呂艷 李翀 葛善義 耿強(qiáng) 韓燕燕 蘭福 趙杰 鄭旭

天津中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院病理科（天津300381）

甲狀腺癌是內(nèi)分泌腺最常見的惡性腫瘤之一，甲狀腺乳頭狀癌（papillary thyroid carcinoma，PTC）是甲狀腺癌中最常見的病理類型，約占甲狀腺癌的80%［1-2］，早期篩查和準(zhǔn)確診斷對(duì)甲狀腺結(jié)節(jié)治療至關(guān)重要。

彩超是初步篩查甲狀腺結(jié)節(jié)的重要方法，統(tǒng)一的診斷標(biāo)準(zhǔn)采用甲狀腺影像報(bào)告與數(shù)據(jù)系統(tǒng)（thyroid imaging reporting and data system，TI -RADS）［3］。TI-RADS 4a 類結(jié)節(jié)是甲狀腺良惡性交界點(diǎn)，是臨床穿刺需求最高的結(jié)節(jié)。

粗針穿刺活檢（core needle biopsy，CNB）與射頻消融治療結(jié)合，在避免甲狀腺出血的同時(shí)，保證了充分的活檢組織量，同時(shí)實(shí)現(xiàn)了甲狀腺結(jié)節(jié)的初步治療，成為近年來備受關(guān)注的微創(chuàng)檢查和治療方法。

HBME-1，CD56，CK19 和galectin-3 被認(rèn)為是診斷PTC 最有價(jià)值的免疫組化指標(biāo)，但目前尚未有研究評(píng)估以上蛋白表達(dá)在TI-RADS 4a 類結(jié)節(jié)穿刺組織中意義和作用。

所以，本研究選取84 例TI-RADS 4a 類結(jié)節(jié)，采用粗針穿活檢病理檢查，采用免疫組化法檢測(cè)穿刺組織中HBME-1，CD56，CK19 和galectin-3 蛋白表達(dá)的差異，評(píng)估粗針穿刺活檢對(duì)明確TIRADS 4a 類結(jié)節(jié)性質(zhì)的作用，探索四種蛋白對(duì)甲狀腺TI-RADS 4a 類結(jié)節(jié)病理診斷的價(jià)值。

1 對(duì)象與方法

1.1 研究對(duì)象 選取天津中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院2016年4月至2018年4月收治的，經(jīng)超聲檢查為TI-RADS 4a 級(jí)結(jié)節(jié)181 例，共181 個(gè)結(jié)節(jié)，直徑＞0.5 cm，其中包括女145 例，男36 例，年齡范圍24～77 歲，中位年齡55 歲。

1.2 儀器與器械 采用PHILIPS clear value 550 彩色多普勒超聲診斷儀，配備高頻線陣探頭，探頭頻率10～13 MHz，按常規(guī)調(diào)至最佳狀態(tài)。穿刺針采用普利塞活檢針16G*150。

1.3 超聲診斷標(biāo)準(zhǔn) 目前，超聲診斷采用的TIRADS 系統(tǒng)［4］，分級(jí)和惡性風(fēng)險(xiǎn)評(píng)估如下：0 級(jí)：無結(jié)節(jié)，正常甲狀腺或彌漫性增生性甲狀腺；1 級(jí)：高度提示良性，以囊性為主，有聲暈；2 級(jí)：可能良性，邊緣界限清楚，以實(shí)性為主，回聲不均勻，等回聲或高回聲，蛋殼樣鈣化或粗鈣化；3 級(jí)：不確定，回聲均勻，低回聲，邊緣光整，實(shí)性，A ＞T，無其他提示惡性的超聲圖像；4 級(jí)：可能惡性，l～2 項(xiàng)提示惡性的超聲表現(xiàn)，如極低回聲、微鈣化、邊緣不光整，淋巴結(jié)異常，根據(jù)可能惡性的概率又分為4a，4b 和4c；5 級(jí)：高度提示惡性，超過3 項(xiàng)提示惡性的超聲表現(xiàn)，如極低回聲，微鈣化，邊緣不光整，邊界不清，淋巴結(jié)異常等。根據(jù)TI-RADS 分級(jí)系統(tǒng)，篩選出84 例TI-RADS 4a 級(jí)的甲狀腺結(jié)節(jié)。

