郭亞文，卜曉娜，劉楚君，王雅娟，趙霞，王波，謝愷舟*

(1.揚(yáng)州大學(xué)動(dòng)物科學(xué)與技術(shù)學(xué)院，江蘇揚(yáng)州 225009；2.教育部農(nóng)業(yè)與農(nóng)產(chǎn)品安全國(guó)際合作聯(lián)合實(shí)驗(yàn)室，江蘇揚(yáng)州 225009)

獸藥在保證動(dòng)物源性食品的供應(yīng)方面發(fā)揮著巨大作用，但由于飼養(yǎng)人員專(zhuān)業(yè)知識(shí)的缺乏造成藥物過(guò)量使用，以及不遵循休藥期，甚至片面地追求經(jīng)濟(jì)利益而在養(yǎng)殖、加工貯存等過(guò)程中投入過(guò)量的抗菌藥物導(dǎo)致獸藥殘留超標(biāo)[1]，后通過(guò)食物鏈進(jìn)入人體造成中毒、過(guò)敏、“三致”(致癌、致畸、致突變)等嚴(yán)重傷害。因此，在動(dòng)物源性食品進(jìn)入市場(chǎng)前進(jìn)行藥物殘留檢測(cè)是十分必要的，需嚴(yán)格控制藥物殘留達(dá)到最高殘留限量(Maximum residue limits，MRLs)以下。喹諾酮類(lèi)藥物(Quinolones,QNs)是人工合成的含4-喹諾酮基本結(jié)構(gòu)的抗菌藥，對(duì)DNA回旋酶有選擇性的抑制作用，從而對(duì)細(xì)菌DNA造成不可逆損害，對(duì)多種革蘭陰性菌殺菌效果明顯[2]。氟喹諾酮類(lèi)藥物(Fluoroquinolones,FQs)是喹諾酮藥物發(fā)展到第三代的產(chǎn)物，在喹諾酮結(jié)構(gòu)的6位上加上一個(gè)氟(F)，脂溶性增加，對(duì)組織細(xì)胞的穿透力加強(qiáng)，因而吸收好，組織濃度高，半衰期長(zhǎng)，抗菌譜和殺菌效果增強(qiáng)。主要包括恩諾沙星(Enrofloxacin, ENR)及其代謝物環(huán)丙沙星(Ciprofloxacin,CIP)，恩諾沙星在動(dòng)物體內(nèi)脫乙基生成環(huán)丙沙星，如豬體內(nèi)ENR和CIP均有殘留，牛、家禽體內(nèi)殘留形式以CIP為主，因此，動(dòng)物性食品中ENR殘留檢測(cè)的標(biāo)示物多是原藥及其代謝產(chǎn)物CIP之和，也包括諾氟沙星(Norfloxacin, NFX)、氧氟沙星(Ofloxacin,OFL)、單諾沙星(Danofloxacin,DAN，又名丹諾沙星、達(dá)氟沙星)、沙拉沙星(Sarafloxacin, SAR)等。此類(lèi)藥物可用于泌尿生殖系統(tǒng)疾病、胃腸疾病以及呼吸道、皮膚組織的革蘭陰性菌感染的治療[3]，且價(jià)格低廉，已廣泛應(yīng)用于動(dòng)物養(yǎng)殖和獸醫(yī)學(xué)中。

