，每1 min產(chǎn)生1 μmoL海藻糖所需酶量。

2.5 蛋白質(zhì)質(zhì)量分?jǐn)?shù)的測定

以牛血清蛋白為標(biāo)準(zhǔn)蛋白，采用Bradford法[6]測定粗酶液的蛋白質(zhì)含量。

2.6 海藻糖合成酶的SDS-PAGE鑒定

取發(fā)酵粗酶液，加入適量5×SDS上樣緩沖液，沸水浴處理10 min，4 ℃，12 000 r/min離心5 min，取10 μl進(jìn)行SDS-PAGE電泳檢測。

3 結(jié)果與分析

3.1 密碼子優(yōu)化前后序列相關(guān)參數(shù)分析

灰色鏈霉菌的海藻糖合成酶tres基因開放閱讀框（ORF）共計1707 bp，因灰色鏈霉菌與大腸桿菌存在物種間差異，對照圖1E. coliK-12 MG1655密碼子使用情況，縱坐標(biāo)Wij代表編碼第i個氨基酸的第j個同義密碼子的“相對適應(yīng)性”，即該同義密碼子的觀察值除以編碼該氨基酸的同義密碼子的最大值，其值在0～1之間，越高則表明該基因的密碼子使用偏好性越強(qiáng)。tres基因所用三聯(lián)密碼子存在大腸桿菌稀有密碼子或低頻使用密碼子，如CCC（14個）、CGG（12個）、GGG（8個）、GGA（2個）、AGG（1個）、CGA（1個）等（見表1），這些密碼子的存在會影響tres基因在大腸桿菌異源表達(dá)水平。經(jīng)Jcat密碼子優(yōu)化軟件優(yōu)化得基因序列tres1，tres1與tres基因密碼子優(yōu)化前后的核甘酸序列對比分析結(jié)果見圖2。由圖2可見，優(yōu)化后的tres1基因序列共有268 bp堿基進(jìn)行大腸桿菌適應(yīng)性變化，但所編碼的氨基酸的序列無任何改變。

表1 海藻糖合成酶tres基因優(yōu)化前后編碼密碼子數(shù)量統(tǒng)計表

圖1 E. coli K-12 MG1655密碼子使用情況

圖2 海藻糖合成酶基因tres和tres1的核苷酸序列

GC含量是鳥嘌呤和胞嘧啶所占DNA 4種堿基的比率。GC含量隨DNA來源物種不同而異。GC含量高低影響DNA的密度，GC含量高，相應(yīng)DNA密度也高，加熱及加堿均不易使之變性，GC含量理想的比例范圍是30 %～70 %[7]。鏈霉菌基因組GC含量整體較高[8]，經(jīng)計算，來源于灰色鏈霉菌tres基因的GC含量約為65.8 %，高于大腸桿菌平均50 %左右的GC含量。序列優(yōu)化后，如圖3所示：優(yōu)化后的tres1基因序列平均GC含量降低至54.4 %，更接近大腸桿菌表達(dá)基因的GC百分比，有利于基因高效表達(dá)。

圖3 優(yōu)化前后基因序列GC含量分布曲線圖

密碼子適應(yīng)指數(shù)（codon adaption index，CAI）反映基因編碼區(qū)所有同義密碼子中某一指定密碼子的使用頻率與最優(yōu)密碼子頻率相符合的程度。取值范圍在0～1之間，表達(dá)量較高的基因常具有較高的CAI值，表達(dá)量較低的基因則具有較低的CAI值。CAI已廣泛應(yīng)用于基因表達(dá)水平的預(yù)測[9-11]。經(jīng)優(yōu)化軟件測算，基因tres1經(jīng)合理優(yōu)化后，密碼子適應(yīng)指數(shù)CAI值由0.37提升至0.97，符合GenScript's OptimumGeneTM密碼子優(yōu)化軟件所建議的高表達(dá)優(yōu)化CAI 0.8～1.0取值范圍。密碼子使用頻率分布（condon frequency distribution，CFD）見圖4。由圖4可見，優(yōu)化前基因序列出現(xiàn)使用頻率小于30 %的密碼子，存在阻礙基因高效表達(dá)的可能性，優(yōu)化后基因多數(shù)密碼子的使用頻率在90 %以上，未發(fā)現(xiàn)有使用頻率小于50 %的密碼子，有利于基因高效表達(dá)。

圖4 密碼子優(yōu)化前后密碼子使用頻率分布情況

3.2 tres/tres1基因在大腸桿菌中的表達(dá)及SDSPAGE分析

采用CaCl2法進(jìn)行了tres、tres1基因的大腸桿菌轉(zhuǎn)化，測序鑒定篩選出正確的陽性轉(zhuǎn)化子進(jìn)行搖瓶誘導(dǎo)發(fā)酵。pET-26b(+)載體設(shè)計含有pelB信號肽，蛋白表達(dá)時可將目的基因定位于細(xì)胞周質(zhì)。因此，含質(zhì)粒pET-26b(+)-tres、pET-26b(+)-tres1基因工程菌株在加入IPTG誘導(dǎo)后每2 h所取發(fā)酵液，均質(zhì)破碎，取上清做表達(dá)產(chǎn)物分析。SDS-PAGE分析結(jié)果見圖5。由表5可見，tres、tres1氨基酸序列編碼相同的568個氨基酸，相對分子質(zhì)量（Mr）理論值約66×103。有圖5可見，含密碼子優(yōu)化的tres1大腸桿菌基因工程菌株Mr66×103的條帶明顯濃于tres基因工程菌株，目的蛋白表達(dá)量高。

