樊理華 李東麗 何佳群 武旖旎 韓新

結直腸癌是常見的惡性腫瘤，目前最有效的治療方法是廣泛性根治手術，但仍有50%的患者術后2年出現(xiàn)復發(fā)或轉(zhuǎn)移，其中約20%～30%的患者出現(xiàn)局部復發(fā)轉(zhuǎn)移，而50%～80%的患者發(fā)生遠處轉(zhuǎn)移[1-2]。手術本身是一種強烈的創(chuàng)傷應激，是增加腫瘤侵襲和轉(zhuǎn)移的主要原因之一[3]。但是目前還沒有一種理想的手術創(chuàng)傷腫瘤模型用于手術應激對腫瘤影響的研究，因而建立簡單有效的腫瘤創(chuàng)傷應激模型非常必要。本研究擬制備大鼠結直腸癌模型，在該模型基礎上予以特制的阻熱黃銅模板對大鼠進行熱創(chuàng)傷處理，建立大鼠熱創(chuàng)傷應激模型，旨在探索針對性的防治措施。

1 材料和方法

1.1 實驗動物條件 健康雄性SD大鼠72只，體重150～200g，購自溫州醫(yī)科大學實驗動物中心，本實驗獲得溫州醫(yī)科大學動物保護委員會批準。實驗前大鼠適應性喂養(yǎng)1周，自由獲取水和食物；動物房12h明暗周期循環(huán)（7：00～19：00給予光照），控制室溫為（21±2）℃、濕度60%。

1.2 試劑和儀器 N-甲基-N-亞硝基脲（MNU）（加拿大Toronto Research Chemicals公司），促腎上腺皮質(zhì)激素（ACTH）（10817-09R）、IL-6（10926-09R）、IL-10（10542-09R）、皮質(zhì)酮（10356-09R）ELISA 試劑盒（上海博蘊生物科技有限公司），一次性使用靜脈留置針（蘇州靈巖醫(yī)療器械有限公司），高速低溫離心機（安徽中科中佳科學儀器公司），光學顯微鏡（日本Olympus公司），超聲破膜儀（美國Sonics公司），Bio-Rad垂直電泳儀（美國Bio-Rad公司），Las2000mini曝光機（美國General Electric公司），Multiskan Mk3型酶標儀（德國Thermo Fisher Scientific公司）。

1.3 實驗方法

1.3.1 實驗分組 采用隨機數(shù)字表法將大鼠分為正常對照組、癌癥模型組和熱創(chuàng)傷應激組3組，每組24只。

1.3.2 結直腸癌模型的建立 將MNU用無菌蒸餾水配制成濃度為4mg/ml的灌腸液對大鼠進行灌腸，灌腸前抓住大鼠尾巴促使大鼠將直腸內(nèi)大便排出，用5ml注射器抽取灌腸液（1ml/200g）接上小兒灌腸管，導管前端用石蠟油涂抹，置入肛門約6cm，緩慢勻速推注，推畢后保持原位10min。灌注頻率：前4周以3次/周灌腸，4周后以1次/周持續(xù)灌腸至16周。每天對大鼠進行觀察，每次灌注前記錄1次體重。

1.3.3 熱創(chuàng)傷應激模型的建立 在結直腸癌模型基礎上，麻醉大鼠后，剪去大鼠背部脊柱兩側范圍約 30mm×30mm的長毛后，用8%硫化鈉脫毛，露出體表皮膚，將大鼠俯臥于手術固定板上，將特制的阻熱黃銅模板（12mm×12mm）放入100℃沸水中10min，取出后置于大鼠裸露皮膚處20s，將其重新加熱后置于脊柱另一側，整個燙傷過程只靠黃銅本身重力，不再另外施壓。

1.3.4 檢測標本采集 熱創(chuàng)傷應激組和癌癥模型組分別于熱創(chuàng)傷刺激后0、6、12和24h各隨機取6只大鼠取血和采集結直腸組織。正常對照組不作任何處理，根據(jù)另兩組處理時間各隨機取6只大鼠取血和采集結直腸組織。3組大鼠均于實驗結束時予5%水合氯醛7ml/kg腹腔內(nèi)注射麻醉，尾靜脈穿刺取血；脫頸椎處死，取出肛緣至回盲部的結直腸組織，經(jīng)液氮冰凍后-80℃保存。