近年來(lái)由于致病菌耐藥性和某些FQs的潛在致癌性，其殘留問(wèn)題引起廣泛關(guān)注。為保證動(dòng)物源性食品的安全，歐盟對(duì)ENR的MRLs已有規(guī)定，肝臟200 μg/kg，肌肉100 μg/kg，腎臟200 μg/kg；加拿大允許ENR用于治療牛呼吸道疾病，其MRLs為腎臟400 μg/kg和肌肉20 μg/kg；日本對(duì)進(jìn)口生鰻魚(yú)及其制品進(jìn)行ENR、CIP、NFX殘留檢測(cè)，并且將MRLs控制在50 μg/kg；世界衛(wèi)生組織對(duì)ENR的MRLs推薦值為40 μg/kg，糧農(nóng)組織/世界衛(wèi)生組織食品添加劑聯(lián)合專(zhuān)家委員會(huì)推薦雞肝組織中SAR的MRLs為80 μg/kg，豬肝組織中DAN的MRLs為50 μg/kg[4]；中國(guó)對(duì)于ENR+CIP規(guī)定見(jiàn)表1[5]。目前FQs殘留的檢測(cè)方法較多，如微生物法、酶聯(lián)免疫法、毛細(xì)管電泳法等。由于FQs在動(dòng)物源性食品中的殘留量通常很低，需要靈敏度高的檢測(cè)方法來(lái)測(cè)定，色譜法分離效率高，質(zhì)譜法靈敏度、特異性高，適于低殘留藥物的檢測(cè)。本文綜述了色譜和質(zhì)譜檢測(cè)方法，以期為動(dòng)物源性食品中FQs的殘留檢測(cè)提供參考。

表1 中國(guó)關(guān)于動(dòng)物源性食品中恩諾沙星、環(huán)丙沙星最大殘留限量的規(guī)定Tab 1 Maximum residue limits (MRLs) values for ENR, CIP in animal food established by China

1 液相色譜法

1.1 液相色譜法 液相色譜系統(tǒng)包括流動(dòng)相和固定相，其中固定相可以是固體，也可以是被固體或凝膠所支持的液體，液相色譜法(Liquid chromatography, LC)利用混合物在液-固或互相不溶的兩種液體之間分配比的差異進(jìn)行分離，而后分析鑒定。

Cho等[6]以LC法研究了豬肌肉、雞蛋、全脂牛奶中7種FQs殘留，定量限(Limit of quantitation, LOQ)為0.3～25 μg/kg，回收率為61.12%～115.93%。Roybal等[7]以LC法檢測(cè)牛奶中的ENR、SAR殘留，但色譜峰出現(xiàn)拖尾現(xiàn)象，且保留值不穩(wěn)定或過(guò)長(zhǎng)，甚至被長(zhǎng)期保留在色譜柱上，導(dǎo)致峰形異常和分離度下降。這是由于FQs結(jié)構(gòu)中某些基團(tuán)如羧基團(tuán)會(huì)在溶液中發(fā)生解離，進(jìn)而影響固定相表面對(duì)FQs分子的吸附作用，因此，LC法檢測(cè)FQs類(lèi)殘留不夠準(zhǔn)確。

1.2 高效液相色譜法 大多數(shù)金屬鹽類(lèi)和高沸點(diǎn)不易揮發(fā)、熱穩(wěn)定性差的物質(zhì)不能用LC分析，此缺點(diǎn)可用高效液相色譜法(High performance liquid chromatography, HPLC)來(lái)克服。高效液相色譜儀是在液相色譜系統(tǒng)中加上高壓液流系統(tǒng)，使流動(dòng)相在高壓下快速流動(dòng)，以提高分離效果。HPLC以液體為流動(dòng)相，采用高壓輸液系統(tǒng)，將具有不同極性的單一溶劑或不同比例的混合溶劑、緩沖液等流動(dòng)相泵入裝有固定相的色譜柱，在柱內(nèi)各成分被分離后，進(jìn)入檢測(cè)器進(jìn)行檢測(cè)，從而實(shí)現(xiàn)對(duì)試樣的分析。色譜圖不能直接給出未知物的定性結(jié)果，必須由已知標(biāo)準(zhǔn)作對(duì)照定性。當(dāng)無(wú)純物質(zhì)對(duì)照時(shí)，定性鑒定十分困難，需借助檢測(cè)器的配合。檢測(cè)器的功能是將從色譜柱中流出的已經(jīng)分離的組分顯示出來(lái)或轉(zhuǎn)換為相應(yīng)的電信號(hào)，常見(jiàn)的檢測(cè)器包括熒光檢測(cè)器(Fluorescence detector, FLD)、二極管陣列檢測(cè)器(Diode array detector, DAD或Photo-diode array detector, PDAD)等。HPLC的最大優(yōu)點(diǎn)是具有優(yōu)秀的重復(fù)性和重現(xiàn)性，利用HPLC來(lái)檢測(cè)FQs殘留的方法已被國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)采用。由于色譜柱的性能會(huì)隨著使用和不正確的保養(yǎng)而逐漸下降，會(huì)造成分離時(shí)間與色譜峰面積上的差異，因而在試驗(yàn)過(guò)程中要保持色譜柱的良好使用狀態(tài)[3]。

