余曉穎，田園，張國利，吳廣謀，劉雨玲，李澤鴻，岳玉環(huán)*

(1.吉林農(nóng)業(yè)大學生命科學學院，長春130118；2.軍事醫(yī)學研究院軍事獸醫(yī)研究所，長春130122)

犬流感病毒(Canine influenza virus，CIV)屬于正黏病毒科甲型流感病毒屬，是一類新近發(fā)現(xiàn)能感染犬的流感病毒。CIV在犬間傳播迅速，能引起患犬咳嗽、流涕和發(fā)熱等呼吸系統(tǒng)疾病[1]。甲型流感病毒又根據(jù)HA分為17種亞型，NA分為9種亞型，能組成153個血清型甲型流感病毒。流感病毒基因組約為13 kb，含有8個基因節(jié)段，分別編碼血凝素HA，神經(jīng)氨酸酶NA,M1基質(zhì)蛋白，M2離子通道蛋白，NP核蛋白，NS非結構蛋白及RNA聚合酶復合體(PB1蛋白、PB2蛋白、PA蛋白)[2]。近十年來流感病毒感染犬類病例的相關報道迅速增多，這些病毒不僅威脅到了犬的健康，同樣也給公共安全帶來了威脅。2004年，美國佛羅里達某賽犬場的賽犬出現(xiàn)體溫升高、咳嗽、噴嚏為主的癥狀，最后因出血性肺炎死亡；2005年，美國加利福尼亞該病卷土重來，在加利福尼亞等11個州迅速蔓延，導致20個賽犬場大量賽犬發(fā)病，同時引起佛羅里達州的許多寵物犬感染；經(jīng)鑒別證實該病原為亞型H3N8流感病毒，具有馬流感病毒特征，并發(fā)生了變異。研究人員認為，該病最初的流行是犬與馬的密切接觸導致了病毒的傳入和感染，并把該病稱之為“犬流感”[3]。2006年，在中國南方出現(xiàn)了另一類犬流感，犬對H3N2亞型流感病毒的感染[4]。2007年，韓國報道了A型H3N2亞型流感病毒引起的犬呼吸道疾病。研究發(fā)現(xiàn)該病毒可以在犬之間進行直接傳播，同時也表明H3N2 亞型犬流感病毒已經(jīng)進入到韓國和我國的犬群中[5]。

M1和M2蛋白是基質(zhì)蛋白，是一種非糖基化蛋白，是由甲、乙型流感病毒的7RNA節(jié)段、丙型流感病毒的6RNA節(jié)段編碼[6]。非糖基化蛋白存在于囊膜蛋白的內(nèi)側，也稱為內(nèi)膜蛋白，是病毒粒子的主要蛋白。M1由252個氨基酸殘基組成，分子量約28 kD,它是病毒的主要結構蛋白，占流感病毒蛋白總量的40%。M1蛋白在病毒感染細胞的后期才被合成,能與病毒核糖核蛋白體(vRNPs)相互作用，抑制病毒mRNA的轉(zhuǎn)錄,并協(xié)助vRNPs從細胞核轉(zhuǎn)運到細胞漿[7]。M1蛋白與流感病毒復制有關，能與HA及NA蛋白相互作用，并參與病毒子粒的裝配及釋放[8]。

M1蛋白在流感病毒中高度保守，是病毒粒子中最豐富和最保守的蛋白質(zhì)，每個病毒粒子的分子數(shù)量至少是HA蛋白的兩倍，基于保守抗原制備的抗體可以為多種亞型流感提供廣譜保護[9]，為此本研究擬制備H3N2型犬流感病毒M1蛋白純品，為進一步制備通用型抗犬流感病毒抗體提供純品抗原。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 病毒基因、質(zhì)粒和菌種 H3N2犬流感病毒全基因組cDNA由軍事醫(yī)學研究院軍事獸醫(yī)研究所生物技術應用與基因工程藥物實驗室保存；pET-SUMO質(zhì)粒、大腸桿菌One Shot?Mach1TM-T1R感受態(tài)細胞和E.coliBL21(DE3)購于美國英杰生命技術有限公司。

