亚洲免费av电影一区二区三区,日韩爱爱视频,51精品视频一区二区三区,91视频爱爱,日韩欧美在线播放视频,中文字幕少妇AV,亚洲电影中文字幕,久久久久亚洲av成人网址,久久综合视频网站,国产在线不卡免费播放

        ?

        兔病毒性出血癥滅活疫苗效力檢驗替代方法研究

        2019-02-26 00:56:06高金源劉丹陳建秦義嫻郎洪武
        中國獸藥雜志 2019年1期
        關鍵詞:效力血清方法

        高金源,劉丹,陳建,秦義嫻,郎洪武

        (中國獸醫(yī)藥品監(jiān)察所,北京100081)

        兔病毒性出血癥(Rabbit Haemorrhagic Disease, RHD)是由兔出血癥病毒(RHDV)引起的一種家兔高發(fā)病率、高死亡率的傳染性疫病,臨床多表現(xiàn)為發(fā)熱、精神不振、突然死亡,疫苗接種仍是預防RHD的最有效方法[1-2]。

        在《中國獸藥典》2015年版三部中[3],RHD滅活疫苗效力檢驗采用經(jīng)典的家兔免疫攻毒方法來評價家兔攻毒后的保護效果。由于該方法需要配備負壓動物舍,攻毒后也需要較長觀察時間,存在試驗成本高、周期較長、操作繁瑣等缺點。本試驗在制備了HI試驗用RHDV 血凝(HA)抗原、陽性血清、陰性血清的基礎上,確認了免疫攻毒保護與免疫血清HI抗體效價之間的平行關系,并采用免疫血清HI效價測定方法進行了RHD滅活疫苗的效力檢驗應用。

        1 材料與方法

        1.1 材料

        1.1.1 家兔 RHD血清抗體陰性(HI價<1∶8)的3月齡以上健康新西蘭兔,由濟源市陽光兔業(yè)科技有限公司、濟南西嶺角養(yǎng)殖繁育中心、四川省實驗動物專委會養(yǎng)殖場購入。

        1.1.2 RHDV AV34株肝臟組織毒,由齊魯動物保健品有限公司(毒價為105.0LD50/mL)、華派生物工程集團有限公司(毒價為105.1LD50/mL)、山東綠都生物科技有限公司(毒價為106.1LD50/mL)及中國獸醫(yī)藥品監(jiān)察所病毒室(毒價為105.5LD50/mL)提供。

        1.1.3 1%新鮮人“O”型紅細胞 由齊魯動物保健品有限公司、華派生物工程集團有限公司提供。

        1.1.4 RHD滅活疫苗 規(guī)格為20 mL(頭份)/瓶,由齊魯動物保健品有限公司(9批,批號分別為1702007、1702008、1704019、1704020、1706023、1706024、1707029、1708037、1708038)、華派生物工程集團有限公司(8批,批號分別為2017001~2017008)、山東綠都生物科技有限公司(2批,批號分別為1803003、1804004)提供。

        1.1.5 RHDV HA抗原 (HA價為1∶128)、RHD陽性血清(HI價為1∶128)、RHD陰性血清(HI價<1∶8)、PBS(0.01 mol/L,pH7.2)、硫乙醇酸鹽流體培養(yǎng)基、胰酪大豆胨液體培養(yǎng)基,均由中國獸醫(yī)藥品監(jiān)察所病毒室提供。

        1.2 方法

        1.2.1 RHDV HA抗原制備 用RHDV南京株接種3月齡以上的健康易感家兔,無菌采集接種后24~96 h瀕死或剛死兔的有典型病理變化的肝臟;將肝臟組織用適量的PBS進行搗碎,6000 g離心15 min,取上清液,制備成8倍稀釋的病毒懸液;加入β-丙內(nèi)酯溶液,使其含量為1/4000,混合均勻,放入4 ℃冰箱作用24 h,再放入37 ℃水浴水解2 h,放入4 ℃冰箱保存。同時進行無菌檢驗[2]和HA效價測定[1]。無菌檢驗結果應無菌生長,滅活病毒HA價應不低于1∶64。

        1.2.2 RHD陽性血清制備 采用常規(guī)微量HI試驗法[1],選取RHD抗體陰性(HI價<1∶8)的3月齡以上的健康家兔,先用商品化的RHD滅活疫苗進行基礎免疫,再用RHDV強毒加強免疫2次,中間間隔14 d,最后一次免疫后21 d,無菌采集血液,提取血清,混合后進行無菌檢驗和HI效價測定。無菌檢驗結果應無菌生長,HI價應不低于1∶128。