Liu等[8]利用微波萃取輔助提取法對(duì)日本對(duì)蝦中的3種FQs殘留的檢測(cè)進(jìn)行了優(yōu)化，樣品加標(biāo)回收率可達(dá)78.40%～96.62%。LV等[9]對(duì)蜂蜜中的OFL含量進(jìn)行了檢測(cè)，其檢測(cè)限(Limit of detection, LOD)范圍為5.68～9.71 μg/kg。Patyra等[10]用鹽酸和乙腈提取樣品，然后在pH為4.0的0.01 mol/L草酸中稀釋并通過(guò)固相提取純化，LOD和LOQ分別為28.5～74.7 μg/kg和31.7～94.6 μg/kg，平均回收率為89.7%～100.3%。He等[11]檢測(cè)牛奶、雞肉和雞蛋中7種FQs殘留，LOD范圍在0.05～0.3 μg/kg，標(biāo)準(zhǔn)加標(biāo)回收率為82.4%～108.5%。Yang等[12]利用攪拌棒吸附萃取方法，結(jié)合HPLC法檢測(cè)9種藥物的LOD均在0.1～0.3 μg/kg范圍內(nèi)，回收率為67.4%～99.0%。Bozkurt等[13]利用HPLC-FLD法分析牛奶、雞蛋、雞肉、魚(yú)肉、牛肉樣品，回收率在70%～100%范圍內(nèi)，LOD分別為：ENR 19.50×10-3μg/L，CIP 8.39×10-3μg/L，OFL 3.23×10-3μg/L。Vakh等[14]用HPLC-FLD法檢測(cè)嬰兒食品樣品，LOD、LOQ分別為，NFX、OFL均為1.5 μg/L、5 μg/L，回收率在86%～122%范圍內(nèi)。Mei等[15]采用HPLC-DAD檢測(cè)技術(shù)，測(cè)得牛奶樣品LOD為0.10～0.216 μg/L，回收率為68.8%～120%。

不同樣品基質(zhì)中FQs殘留HPLC、HPLC-FLD、HPLC-DAD、反相HPLC(RP-HPLC)檢測(cè)方法的比較如表2所示。其中反相HPLC是由非極性固定相和極性流動(dòng)相所組成的液相色譜體系，正好與由極性固定相和弱極性流動(dòng)相所組成的液相色譜體系(正相色譜)相反，幾乎可用于所有能溶于極性或弱極性溶劑中的有機(jī)物的分離。由表2可以看出，應(yīng)用HPLC檢測(cè)法所得樣品的回收率、LOD、LOQ都很好，說(shuō)明該檢測(cè)方法的準(zhǔn)確度和靈敏度高。

表2 高效液相色譜法檢測(cè)不同樣品基質(zhì)中氟喹諾酮類(lèi)藥物殘留的比較Tab 2 Comparison of HPLC methods for detection of fluoroquinolones in different matrices

續(xù)表

表中“-”為沒(méi)有數(shù)據(jù)，上標(biāo)“*”單位為μg/L，下同。

1.3 超高效液相色譜法 超高效液相色譜法(Ultra Performance Liquid Chromatography, UPLC)基于HPLC的理論及原理，涵蓋了小顆粒填料、低系統(tǒng)體積及快速檢測(cè)手段等全新技術(shù)，增加了分析的通量、靈敏度及色譜峰容量。在儀器工藝方面，超高效液相色譜儀采用新型的色譜填料及裝填技術(shù)，配備了優(yōu)秀的超高壓液相色譜泵、自動(dòng)進(jìn)樣器、高速檢測(cè)器，并優(yōu)化了系統(tǒng)的綜合設(shè)計(jì)，使儀器分析能力大大增強(qiáng)。