圖5 Tres1、Tres蛋白表達(dá)SDS-PAGE電泳圖

3.3 基因優(yōu)化前后大腸桿菌工程菌的產(chǎn)酶比較

灰色鏈霉菌海藻糖合成酶在轉(zhuǎn)化麥芽糖生成海藻糖過程中會產(chǎn)生少量葡萄糖副產(chǎn)物，產(chǎn)生的海藻糖與未反應(yīng)的麥芽糖分子量大小一致，HPLC不易區(qū)分。本實(shí)驗(yàn)優(yōu)選色譜柱 ZORBAX NH2（4.6 mm×250 mm，5 μm），流動相采用乙腈:水=75:25，柱溫 50 ℃，流速 1.0 ml/min。該條件下海藻糖與麥芽糖具備了較好的區(qū)分度，且出峰時間短（＜10 min），易于海藻糖的快速檢測（見圖6）。

圖6 葡萄糖、麥芽糖、海藻糖 HPLC圖譜

含質(zhì)粒pET-26b(+)-tres、pET-26b(+)-tres1基因工程菌株在同樣條件下采用IPTG誘導(dǎo)后2，4，6，8，10，12，14 ，16 和18 h 分別取樣進(jìn)行酶活力的測定，比較結(jié)果見圖7，由圖7可見在誘導(dǎo)反應(yīng)開始的2 h內(nèi)，兩者的酶活力幾乎都不存在。2 h后海藻糖合成酶均開始表達(dá)，優(yōu)化后菌株海藻糖合成酶活性在誘導(dǎo)4 h后呈明顯增加趨勢，12 h時即可達(dá)到未優(yōu)化菌株18 h發(fā)酵水平。優(yōu)化菌株18 h取樣測定酶活性為48.9 U/ml，比未優(yōu)化對照菌株酶活性30.5U/ml提高了60.3 %。經(jīng)蛋白含量測定，計算海藻糖合成酶蛋白比活性不存在顯著性差異，這與優(yōu)化前后氨基酸序列無改變直接相關(guān)，單位時間內(nèi)產(chǎn)酶量的增加，推測與優(yōu)化后的tres1翻譯效率提高關(guān)系密切。

圖7 基因優(yōu)化前后產(chǎn)酶酶活性曲線圖

4 討論

天然蛋白質(zhì)的氨基酸可由1～6個核苷酸三聯(lián)密碼子編碼，稱為同義密碼子。不同物種其基因在同義密碼子的使用上存在偏愛性。密碼子偏愛性的不匹配是外源基因在宿主系統(tǒng)表達(dá)不好的主要原因之一，利用生物信息學(xué)方法統(tǒng)計物種間不同密碼子使用頻率，把不匹配的非偏愛性密碼子加以定點(diǎn)突變，可改變外源基因的密碼子偏愛性使之和宿主系統(tǒng)更加匹配，從而得到較高產(chǎn)量的表達(dá)產(chǎn)物。

已全基因組測序的鏈霉菌編碼基因普遍具有較高GC含量[8]。本研究來源自灰色鏈霉菌的海藻糖合成酶基因GC含量就高達(dá)65.8 %，三聯(lián)密碼子第三位簡并密碼子更傾向于GC，CodonW軟件分析GC3s（密碼子第三位G或C）出現(xiàn)頻率0.955很好驗(yàn)證這一特點(diǎn)。序列合理優(yōu)化后，tres基因GC含量下降至54.5 %，GC3s出現(xiàn)頻率降低至0.592，密碼子適應(yīng)指數(shù)CAI值由0.37提升至0.97，更接近于大腸桿菌基因編碼特點(diǎn)，基因工程菌株表達(dá)海藻糖合成酶酶活性也因此提高了60.3 %。該密碼子優(yōu)化方法為不同物種來源的外源蛋白在大腸桿菌高效表達(dá)提供理論指導(dǎo)。然而，外源基因表達(dá)水平不僅僅與密碼子偏愛性直接相關(guān)，還取決于基因表達(dá)啟動子終止子強(qiáng)度、識別密碼子的tRNA豐度、序列二級結(jié)構(gòu)復(fù)雜程度等。因此，開發(fā)一種基于DNA序列組成方面的多尺度、系統(tǒng)性、綜合性的生物信息學(xué)分析方法對實(shí)現(xiàn)外源基因在不同物種間高效表達(dá)至關(guān)重要。