        1.2.3 RHD陰性血清制備 采用常規(guī)微量HI試驗法,選取RHD抗體陰性(HI價<1∶8)的3月齡以上的健康家兔,無菌采集血液,提取血清,混合后進行無菌檢驗和HI效價測定。無菌檢驗結果應無菌生長,HI價應小于1∶8。

        1.2.4 疫苗免疫攻毒與血清HI效價的平行關系 采用常規(guī)微量HI試驗法,選取RHD抗體陰性(HI價<1∶8)的3月齡以上的健康家兔35只。將RHD滅活疫苗搖勻后進行家兔免疫,取1/2 頭份、1/4頭份、1/8頭份疫苗各皮下注射家兔10只,飼養(yǎng)觀察14 d。同時設立非免疫攻毒對照家兔5只。家兔免疫14 d后,對所有試驗家兔進行采血,每只家兔采血4.0 mL,提取血清,56 ℃滅活30 min,用于血清HI價測定。家兔采血后,對所有家兔進行攻毒,每只家兔皮下注射RHDV 1 mL(含1000 LD50/mL)。每日觀察家兔健康情況,飼養(yǎng)觀察7 d,記錄家兔發(fā)病死亡情況;同時,無菌采集免疫攻毒家兔肝臟組織,研磨并稀釋4倍后,3000 g離心15 min后,取上清液測定血凝情況,以監(jiān)測RHDV兔體內(nèi)復制增殖情況。攻毒對照家兔應至少死亡4只,試驗成立。統(tǒng)計不同HI效價的攻毒保護情況,當免疫攻毒保護家兔4倍肝臟組織液無血凝性時,以免疫攻毒100%保護家兔的血清最低HI效價作為免疫攻毒保護判定的最低標準。

        1.2.5 疫苗效力檢驗替代方法的應用 與3家企業(yè)19批RHD滅活疫苗現(xiàn)行免疫攻毒法同步進行,攻毒前無菌采集免疫家兔血液,提取血清,進行HI效價測定,根據(jù)1.2.4中確定的免疫攻毒保護判定標準,比較兩種方法的效力檢驗結果,評價HI效價測定方法替代現(xiàn)行免疫攻毒法的可行性。

        2 結果與分析

        2.1 RHDV HA抗原、陽性血清、陰性血清鑒定 結果見表1。HI法的各組分鑒定結果均符合其質(zhì)量標準要求,可以滿足HI效價測定的需要。

        2.2 疫苗免疫血清不同HI效價水平的免疫攻毒保護情況統(tǒng)計結果 見表2。

        表1 HI法組分鑒定結果Tab 1 Identification results of HI component

        “-”:檢測結果為陰性; “/”:不涉及

        “-”: negative; “/”:unconcerned

        表2 不同HI效價水平的攻毒保護結果Tab 2 Protection rate of rabbits with different HI titre levels

        “-”代表保護;“HA-”代表無血凝

        “-”protection; “HA-”no hemagglutination

        攻毒對照家兔均發(fā)病死亡;免疫攻毒獲得保護家兔的4倍肝臟組織液均無血凝性,顯示無明顯病毒增殖情況;RHD滅活疫苗免疫家兔血清HI效價低于1∶16時(6份),對應的攻毒家兔均發(fā)病死亡;免疫家兔血清HI效價為1∶16時(8份),對應攻毒家兔5只獲得保護,而另3只均發(fā)病死亡;免疫家兔血清HI效價不低于1∶32時(21份),對應的攻毒家兔均獲得保護。

        2.3 疫苗效力檢驗替代方法的應用 疫苗效力檢驗現(xiàn)行方法(免疫攻毒法)與替代方法(HI效價測定方法)的應用結果比較見表3。

        表3 2種效力檢驗方法應用結果比較Tab 3 Comparison of the two methods applicated in potency test

        所有對照組家兔血清HI效價不高于1∶8,且在攻毒后均死亡;在19批RHD滅活疫苗效力檢驗的免疫攻毒方法與血清HI效價測定方法的比較應用試驗中,替代方法(HI效價測定方法)與現(xiàn)行方法(免疫攻毒法)檢驗結果符合率為100%。