1.1.2 主要試劑 引物由長春庫美生物公司合成；Ex TaqDNA聚合酶和T4 DNA連接酶購于寶生物工程(大連)有限公司；質(zhì)粒提取試劑盒、DNA凝膠回收試劑盒、BCA蛋白濃度試劑盒、HRP標記的抗His標簽的鼠的單克隆抗體和HRP標記的羊抗屬IgG均購于北京康為世紀生物科技有限公司；卡納霉素及氨芐西林購于寶泰克生物技術有限公司；甘氨酸、丙烯酰胺、誘導劑IPTG及SDS購于Sigma公司；CuSO4化學試劑為國產(chǎn)分析純購于北京化工廠；SP-Sepharose Fast Flow 層析填料和Chelating Sepharose Fast Flow層析填料購于美國GE Healthcare。

1.1.3 實驗動物 昆明鼠，6周齡，平均體重21 g，雄性，購于長春生物制品研究所有限責任公司。

2 方 法

2.1 引物設計與合成 根據(jù)GenBank中H3N2犬流感病毒M1基因序列(JX414245.1)設計引物。上游引物P1：5'-ATGAGTCTTCTAACCGAGGTC-3'；下游引物P2：5'-CCGGAATTCTTATCACTTAAATC￣GCTGCATCTGCACT-3'(下劃線部分為EcoR I酶切位點)。引物由長春庫美生物公司合成。

2.2 M1基因的擴增 以H3N2型犬流感病毒全基因組cDNA為模板，PCR擴增M1基因序列。預期擴增產(chǎn)物長771 bp。PCR擴增產(chǎn)物經(jīng)1.3%瓊脂糖凝膠電泳、紫外凝膠成像系統(tǒng)下觀察。切下特異性的片段，用DNA瓊脂糖凝膠回收試劑盒回收目的片段。

2.3 重組表達質(zhì)粒的構建 將回收的M1基因片段連接至pET-SUMO質(zhì)粒上，連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化至大腸桿菌One Shot?Mach1TM-T1R 感受態(tài)細胞，搖菌鑒定，用質(zhì)粒小提試劑盒提取重組質(zhì)粒，然后進行PCR鑒定，正確的陽性質(zhì)粒命名為pET-SUMO-M1，并送長春庫美生物公司測序。利用DNAssist軟件分析測序結果。

2.4 目的蛋白誘導表達及可溶性分析 將測序正確的pET-SUMO-M1質(zhì)粒轉(zhuǎn)化至大腸桿菌BL21(DE3)中，以IPTG為誘導劑在37 ℃條件下進行誘導表達，另設立不加入IPTG作為對照，離心收集菌液，裂解液裂解，超聲處理，分離上清及沉淀，用15% SDS-PAGE凝膠電泳分析目的蛋白的表達情況。

2.5 表達產(chǎn)物的初步純化 菌體超聲后用10%硫酸銨沉淀和45%硫酸銨沉淀進行粗純。之后用SP-Sepharose Fast Flow陽離子交換層析柱進行初步純化。再用Western blot 鑒定初步純化的蛋白產(chǎn)物。

2.6 目的蛋白的精純 采用(Cu2+)-Chelating Sepharose Fast Flow 層析柱對SP-Sepharose Fast Flow陽離子交換層析柱初步純化的樣品進一步的純化，然后用SUMO蛋白酶酶切純化產(chǎn)品，用SUMO蛋白酶酶切金屬螯和層析純化后的目的蛋白，酶切條件為30 ℃ 6 h。將融合蛋白中的SUMO蛋白與M1蛋白分開，再通過(Cu2+)-Chelating Sepharose Fast Flow層析柱去掉溶液中的SUMO蛋白成分。最后通過透析法以及蛋白濃縮法提高蛋白的濃度，并使目的蛋白處在1×PBS(pH7.2)緩沖液中保存。利用薄層掃描法分析純化后蛋白的純度以及使用BCA蛋白濃度試劑盒測得蛋白的濃度。