1.4 穿刺方法 患者仰臥，枕頭墊肩并充分暴露頸前部甲狀腺區(qū)域。超聲觀察結(jié)節(jié)部位、深度并定位，常規(guī)消毒、鋪巾，以2%利多卡因局部麻醉，在超聲引導(dǎo)下經(jīng)皮穿刺甲狀腺結(jié)節(jié)，實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)進(jìn)針情況，選定病灶取材部位并迅速按下活檢槍扳機(jī)，退針、取下活檢條，放入10%甲醛溶液中固定。

1.5 HE 染色切片篩選病例 穿刺組織經(jīng)過固定、脫水、透明、浸蠟、包埋、切片，脫蠟至水，蘇木素染色，分化，伊紅染色，封片。最終由兩名高年資病理醫(yī)師診斷。單純結(jié)節(jié)性甲狀腺腫并且不伴有腺瘤樣結(jié)節(jié)的病例入選結(jié)節(jié)性甲狀腺腫組，單純?yōu)V泡性腺瘤并且不伴有甲狀腺腫的病例入選濾泡性腺瘤組。甲狀腺乳頭狀癌診斷標(biāo)準(zhǔn)依據(jù)：組織結(jié)構(gòu)異型性，如乳頭狀結(jié)構(gòu)，細(xì)胞形態(tài)異型性，如毛玻璃樣核、核溝、核/漿之比增大、核染色質(zhì)深等入選乳頭狀癌組。

1.6 免疫組化染色 穿刺組織經(jīng)過固定、脫水、透明、浸蠟、包埋、切片，脫蠟至水，高壓鍋抗原熱修復(fù)，H2O2處理去除過氧化物酶，一抗4 ℃孵育切片過夜，HBME-1（HBME-1，Origene）稀釋比例1∶150，CD56（UMAB83，Origene）稀 釋 比 例1∶200，CK19（UMAB2，Origene）稀 釋 比 例1∶200，galectin-3（9C4，Origene）稀釋比例1∶200，以內(nèi)源性過氧化物酶37 ℃孵育切片20 min，以酶標(biāo)羊抗小鼠/兔IgG 復(fù)合物37 ℃孵育切片20 min，DAB 染色，以蘇木素染液復(fù)染切片，封片。

免疫組化染色切片由1 名高年資病理醫(yī)師閱片。HBME-1 以細(xì)胞膜著色為陽性，CD56 以細(xì)胞膜中見到棕黃色顆粒分布為陽性，CK19 以細(xì)胞漿著色為陽性，galectin-3 以細(xì)胞漿著色為陽性。

染色強(qiáng)度評(píng)分：無色：0 分，淺黃色：1 分，棕黃色：2 分，棕褐色：3 分；陽性細(xì)胞百分比評(píng)分：每張切片選取10 個(gè)高倍視野，分別計(jì)數(shù)每一視野中陽性細(xì)胞百分比，其平均數(shù)作為陽性細(xì)胞百分比的結(jié)果，0～5%為0 分，6%～25%為1 分，26%～50%為2 分，51%～75%為3 分，76%～100%為4 分。

以染色強(qiáng)度與陽性細(xì)胞分值乘積來評(píng)價(jià)4 種蛋白的表達(dá)強(qiáng)度：0 分為陰性（-）表達(dá)，1～2 分弱陽性（+）表達(dá)，3～6 分為中等陽性（++）表達(dá)，＞6分為強(qiáng)陽性（+++）表達(dá)。2 分以上均按陽性表達(dá)對(duì)待。

1.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 應(yīng)用SPSS 17.0 統(tǒng)計(jì)軟件，組間比較采用χ2檢驗(yàn)，P＜0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 納入病例 由兩位高年資病理醫(yī)師診斷，結(jié)節(jié)性甲狀腺腫79 例，濾泡性腺瘤52 例，乳頭狀癌50 例，共計(jì)181 例。