1.4 血清指標檢測 采用ELISA法檢測大鼠血清ACTH、IL-6、IL-10、皮質(zhì)酮表達水平。

1.5 結直腸組織細胞周期蛋白（Cyclin）D1和髓樣細胞白血病-1（myeloid cell leukemia-1，Mcl-1）蛋白表達水平檢測 采用Western blot法。取大鼠結直腸組織60mg，把組織剪切成細小的碎片，按照每20mg組織加入200μl裂解液的比例加入裂解液（裂解液中加入蛋白酶和磷酸酶抑制劑）。研磨后的勻漿在超聲破膜機下超聲破膜 10s×3次，4℃、12 000r離心 5min，小心吸取上清液，進行蛋白含量測定。在Bio-Tek熒光分析儀上測定并計算出實際濃度。灌膠上樣，采用Bio-Rad垂直電泳儀進行電泳，轉(zhuǎn)膜封閉過夜，洗膜后加入一抗孵育（稀釋度 1∶1 000）4℃搖床孵育過夜（16h），沖洗后加二抗孵育，曝光。采用Quantity One凝膠分析軟件行半定量分析，以Cyclin D1、Mcl-1與內(nèi)參β-actin灰度值的比值反映Cyclin D1、Mcl-1的蛋白表達。

1.6 病理組織學觀察 部分結直腸組織于4%多聚甲醛固定24h，制備石蠟標本切片后行HE染色，觀察腫瘤組織病理形態(tài)，確定病理類型。

1.7 統(tǒng)計學處理 采用SPSS 20.0統(tǒng)計軟件。計量資料以表示，多組間比較采用單因素方差分析，兩兩比較采用LSD-t檢驗。P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 大鼠一般情況及病理檢查結果 臨床表現(xiàn)來看，正常對照組大鼠在實驗期間活動正常，體重增長，無死亡。癌癥模型組和熱創(chuàng)傷應激組大鼠實驗期間活動減少，精神萎靡，腹瀉，黏液膿血便，毛發(fā)脫落等，體重低于正常對照組，部分大鼠有腹水現(xiàn)象，也有死亡現(xiàn)象，解剖發(fā)現(xiàn)結腸腫瘤、腹腔有粘連。病理結果提示正常對照組大鼠結腸黏膜光滑，紋理清晰，未見充血、水腫（圖1a）。癌癥模型組和熱創(chuàng)傷應激組大鼠結直腸組織腺癌，癌組織多呈橢圓形、圓形，胞質(zhì)豐富，核大畸形、深染，多見核分裂象，呈彌漫性生長。癌組織排列呈團狀或索狀，在腸壁中呈浸潤性生長，癌細胞間有結締組織（圖1b）。

圖1 大鼠病理所見（a：正常對照大鼠；b：結直腸癌大鼠；HE染色，×4）

2.2 各組大鼠血清ACTH、IL-6、IL-10、皮質(zhì)酮水平比較 癌癥模型組和正常對照組大鼠血清ACTH和皮質(zhì)酮水平比較差異均無統(tǒng)計學意義（均P＞0.05），但癌癥模型組大鼠血清IL-6、IL-10水平較正常對照組均升高，差異均有統(tǒng)計學意義（均P＜0.05）。熱創(chuàng)傷應激組大鼠血清ACTH、IL-6、IL-10、皮質(zhì)酮水平較正常對照組和癌癥模型組均升高，差異均有統(tǒng)計學意義（均P＜0.05）；且熱創(chuàng)傷應激組創(chuàng)傷應激后6、12、24h血清ACTH、IL-6、IL-10、皮質(zhì)酮水平較應激后0h均升高，差異均有統(tǒng)計學意義（均P＜0.05），見表1。