2.7 M1蛋白多抗的制備 因本實驗中純化出的目的蛋白始終為4條帶，為驗證這4條帶是否均為目的蛋白，特制備鼠抗M1蛋白多抗對其進行檢驗。用聚丙烯酰胺凝膠電泳分離目的蛋白，將準確的相對分子質(zhì)量為28 kD的M1蛋白凝膠條帶取出，免疫小鼠，制備多抗。將M1蛋白純品與氫氧化鋁佐劑按9∶1混合，經(jīng)皮下注射昆明鼠，50 μg/只，首次免疫前通過尾部采血分離血清，間隔兩周免疫1次，共免疫3次，并在免疫后第14、21、28和42天尾部采血分離血清。根據(jù)間接ELISA法測抗體效價，以高于對照組平均值的兩倍以上的最終稀釋倍數(shù)為檢測樣品的效價。

2.8 目的蛋白的鑒定 取目的蛋白進行12% SDS-PAGE電泳分離，利用半干轉(zhuǎn)移法將目的蛋白和蛋白Marker轉(zhuǎn)移到PVDF膜上；然后將PVDF膜浸泡在含3% Milk的PBS緩沖液中，在4 ℃條件下封閉10 h，用PBS洗滌3次；一抗用M1蛋白(28 kD)免疫小鼠制備的抗體(1∶1000稀釋)，37 ℃孵育2 h，用PBST洗滌3次，二抗用HRP標記的羊抗鼠抗體(1∶3000稀釋)孵育，37 ℃孵育2 h，用TBST洗滌3次，最后用DAB進行顯色并分析。

3 結果與分析

3.1 M1基因的擴增 以H3N2犬流感病毒全基因組cDNA為模板，進行PCR擴增，擴增產(chǎn)物經(jīng)1.3%瓊脂糖凝膠電泳分析，條帶大小為771 bp，與預期結果相符(圖1)。

3.2 重組表達質(zhì)粒pET-SUMO-M1的構建及PCR鑒定 通過1.3%瓊脂糖凝膠電泳分析結果顯示，被插入的片段大小為771 bp，大小與預期相符(圖2)。重組質(zhì)粒pET-SUMO-M1測序結果用DNAssist軟件分析顯示，其插入外源序列與GenBank中H3N2犬流感病毒M1基因序列一致，M1目的基因片段以正確的方向插入到pET-SUMO質(zhì)粒中，重組表達質(zhì)粒構建成功。

M: DL2000 DNA Marker；1: M1基因PCR產(chǎn)物；2：陰性對照M: DL2000 DNA Marker；1: M1 gene PCR product；2：Negative control圖1 犬流感病毒M1蛋白基因擴增結果Fig 1 Canine influenza virus M1 protein gene amplification results

M: DL2000 DNA Marker；1:PET-SUMO-M1重組質(zhì)粒PCR產(chǎn)物M: DL2000 DNA Marker；1:PET-SUMO-M1 recombinant plasmid PCR product圖2 PET-SUMO-M1重組質(zhì)粒PCR鑒定結果Fig 2 PCR identification results of PET-SUMO-M1 recombinant plasmid

3.3 目的蛋白誘導表達及可溶性分析 表達的融合蛋白SUMO-M1經(jīng)15%SDS-PAGE分析，可清晰看到融合蛋白大量表達，相對分子質(zhì)量為41 kD(圖3)。工程菌超聲處理后，上清液和沉淀經(jīng)15% SDS-PAGE分析，表達的融合蛋白主要在上清液中，因此融合蛋白以可溶形式表達(圖4)，薄層掃描顯示表達量占菌體總蛋白的25.6%。

M:蛋白質(zhì)Marker；1:誘導的工程菌；2:未誘導的工程菌M:Protein Marker；1:Induced engineering bacteria；2:Uninduced engineering bacteria圖3 工程菌誘導表達結果SDS-PAGE分析Fig 3 SDS-PAGE analysis of induced expression of engineering bacteria

