劉曉美，李圓圓，王升光，馬青琳，姜珊，高鵬

(山東中醫(yī)藥大學(xué)，山東 濟南 250355)

蛋白質(zhì)是玉米蛋白粉中含量最高的成分，約占60%～70%，除此之外還含有大量的淀粉和纖維素[1]，以及豐富的微量元素。由于玉米蛋白缺少賴氨酸(Lys)、色氨酸(Trp)等人體必需氨基酸[2]，有特殊的味道和色澤，水溶性差，目前國內(nèi)主要將其用于動物飼料中或者直接處理排放，極大地浪費了資源[3]。營養(yǎng)學(xué)研究表明，蛋白質(zhì)需要通過酶解轉(zhuǎn)變成分子量更小的肽后才能被吸收。玉米肽含有13.18%的丙氨酸和17.15%亮氨酸，能夠減慢人體吸收乙醇的速度并加快其在體內(nèi)的代謝，從而起到解除乙醇毒性、保護肝臟的作用[4]。硒元素有“護肝衛(wèi)士”之稱，能夠抗氧化、抗自由基。具有生物活性的多肽通過共價化學(xué)鍵與金屬離子發(fā)生螯合，能夠顯著提高金屬元素在機體內(nèi)的吸收利用率[5-7]。王真真等[8]的研究表明，玉米肽螯合硒元素能夠增強醒酒保肝的作用。目前國內(nèi)對于玉米肽-硒的研究，主要側(cè)重于富硒玉米蛋白酶解得到的富硒玉米肽[9]。曾慶瑞等[10]研究表明，功能活性肽螯合微量元素，既可減少微量元素的成本，又能使蛋白質(zhì)和微量元素的生物利用率都得到顯著提高。因此，本實驗主要研究玉米蛋白經(jīng)過酶解成玉米肽后與硒元素的螯合。

本文通過考察玉米肽的酶解工藝，使玉米蛋白充分酶解獲得具有更高活性的玉米肽，并采用玉米肽與硒元素螯合工藝，獲得最優(yōu)工藝參數(shù)。通過四氯化碳肝損傷的小鼠模型，確證其對肝臟的保護作用，為玉米肽的開發(fā)和利用提供理論依據(jù)。

1 實驗材料

1.1 試劑

谷丙轉(zhuǎn)氨酶(ALT)(分析純，南京建成生物工程研究所)；天冬氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶(AST)(分析純，南京建成生物工程研究所)；四氯化碳(CCl4)(分析純，上海國藥集團)；水飛薊素(Silymarin)(分析純，德國馬博士大藥廠)。

玉米蛋白(購于陜西森弗天然制品有限公司)；胰蛋白酶(酶活≥ 100 000 U/g，上海源葉生物科技有限公司)；菠蘿蛋白酶(酶活≥100 000 U/g ，上海源葉生物科技有限公司)。

1.2 實驗儀器

紫外可見分光光度計(UV1100，上海天美科學(xué)儀器有限公司)；酶標(biāo)儀(68SM800，上海永創(chuàng)醫(yī)療器械有限公司)；實驗室pH計(FE-20， 梅特勒儀器有限公司)；低溫高速離心機( 3K15 ，SIGMA 公司)。

1.3 實驗動物

昆明種小鼠(濟南朋悅實驗動物繁育有限公司提供，動物合格證號：SCXK(魯)2017-0011)，100只雄性，體重(20±2 ) g，6～7周齡。

2 實驗方法

2.1 玉米蛋白酶解工藝流程

本實驗先用蛋白酶水解蛋白原料，使其酶解為片段后再加入胰蛋白酶模擬小腸的水解環(huán)境，最終得到小分子的活性肽。實驗過程見圖1。

圖1 玉米蛋白酶解過程
Fig.1 Corn proteolysis process

2.2 玉米肽酶解工藝考察

2.2.1 玉米蛋白酶解工藝單因素試驗

以蛋白質(zhì)的水解度為考察指標(biāo)，底物質(zhì)量分數(shù)為10%時，分別考察加酶的質(zhì)量分數(shù)(1%、2%、3%、4%、5%)、酶解時間(1 h、2 h、3 h、4 h、5 h)、酶解 pH(5、6、7、8、9)以及酶解溫度(40 ℃、45 ℃、50 ℃、55 ℃、60 ℃)對玉米蛋白水解度的影響，進行單因素試驗。

2.2.2 蛋白質(zhì)水解度的測定

蛋白質(zhì)水解度的測定采用茚三酮法[11]。蛋白質(zhì)水解過程中被裂解的肽鍵數(shù)h(mmoL/g)與蛋白質(zhì)的總肽鍵數(shù)htot(mmoL/g)之比稱為水解度(DH)。

DH=h/htot×100%。

2.2.3 菠蘿蛋白酶、胰蛋白酶酶解的正交試驗設(shè)計

在單因素試驗的基礎(chǔ)上，選取酶解時間(A)、酶解溫度(B)、酶質(zhì)量分數(shù)(C)和酶解pH(D)4個因素，按L9(34)正交設(shè)計[12]優(yōu)選酶解工藝，各因素及水平設(shè)計如表1所示，每組重復(fù)3次。