        3 結 論

        RHD于1984年由我國首次報道[4],隨后確認該疫病由杯狀病毒科杯狀病毒屬的RHDV引起。由于RHDV只能在兔體內(nèi)增殖,不能在任何組織細胞上有效增殖[4],因此,尚未建立在細胞上進行抗體定量檢測方法。雖然發(fā)現(xiàn)存在無血凝性的毒株[5],但可以利用具有血凝性的RHDV毒株,通過血清HI效價的測定對家兔血清抗體進行定量[1,6-7]。同時,RHD滅活疫苗免疫血清HI效價與RHDV的攻毒保護密切相關,但免疫攻毒臨床保護的HI效價臨界值缺少明確一致的數(shù)據(jù)[8-10]。目前,RHD滅活疫苗效力檢驗的國內(nèi)外標準方法均為免疫攻毒法[3,11],雖然攻毒劑量要求不同,但均是通過觀察免疫家兔攻毒后是否獲得臨床保護來判定免疫效果。為了采用免疫血清HI效價測定方法替代現(xiàn)有的標準方法,按照《中國獸藥典》2015年版三部的攻毒劑量標準,明確了攻毒臨床保護的免疫血清HI效價標準應不低于1∶32。同時,與19批RHD滅活疫苗效力檢驗免疫攻毒的標準方法進行比對的應用表明,標準方法中免疫攻毒臨床保護的家兔,其免疫血清HI效價均未低于1∶32??梢?,只要免疫血清HI效價不低于1∶32,就能夠確保免疫家兔攻毒后可獲得臨床保護,用免疫兔血清HI效價均不低于1∶32作為RHD滅活疫苗效力檢驗中判定攻毒臨床保護的標準確實可行。

        在《中國獸藥典》2015年版三部中,RHD滅活疫苗的安全檢驗和效力檢驗均采用HI效價測定方法篩選檢驗用敏感家兔,生產(chǎn)企業(yè)熟悉該檢測方法。同時,通過免疫家兔血清HI效價來評價疫苗免疫效果,疫苗生產(chǎn)企業(yè)可以避免使用負壓動物舍,縮短檢驗時間,也可節(jié)約檢驗成本。該研究也可為下一版《中國獸藥典》的修訂提供數(shù)據(jù)。

        猜你喜歡
        效力血清方法
        債權讓與效力探究
        血清免疫球蛋白測定的臨床意義
        中老年保健(2021年3期)2021-08-22 06:50:04
        Meigs綜合征伴血清CA-125水平升高1例
        慢性鼻-鼻竇炎患者血清IgE、IL-5及HMGB1的表達及其臨床意義
        保證合同中保證人違約責任條款的效力研究
        可能是方法不對
        論行政審批對合同效力的影響
        用對方法才能瘦
        Coco薇(2016年2期)2016-03-22 02:42:52
        四大方法 教你不再“坐以待病”!
        Coco薇(2015年1期)2015-08-13 02:47:34
        捕魚
        国产精品久久久久影院| 精品亚洲一区二区三区在线播放 | 亚洲中文字幕人妻久久| 国产日产欧产精品精品| 国产精品一区二区暴白浆| 人妻中文字幕av有码在线| 国产一区二区三免费视频| 日本又色又爽又黄的a片18禁| 亚洲狠狠婷婷综合久久| 亚洲欧洲一区二区三区波多野| 色偷偷亚洲精品一区二区| 后入内射国产一区二区| 国产专区国产av| 国产成年无码久久久免费| 日本av一级视频在线观看| 999国产精品999久久久久久| 夫妇交换刺激做爰视频| 99riav精品国产| 亚洲乱码av一区二区蜜桃av | 免费看奶头视频的网站| 亚洲第一页在线观看视频网站| 中文字幕久久波多野结衣av不卡| 国产精品_国产精品_k频道| 国产精品 精品国内自产拍| 日本久久久精品免费免费理论| 亚洲av无码乱码国产一区二区| 欧美精品久久久久久久自慰| 亚洲 美腿 欧美 偷拍| 国产精品国产自产自拍高清av| 美女张开腿让男人桶爽| 91久久久久无码精品露脸 | 久久中文字幕无码一区二区| 国产精品高清一区二区三区人妖| 揄拍成人国产精品视频| 国产又色又爽无遮挡免费 | 精品久久久久久亚洲综合网| 中国猛少妇色xxxxx| 国产粉嫩嫩00在线正在播放| 亚洲av综合av一区| 国产精品无码久久久久| 亚洲免费视频网站在线|