M:蛋白質(zhì)Marker；1：超聲后上清液；2:超聲后沉淀M:Protein Marker；1：Supernatant after ultrasonic treatment；2:Post-ultrasonic precipitation圖4 工程菌超聲破碎后SDS-PAGE分析Fig 4 SDS-PAGE analysis of engineering bacteria after ultrasonication

3.4 重組融合蛋白的純化和Western blot分析 誘導后的工程菌超聲處理，上清通過硫酸銨沉淀法粗純，重組融合蛋白主要在45%硫酸銨沉淀中，經(jīng)SP-Sepharose Fast Flow 陽離子交換層析柱，線性洗脫收集蛋白峰經(jīng)15% SDS-PAGE分析，重組融合蛋白主要在21%B～100%B洗脫樣品中，蛋白的相對分子質(zhì)量為41 kD，大小與預期相符(圖5)，但純化出的重組融合蛋白41 kD條帶下面緊連著3條大小不同的條帶，由于重組融合蛋白N端帶有6×His標簽，用Western blot分析鑒定顯示，純化的重組融合蛋白能夠被抗His標簽的鼠的單克隆抗體識別(圖6)，表明重組融合蛋白獲得正確表達，具有良好的免疫原性，且四條條帶均可發(fā)生免疫反應。

3.5 目的蛋白的純化 取SP陽離子交換層析柱純化出的重組融合蛋白，經(jīng)(Cu2+)-Chelating Sepharose Fast Flow層析柱第二步精純除雜蛋白，15% SDS-PAGE分析顯示，重組融合蛋白在洗脫液B(40 mmol/LPB、0.3 mol/L NaCl、150 mmol/L咪唑，pH6.6)中(圖7)。重組融合蛋白經(jīng)SUMO蛋白酶酶切后，通過第三步(Cu2+)-Chelating Sepharose Fast Flow層析柱純化，使目的蛋白和SUMO蛋白進行分離，經(jīng)12% SDS-PAGE分析(圖8)，目的蛋白都在流穿液中，成功達到分離目的，獲取高純度的目的蛋白，蛋白純度為94.6%，最終獲取的目的蛋白濃度為0.541 mg/mL。

1：45%硫酸銨沉淀；M:蛋白Marker；2：流穿；3：流穿；4：21%B～74%B洗脫峰；5：75%B～100%B洗脫峰；6: 0.5mol/L NaCl 洗脫峰；7：2mol/L NaCl洗脫峰；8：0.5 mol/L NaOH洗脫峰1：45% ammonium sulfate precipitation；M:Protein Marker；2：Flow through liquid；3：Flow through liquid；4：21% B～74% B eluting peak；5：75%B～100%B eluting peak；6: 0.5mol/L NaCl eluting peak；7：2mol/L NaCl eluting peak；8：0.5 mol/L NaOH eluting peak圖5 SP陽離子交換層析柱純化結果Fig 5 SP cation exchange chromatography column purification results

M:蛋白Marker；1：SP 21%B～74%B洗脫樣品；2：SP 75%B～100%B洗脫樣品；3：SP 21%B～74%B洗脫樣品免疫印跡；4：SP 75%B～100%B洗脫樣品免疫印跡M:Protein Marker；1：SP 21%B ～ 74%B elution sample；2：SP 75%B～100%B elution sample；3：SP 21%B～74%B elution sample western blot；4：SP 75%B～100%B elution sample western blot圖6 Western blot 結果Fig 6 Western blot results

1：SP純化后樣品；2：流穿；M:蛋白Marker；3：50 mmol/L咪唑洗脫峰；4：150 mmol/L咪唑洗脫峰；5:150 mmol/L咪唑洗脫峰；6：0.1 moL/L NaOH洗脫峰1：SP purified sample；2：Flow through liquid；M:Protein Marker；3：50 mmol/L imidazole elution peak；4：150 mmol/L imidazole elution peak；5:150 mmol/L imidazole elution peak；6：0.1 moL/L NaOH elution peak圖7 (Cu2+)金屬螯合層析柱純化結果Fig 7 (Cu2+) metal chelate chromatography column purification results