表1 各組大鼠血清ACTH、IL-6、IL-10、皮質(zhì)酮水平比較

2.3 各組大鼠結直腸組織中Cyclin D1和Mcl-1蛋白表達水平比較 取正常對照組0h、癌癥模型組0h與熱創(chuàng)傷應激組0、6、12、24h 4個時間點的大鼠進行Cyclin D1和Mcl-1蛋白表達水平比較，發(fā)現(xiàn)熱創(chuàng)傷應激組4個時間點Cyclin D1和Mcl-1蛋白表達水平較正常對照組0h和癌癥模型組0h均升高，差異均有統(tǒng)計學意義（均P＜0.05）；且熱創(chuàng)傷應激組創(chuàng)傷應激后6、12、24h Cyclin D1和Mcl-1蛋白表達水平較應激后0h均升高，差異均有統(tǒng)計學意義（均P＜0.05），見圖2和表2。

圖2 正常對照組（N）0h、癌癥模型組（C）0h與熱創(chuàng)傷應激組（TIS）0、6、12、24h的 Cyclin D1和 Mcl-1蛋白表達電泳圖

表2 各組大鼠結直腸組織中Cyclin D1、Mcl-1蛋白表達水平比較（ng/ml）

3 討論

既往研究結直腸癌的腫瘤發(fā)生、腫瘤生物學和特定分子事件對結直腸生物學的影響，應用較多的是人類的結直腸癌活檢標本、結直腸癌異種移植物以及結直腸癌體外細胞培養(yǎng)模型，但這些方法使用的是已建立的腫瘤和結腸癌細胞系，具有突變復雜性，這限制了對單個突變影響的清晰理解[4]。另外這些模型大多應用于小鼠，會對實驗的操作及觀察空間有一定的限制，且不能完全自然模擬結直腸癌原位生長及侵襲轉(zhuǎn)移過程[5]。本實驗成功地通過MNU灌腸方法建立了大鼠結直腸癌模型，模擬大鼠結直腸癌自然誘導生長過程，成瘤時間相對較短，成瘤率高，腫瘤組織病理和生物學特性比較穩(wěn)定，自然客觀地模擬了結腸癌的發(fā)生機制，應用SD大鼠又可進一步提升實驗操作的空間，為更深入地研究結腸癌發(fā)病機制、轉(zhuǎn)移機制和抗轉(zhuǎn)移治療提供了一種理想的動物模型。本實驗結果表明，癌癥模型組和熱創(chuàng)傷應激組大鼠與正常對照組相比實驗期間活動減少，精神萎靡，腹瀉、黏液膿血便、毛發(fā)脫落等，體重低于正常對照組，解剖發(fā)現(xiàn)結腸腫瘤、腹腔有粘連。大鼠腫瘤組織HE染色病理結果顯示癌細胞穿透結腸組織黏膜層、侵入肌層，提示結直腸癌模型制備成功。

理想的動物模型是手術應激研究的基礎，應該與圍術期產(chǎn)生的手術應激機制相近，模擬手術應激對機體造成的創(chuàng)傷；動物存活時間足夠長，不影響做后續(xù)的實驗研究；模型制作簡單，誘導因素單一，模型重復性好，造成手術應激的同時盡量避免觸發(fā)其他應激源對應激指標結果的干擾[6-7]。手術誘導的應激反應與熱創(chuàng)傷損害觸發(fā)的應激反應大部分類似[8]，熱創(chuàng)傷能夠提供一個創(chuàng)傷誘導的應激反應的模型，用來研究長時間應激反應的長期效應。目前，國內(nèi)外建立的創(chuàng)傷應激動物模型種類繁多，以Regas FC和Ehrlich HP發(fā)明的銅梳燒傷模型應用較為廣泛[9]，且操作簡便可重復性好，被認為是研究創(chuàng)傷應激的合理方法，所以本實驗選擇該具有代表性的熱創(chuàng)傷應激模型，對結直腸癌大鼠造成熱創(chuàng)傷應激以進一步研究手術應激對腫瘤微環(huán)境的影響。