表1 菠蘿蛋白酶、胰蛋白酶酶解 L9(34)正交試驗因素水平表

2.3 響應(yīng)面法優(yōu)化玉米螯合硒元素的條件

2.3.1 玉米螯合硒元素的工藝流程

本實驗通過響應(yīng)面法優(yōu)化玉米肽螯合硒元素的制備工藝，實驗過程見圖2。

圖2 玉米肽螯合工藝流程
Fig.2 Chelating process of corn peptide

2.3.2 玉米肽螯合硒元素螯合率的測定方法

采用 3,3′-二氨基聯(lián)苯胺比色法[13]，對螯合物中硒含量進行測定。

螯合率=M1/M0×100%，

其中，M1為螯合物中硒的含量，μg；M0為加入反應(yīng)體系中硒的總量，μg。

2.3.3 玉米肽-硒螯合工藝單因素試驗

2.3.4 螯合工藝響應(yīng)面法優(yōu)化試驗法

2.3.4.1 玉米肽-硒螯合工藝響應(yīng)面優(yōu)化試驗

以玉米肽-硒螯合單因素試驗結(jié)果為基礎(chǔ)，選取螯合時間(X1)、螯合溫度(X2)、玉米肽-硒摩爾比(X3)以及螯合pH(X4)4個因素， 根據(jù)Box-Behnken響應(yīng)面試驗設(shè)計原理，對螯合反應(yīng)的硒含量指標(biāo)進行響應(yīng)面優(yōu)化試驗設(shè)計，見表2。

表2 玉米肽-硒螯合工藝響應(yīng)面試驗水平與編碼表

2.4 保肝作用研究

2.4.1 小鼠四氯化碳急性肝損傷模型的建立

小鼠四氯化碳急性肝損傷模型的建立參考文獻[14]。將50只昆明雄性小鼠，按照正常對照組、四氯化碳模型組、玉米肽組、玉米肽螯合硒元素組、陽性對照水飛薊素組隨機分為5組，每組10只。各組小鼠以標(biāo)準(zhǔn)飼料喂養(yǎng)，自由飲水，使其在室溫下適應(yīng)一周。一周后，正常對照組和四氯化碳模型組每日按10 mL/kg灌胃生理鹽水1次，玉米肽組和玉米肽-硒敖合物組每日按200 mg/kg劑量灌胃。陽性對照組按每日50 mg/kg劑量定時灌胃水飛薊素1次。連續(xù)灌胃15 d，末次給藥5 h，正常對照組腹腔注射橄欖油10 mL/kg，其余組別腹腔注射體積分數(shù)為0.125%的四氯化碳橄欖油溶液10 mL/kg。禁食不禁水12 h后，眼球取血，處死小鼠，剖腹取出肝臟，生理鹽水洗后，取肝制肝勻漿備用。在整個飼養(yǎng)周期內(nèi)，每2 d稱量一次體重，記錄小鼠的體重變化。

2.4.2 檢測指標(biāo)

按試劑盒說明書方法測定血清中 ALT、AST 活力以及肝臟指數(shù)。

肝臟指數(shù)(mg/g)= 肝臟質(zhì)量(mg)/體重(g)。

2.4.3 數(shù)據(jù)統(tǒng)計與分析

實驗數(shù)據(jù)用 SPSS19.0 統(tǒng)計軟件包中的單因素方差分析，P<0.05 表示差異顯著，P<0.01 表示差異極顯著。結(jié)果以平均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示。

3 實驗結(jié)果與分析

3.1 菠蘿蛋白酶酶解正交試驗

菠蘿蛋白酶酶解正交試驗結(jié)果見表3，方差分析結(jié)果見表4。

表3 菠蘿蛋白酶酶解玉米蛋白工藝正交試驗極差分析結(jié)果

表4 菠蘿蛋白酶酶解正交試驗方差分析結(jié)果

注：P<0.05 具有統(tǒng)計學(xué)意義

由表3得出酶解影響因素由大到小順序為：酶質(zhì)量分數(shù)、酶解溫度、酶解pH、酶解時間；由均值K得出最佳因素組合為A2B2C2D1，即菠蘿蛋白酶酶解玉米蛋白的最佳的酶解工藝為：在酶解溫度 50 ℃，菠蘿蛋白酶質(zhì)量分數(shù)3.0%，酶解pH 7.0 條件下酶解3 h。由表4得出影響因素與表3結(jié)果一致，且由p值可知，酶質(zhì)量分數(shù)與酶解時間對水解度的影響具有顯著性差異。