3.6 M1蛋白多抗的制備 經(jīng)聚丙烯酰胺凝膠電泳,成功分離出M1蛋白(28 kD)純品(圖9)，通過BCA方法測得制備的蛋白濃度為0.254 mg/mL。M1蛋白(28 kD)純品免疫昆明小鼠，第0、14、21、28和42天尾部采血分離血清。根據(jù)間接ELISA法測抗體效價顯示，小鼠抗體效價在免疫一周后持續(xù)增長，在免疫第42天抗體平均效價達到57左右，且達到最高(圖10)。

M:蛋白Marker；1:純化的重組融合蛋白；2-3:SUMO蛋白酶切后產(chǎn)物；4-5:蛋白純品M: Protein Marker；1: Purified recombinant fusion protein；2-3: SUMO protease cut product；4-5: Pure protein圖8 純化后的目的蛋白Fig 8 Purified target protein

M:蛋白Marker；1-2：聚丙烯酰胺凝膠塊中電洗脫M1蛋白純品M:Protein Marker；1-2：Pure M1 protein prepared by electroelution in polyacrylamide gel block圖9 純化的M1蛋白SDS-PAGE分析Fig 9 SDS-PAGE analysis of purified M1 protein

3.7 純化的目的蛋白的Western blot分析 M1目的蛋白的相對分子質(zhì)量為28 kD，最終純化的目的蛋白除了28 kD的預期條帶外，M1蛋白條帶下面還有3條條帶。將目的蛋白進行轉(zhuǎn)膜，一抗用M1蛋白(28 kD)免疫小鼠制備的抗體，二抗用HRP標記的羊抗鼠抗體，Western blot結果顯示，4條條帶都顯色(圖11)，均能被用M1蛋白(28 kD)免疫小鼠制備的抗體所識別，從而證明28 kD蛋白條帶下面的3條條帶和M1目的蛋白性質(zhì)一樣，都為M1目的蛋白，也由此得出，M1目的蛋白在表達的過程中發(fā)生蛋白降解，從而出現(xiàn)4條條帶。

圖10 不同時期抗M1蛋白(28 kD)的抗體滴度Fig 10 Antibody titers against M1 protein (28 kD) at different times

M:蛋白Marker；1-2：制備出的目的蛋白純品；3-4：制備出的目的蛋白純品免疫印跡M:Protein Marker；1-2：Pure protein of interest；3-4：Pure target protein western blot圖11 Western blot結果Fig 11 Western blot results

4 討論與結論

H3N2犬流感病毒是一類新近發(fā)現(xiàn)能感染犬的甲型流感病毒。犬流感病毒在犬間傳播迅速，能引起患犬咳嗽、流涕和發(fā)熱等呼吸系統(tǒng)疾病。當今社會犬作為一種伴侶動物，在現(xiàn)代人類生活中具有特殊的地位。由于犬和人及野生動物的親密接觸，給流感病毒的種間傳播提供了更多的機會。因此，犬攜帶流感病毒給人類健康、犬養(yǎng)殖業(yè)、寵物犬造成了巨大的威脅。目前，流感病毒的變異速度非?？?，常規(guī)流感疫苗幾乎每年都要進行調(diào)整，以適應病毒的抗原漂移和抗原轉(zhuǎn)化，給疫苗的生產(chǎn)制備造成諸多不便。世界衛(wèi)生組織(WHO)依據(jù)當年全世界范圍流感病毒變化情況來預測并推薦下一年流感疫苗生產(chǎn)所用組分，預測準確度將會直接影響疫苗的保護效率，若預測失敗將會造成流感爆發(fā)流行的潛在威脅[9]。美國農(nóng)業(yè)部已批準一種H3N8的犬流感疫苗上市使用，用于犬流感的免疫預防，可有效降低犬群的整體發(fā)病率、病程和引起的肺部損傷，但尚不能提供100%的保護，韓國也已經(jīng)研制出H3N2的犬流感疫苗，但還未被批準上市，兩種疫苗均為滅活疫苗。現(xiàn)在使用的治療犬流感病毒的抗病毒藥物有達菲、金剛乙胺和金剛烷胺，并且缺少患犬流感病犬的臨床治療報道，所以患病犬的用藥劑量需參考人的用藥劑量進行治療，因此，通用型犬流感抗體藥物的研究迫在眉睫[10]。M1蛋白在流感病毒中高度保守，是病毒粒子中最豐富和最保守的蛋白質(zhì)，每個病毒粒子的分子數(shù)量至少是HA蛋白的兩倍，基于保守抗原制備的抗體可以為多種流感亞型提供廣譜保護。