腫瘤的發(fā)生、發(fā)展過程復雜，其與機體的相互關系的研究也在不斷深入中，其中腫瘤微環(huán)境在腫瘤始動、進展、轉(zhuǎn)移和耐藥性中發(fā)揮著關鍵作用[10]。研究表明腫瘤多樣性和侵襲性都跟其微環(huán)境組成、生化特性、構造和生理特性相關[11]。手術切除腫瘤病灶除了能夠引起手術部位的局部改變，還可導致機體的全身性變化。手術創(chuàng)傷可通過應激激發(fā)引起全身炎癥反應、神經(jīng)內(nèi)分泌反應、細胞因子的變化、代謝改變以及其他一些可能的生物學反應，導致下丘腦、垂體、腎上腺軸興奮，皮質(zhì)類固醇大量釋放，導致腫瘤微環(huán)境的變化，從而改變腫瘤的生物學特性[12-14]。本實驗用高溫黃銅塊對大鼠進行熱創(chuàng)傷處理，通過對比各組大鼠血清ACTH、IL-6、IL-10、皮質(zhì)酮水平來評估應激狀態(tài)，建立大鼠熱創(chuàng)傷應激模型。大鼠熱創(chuàng)傷即刻可見皮膚損傷，創(chuàng)傷1周內(nèi)創(chuàng)傷處皮膚有水腫、出血、壞死。ELISA法測大鼠血清ACTH、IL-6、IL-10、皮質(zhì)酮水平表明熱創(chuàng)傷應激后上述指標水平顯著升高，提示熱創(chuàng)傷應激模型制備成功。

IL-6是腫瘤相關的重要促炎因子，其在結直腸癌及間質(zhì)表型的結直腸癌細胞中高表達，在結直腸癌腫瘤炎性微環(huán)境中起著重要作用[15]。研究表明，經(jīng)IL-6介導的信號通路在結直腸癌的發(fā)生、發(fā)展中發(fā)揮著重要的作用，IL-6可使信號轉(zhuǎn)導及轉(zhuǎn)錄激活因子3（signal transducer and activator of transcription 3，STAT3） 磷酸化[16]。磷酸化的STAT3（p-STAT3）進入細胞核，與特定的DNA序列結合，引起一系列促增殖蛋白（如 Cyclin D1）和抗凋亡蛋白（如 Mcl-1）的表達，從而導致腫瘤的發(fā)生。細胞的增殖狀態(tài)對研究腫瘤生物學行為、判斷其危害性具有及其重要意義，一旦細胞周期調(diào)控失常，就會導致腫瘤的惡性增生。Cyclin D1是細胞周期G期的關鍵調(diào)節(jié)因子，其功能受抑制可導致細胞周期停滯，而該蛋白的不規(guī)則表達則加速G1期[17]。Mcl-1蛋白屬B淋巴細胞瘤-2基因（bcl-2）家族蛋白，是一種高度調(diào)節(jié)蛋白，能夠引起廣泛的生存信號，也可作為細胞凋亡控制頂端的分子迅速下調(diào)凋亡過程，并通過早期介入導致線粒體細胞色素C釋放的級聯(lián)來促進細胞存活[18]。本研究檢測發(fā)現(xiàn)大鼠血清中IL-6在熱創(chuàng)傷應激后明顯升高，表明熱創(chuàng)傷應激可異常誘導IL-6水平。同時結直腸組織中兩個增殖凋亡相關蛋白在熱創(chuàng)傷應激后也能顯著升高，這說明熱創(chuàng)傷應激能夠促進結直腸癌大鼠腫瘤細胞增殖。

綜上所述，本實驗在成功構建的結直腸癌模型基礎上復合熱創(chuàng)傷應激，構建了結直腸癌大鼠熱創(chuàng)傷應激模型，具有操作簡便、重復性好等優(yōu)點。熱創(chuàng)傷應激可引起大鼠血清ACTH、IL-6、IL-10、皮質(zhì)酮水平升高，導致手術應激相類似的激素改變。另外，熱創(chuàng)傷應激可導致結直腸癌大鼠體內(nèi)IL-6的異常激活，誘導促細胞增殖蛋白（Cyclin D1）和抗細胞凋亡蛋白（Mcl-1）的表達，從而促進結直腸癌大鼠腫瘤增殖，故該模型可用于圍術期手術創(chuàng)傷對腫瘤微環(huán)境影響的機制研究，從而改善惡性腫瘤術后預后。