3.2 胰蛋白酶酶解正交試驗

胰蛋白酶酶解正交試驗結(jié)果見表5，方差分析結(jié)果見表6。

表5 胰蛋白酶酶解玉米蛋白工藝正交試驗極差分析結(jié)果

表6 胰蛋白酶酶解正交試驗方差分析結(jié)果

注：P<0.05 具有統(tǒng)計學(xué)意義

由表5可以得出酶解影響因素由大到小順序為：酶質(zhì)量分數(shù)、酶解溫度、酶解 pH、酶解時間；由均值K得出最佳因素組合為A3B1C2D2，即胰蛋白酶的最佳酶解工藝為：以胰蛋白酶質(zhì)量分數(shù)為2.0%，酶解溫度為40 ℃、酶解pH 8.0條件下酶解 3 h。

由表6中F值可知，影響因素與表5結(jié)果一致，且由P值可知，酶質(zhì)量分數(shù)與酶解時間對水解度的影響具有顯著性差異。

3.3 玉米肽酶解最佳工藝

取玉米蛋白適量，加入純水使底物質(zhì)量分數(shù)為10%，用質(zhì)量分數(shù)為10%的氫氧化鈉調(diào)節(jié)pH為7.0，加入質(zhì)量分數(shù)為3.0%的菠蘿蛋白酶時，在 50 ℃酶解3 h；待完成后用質(zhì)量分數(shù)為10%的氫氧化鈉調(diào)節(jié)pH為8.0，加入質(zhì)量分數(shù)為2%的胰蛋白酶在40 ℃、轉(zhuǎn)速 45～50 r/min 酶解3 h，煮沸，高溫殺酶 15 min,迅速冷卻至室溫。測定玉米肽的水解度為38.15%。

3.4 玉米肽-硒螯合工藝響應(yīng)面優(yōu)化試驗結(jié)果與分析

3.4.1 響應(yīng)面優(yōu)化玉米肽-硒螯合工藝結(jié)果

響應(yīng)面優(yōu)化螯合工藝結(jié)果見表7,其中X1為螯合時間，X2為螯合溫度，X3為玉米肽與硒摩爾比，X4為螯合pH。

表7 響應(yīng)面組合設(shè)計試驗及結(jié)果

續(xù)表7

采用Design Expert.V8.0.6 軟件對表中數(shù)據(jù)進行多項式擬合回歸，建立各因素與螯合率之間的多元二次響應(yīng)面回歸模型為：

Y=41.37+0.63X1+9.89X2-1.25X3+1.47X4-0.13X1X2+0.38X1X3+0.020X1X4-0.050X2X3+0.22X2X4

+2.44X3X4-2.54X12-2.34X22-6.22X32-13.50X42

表8 二次回歸模型的方差分析結(jié)果

注：P<0.05，表明差異顯著；P<0.01 表明差異極其顯著

由表8可知，模型擬合程度較好。

3.4.2 響應(yīng)曲面圖分析

響應(yīng)曲面的分析圖形是一個三維空間圖，可以直觀地反映出各自變量對響應(yīng)值的影響。在本試驗考察范圍內(nèi)，各因素對玉米肽-硒螯合率影響的二維等高線見圖3。

圖3 兩因素交互作用對玉米肽-硒螯合率的影響Fig. 3 Effect of two-factor interactions on chelation rate of corn peptide-selenium

圖3可以直觀地看出，螯合pH與螯合時間對螯合率的影響以及螯合pH與玉米肽-硒摩爾比這兩組中兩個因素交互作用較強，其余試驗因素之間交互作用均不顯著。試驗因素pH、肽-硒摩爾比是影響螯合率的主要因素。

3.5 保肝作用結(jié)果及分析

3.5.1 小鼠體重變化

在整個飼養(yǎng)周期內(nèi)，每2 d稱量一次體重，所有小鼠體重均呈增長趨勢，組間未見顯著差異。

3.5.2 玉米肽螯合硒元素對四氯化碳致肝損傷小鼠血清中 ALT、AST活力以及肝臟指數(shù)的影響

表9 玉米肽螯合硒元素對四氯化碳致肝損傷小鼠血清中 ALT、AST 活力以及肝臟指數(shù)的影響(n=10)

注： a 表示與四氯化碳模型組比較差異顯著(P<0.05)，b 表示與正常對照組比較差異顯著(P<0.05)，同列上標(biāo)的不同小寫字母表示差異極顯著(P<0.01)

由表9可以看出，與四氯化碳模型組相比，玉米肽組、玉米肽螯合硒元素組的血清中 ALT 活性、AST 活性、肝臟指數(shù)均極顯著降低(P<0.05)，且玉米肽螯合硒元素組的血清中 ALT 活性、AST 活性、肝臟指數(shù)較玉米肽組明顯降低(P<0.05)，與陽性對照水飛薊素保肝效果相當(dāng)。

4 結(jié)語

該實驗優(yōu)化了玉米肽酶解以及玉米肽螯合硒元素的工藝，確定了最佳工藝，并通過給藥四氯化碳肝損傷的小鼠，發(fā)現(xiàn)經(jīng)過螯合微量元素硒的玉米肽對肝損傷的改善作用增強。該研究證明了玉米蛋白可以具有更高的藥用價值，未來會有更廣闊的發(fā)展空間。