在現(xiàn)有的表達蛋白系統(tǒng)中，原核表達是通過構建原核重組表達質(zhì)粒，轉(zhuǎn)化至大腸桿菌中，經(jīng)IPTG誘導表達的蛋白表達系統(tǒng)，是最成熟、最穩(wěn)定的，具有容易進行實驗操作、時間短、成本低和獲取的目的蛋白表達量高等優(yōu)點。而真核表達系統(tǒng)，是通過構建真核重組表達質(zhì)粒，轉(zhuǎn)染至細胞中，通過細胞的胞內(nèi)表達或者分泌表達目的蛋白，真核表達系統(tǒng)的加工、修飾體系更完善，目的蛋白能夠形成正確的空間結構，但表達量低，時間周期長以及成本高。真核表達系統(tǒng)是表達生物活性蛋白及疫苗的理想選擇，而原核表達系統(tǒng)可以提供足夠的人工抗原用于診斷或不需要翻譯后修飾的蛋白的結構分析[11]。鑒于實驗目的是制備用于篩選抗體的具有免疫原性純品抗原，因此本實驗選擇了原核表達系統(tǒng)來表達CIV M1蛋白,并取得了滿意的結果。

此研究中，成功構建了M1基因的原核重組表達質(zhì)粒pET-SUMO-M1，pET-SUMO表達質(zhì)粒能夠促進M1目的蛋白的可溶性表達，且質(zhì)粒帶有6×His標簽，使表達的M1目的蛋白易于用金屬螯合層析柱純化。重組融合蛋白預期大小為41 kD，但我們純化出的重組融合蛋白41 kD條帶下面始終緊連著3條大小不同的條帶，初步鑒定用HRP標記的抗His標簽的鼠的單克隆抗體經(jīng)Western blot分析顯示，四條蛋白都顯色，說明重組融合蛋白表達成功且四條帶可能都是重組融合蛋白。純化的重組融合蛋白經(jīng)SUMO蛋白酶酶切后，成功將目的蛋白M1和融合蛋白分離，純化出的M1目的蛋白28 kD條帶下面同樣緊連著3條大小不同的條帶，為了進一步確定這3條帶是否均為目的蛋白，我們采用自制抗M1多抗來進行鑒定分析，用預期大小為28 kD的M1目的蛋白免疫小鼠制備的抗體為一抗，去孵育M1目的蛋白28 kD條帶及下面緊連著3條大小不同的條帶，經(jīng)Western blot分析，四條帶都顯色，再次鑒定證明，3條大小不同的條帶都能和預期大小為28 kD的M1目的蛋白免疫小鼠制備的抗體發(fā)生免疫反應，也證明28 kD蛋白條帶及下面的3條大小不同條帶的蛋白性質(zhì)一樣，都為M1目的蛋白，也由此得出，M1目的蛋白在表達的過程中發(fā)生蛋白降解，從而出現(xiàn)4條目的條帶?？乖璏1目的蛋白的成功制備，為下一步制備通用型抗犬流感病毒抗體奠定了基礎。