Aufartová等[32]利用UPLC-FLD測(cè)定西班牙Gran Canaria Island魚(yú)類(lèi)5種FQs，LOD介于0.1～6.0 μg/kg之間，在兩個(gè)加標(biāo)濃度水平(25 μg/kg和250 μg/kg)下獲得的回收率均大于90%。Vardali等[33]以UPLC-DAD檢測(cè)鱸魚(yú)肌肉和皮膚組織中DAN，LOD為13.73 μg/kg，回收率為90.2%～101.2%。不同樣品基質(zhì)FQs殘留比較結(jié)果如表3所示，由表中可知，應(yīng)用UPLC檢測(cè)FQs殘留時(shí)多使用C18柱進(jìn)行分離，因基質(zhì)、檢測(cè)器、流動(dòng)相等條件的不同，所得回收率、LOD、LOQ差別很大。所搭配的檢測(cè)器均為FLD，該檢測(cè)器因其選擇性、靈敏度高而被廣泛使用，但其只對(duì)熒光物質(zhì)有響應(yīng)，因而使用也有所受限。

表3 超高效液相色譜法檢測(cè)不同樣品基質(zhì)中氟喹諾酮類(lèi)藥物殘留的比較Tab 3 Comparison of UPLC methods for detection of fluoroquinolones in different matrices

2 液質(zhì)聯(lián)用法

質(zhì)譜分析是先將待測(cè)物離子化，按離子的質(zhì)荷比分離，然后測(cè)量各種離子譜峰的強(qiáng)度而實(shí)現(xiàn)分析目的的分析方法。色譜質(zhì)譜的聯(lián)用將色譜的分離能力與質(zhì)譜的定性功能結(jié)合起來(lái)，實(shí)現(xiàn)對(duì)復(fù)雜混合物更準(zhǔn)確的定量和定性分析，也簡(jiǎn)化了樣品的前處理過(guò)程，使樣品分析更簡(jiǎn)便。

利用液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用法(Liquid chromatography-mass spectrometry，LC-MS)檢測(cè)FQs殘留是通過(guò)分析樣品經(jīng)液相色譜分離后，進(jìn)入離子源離子化，通過(guò)記錄FQs特征離子峰下的分離時(shí)間-信號(hào)強(qiáng)度譜圖，并計(jì)算色譜峰面積的方法從而達(dá)到定性和定量分析。由于液質(zhì)聯(lián)用主要給出待測(cè)物的相對(duì)分子質(zhì)量，碎片很少，缺乏結(jié)構(gòu)信息，需要多級(jí)質(zhì)譜技術(shù)。

Kantiani等[41]用LC-MS對(duì)生牛乳和脫脂牛乳中的15種FQs殘留同時(shí)定量和確證，LOD分別介于0.01～1.93 μg/L、0.03～4.23 μg/L。Tang等[42]應(yīng)用固相微萃取(SPME)-LC-MS法快速測(cè)定養(yǎng)殖河豚魚(yú)肌肉中FQs殘留，LOD為0.3～1.5 μg/kg。Montesano等[43]憑借LC-MS/MS建立了一種快速檢測(cè)馬波沙星(FQs的一種)的方法，利用超濾法完成樣品前處理，該法僅需要175 μL的樣品便可完成檢測(cè)，LOD為1 μg/L。Johnston等[44]用LC-MS/MS同時(shí)分析了鮭魚(yú)、對(duì)蝦和鮑魚(yú)中8種FQs的殘留量，所有樣品均在12 min內(nèi)出峰，LOD介于1～3 μg/kg。Barreto等[45]使用LC-MS/MS測(cè)定家禽、牛、豬和魚(yú)肌肉中9種FQs殘留，回收率介于79%～115%，LOD和LOQ分別為5 μg/kg和10 μg/kg。Chen等[46]開(kāi)發(fā)新型多重單片纖維固相微萃取(APDE / MMF-SPME)與HPLC-MS/MS的組合檢測(cè)牛奶和蜂蜜樣品中FQs殘留量，LOD分別為：牛奶0.0019～0.018 μg/kg，蜂蜜0.0010～0.0028 μg/kg，回收率在74.5%～116%之間。SM Da等[47]以電場(chǎng)輔助基質(zhì)固相分散體作為提高氟喹諾酮提取效率和凈化的有力工具，利用UPLC-MS/MS法測(cè)得牛奶中7種FQs殘留，LOQ為20 μg/L，回收率為80.5%～95.7%。Meng等[48]以UPLC-MS/MS法分析牛奶中8種FQs殘留，LOQ為0.01～0.29 μg/kg，回收率為61.0%～115.0%。

不同樣品基質(zhì)FQs殘留比較結(jié)果如表4所示，由表中可知，流動(dòng)相的選擇多用到甲酸，這是因?yàn)榱鲃?dòng)相中加入甲酸、乙酸等,可提高正離子化效率，但是否加酸需根據(jù)色譜的分離情況、樣品在酸性條件下的穩(wěn)定性等決定。與液相色譜的常用檢測(cè)器相比，質(zhì)譜作為檢測(cè)器使用，可提供相對(duì)分子質(zhì)量和大量碎片結(jié)構(gòu)信息，在提供保留時(shí)間以外，還能提供每個(gè)保留時(shí)間下所對(duì)應(yīng)的質(zhì)譜圖，相應(yīng)增加了定性能力。

表4 液質(zhì)聯(lián)用法檢測(cè)不同樣品基質(zhì)中氟喹諾酮類(lèi)藥物殘留的比較Tab 4 Comparison of LC-MS methods for detection of fluoroquinolones in different matrices

續(xù)表

續(xù)表

3 展 望

當(dāng)前，色譜和質(zhì)譜檢測(cè)FQs殘留已經(jīng)成為熱門(mén)。其中HPLC-FLD、UPLC-FLD是FQs殘留檢測(cè)最常用的方法，與HPLC-FLD相比，UPLC-FLD具有分析效率高、流動(dòng)相消耗少、靈敏度更高等優(yōu)點(diǎn)，適合批量樣品分析。兩種方法也有應(yīng)用局限，F(xiàn)LD只對(duì)熒光物質(zhì)有響應(yīng)，且基質(zhì)中可能含有一些內(nèi)源性熒光物質(zhì)，從而會(huì)對(duì)目標(biāo)物分析造成干擾。

液質(zhì)聯(lián)用法的應(yīng)用已成為趨勢(shì)，雖然MS可提高檢測(cè)效率，但分析復(fù)雜樣品時(shí)，有著難以排除基質(zhì)干擾和共流出化合物的問(wèn)題，MS串聯(lián)可解決目標(biāo)物的定性和定量問(wèn)題，消除基質(zhì)干擾，使檢測(cè)結(jié)果更為準(zhǔn)確可靠。UPLC-MS涵蓋了極小顆粒填料、超低系統(tǒng)體積及超快速檢測(cè)等新技術(shù)，在全面提升HPLC-MS的速度、靈敏度及分離度等諸多重要品質(zhì)的同時(shí)，具有卓越的分離性能和高通量的檢測(cè)水平，可以成為復(fù)雜體系分離分析以及化合物結(jié)構(gòu)鑒定的良好平臺(tái)，在FQs殘留分析中具有獨(dú)特優(yōu)勢(shì)?？梢灶A(yù)測(cè)，HPLC、UPLC與質(zhì)譜聯(lián)用將是FQs殘留檢測(cè)的研究熱點(diǎn)。