2.2 TI-RADS 4a 類結(jié)節(jié)具備6 種提示惡性的超聲形態(tài)特點(diǎn)的對(duì)比（表1） 超聲具備一項(xiàng)提示惡性征象的病例：具有“形態(tài)不規(guī)則”特征的30 例，經(jīng)病理證實(shí)：乳頭狀癌20 例，占比66.67%，結(jié)節(jié)性甲狀腺腫8 例，占比26.67%，濾泡性腺瘤2 例，占比6.67%；具有“結(jié)節(jié)伴鈣化”特征的22 例，其中乳頭狀癌10 例，占比45.45%，結(jié)節(jié)性甲狀腺腫8 例，占比36.36%，濾泡性腺瘤4 例，占比18.18%；具有“實(shí)性結(jié)節(jié)”特征的24 例，其中乳頭狀癌10 例，占比41.67%，結(jié)節(jié)性甲狀腺腫4 例，占比16.67%，濾泡性腺瘤10 例，占比41.67%；具有“低回聲團(tuán)塊”特征的19 例，其中乳頭狀癌13 例，占比68.42%，濾泡性腺瘤3 例，占比15.79%；具有“縱橫比＞1”特征的11 例，其中乳頭狀癌9 例，占比81.81%，濾泡性腺瘤2 例，占比18.18%；具有“血流豐富”特征的7 例，其中乳頭狀癌5 例，占比71.43%，濾泡性腺瘤2 例，占比28.57%。

2.3 不同病理類型的蛋白表達(dá) 結(jié)節(jié)性甲狀腺腫，濾泡性腺瘤和乳頭狀癌的HBME-1、CD56、CK19 和Galectin-3 的免疫組化染色見圖1。結(jié)節(jié)性甲狀腺腫和濾泡性腺瘤呈現(xiàn)CD56 蛋白陽性表達(dá)，定位于細(xì)胞膜，而乳頭狀癌CD56 蛋白則表達(dá)缺失。另外，乳頭狀癌HBME-1、CK19 和Galectin-3 呈陽性表達(dá)，結(jié)節(jié)性甲狀腺腫和濾泡性腺瘤則呈現(xiàn)陰性表達(dá)。

HBME-1、CD56、CK19 和Galectin-3 在各個(gè)病理類型的陽性表達(dá)率見表2。

表1 TI-RADS4a 類結(jié)節(jié)的3 種不同病理類型的6 個(gè)超聲指標(biāo)的對(duì)比Tab.1 Six diagnosis index of ultrasound inTI-RADS4a nodules with 3 pathological types例

表2 3 種病理類型的4 個(gè)免疫組化指標(biāo)表達(dá)的對(duì)比Tab.2 4 IHC staining results of 3 pathological types 例

2.3.1 HBME-1 在三種病理類型中的表達(dá)HBME-1 定位于細(xì)胞膜，對(duì)甲狀腺微小乳頭狀癌的診斷作用尤其顯著。本研究結(jié)果顯示，結(jié)節(jié)性甲狀腺腫的HBME-1 蛋白陽性表達(dá)率為1.27%，濾泡性腺瘤表達(dá)率1.92%。與之形成鮮明對(duì)比的是乳頭狀癌的高表達(dá)，陽性表達(dá)率為90%，更多見的是勾勒乳頭狀外緣部分，沿腔緣頂端胞膜著色。

2.3.2 CD56 在三種病理類型中的表達(dá) CD56 是一種膜糖蛋白，主要表達(dá)于正常甲狀腺濾泡上皮，在甲狀腺乳頭狀癌中表達(dá)缺失。在本研究中，CD56 蛋白在結(jié)節(jié)性甲狀腺腫高表達(dá)，表達(dá)率是96.2%，顯著高于乳頭狀癌16%（P＜0.05）。

2.3.3 CK19 在三種病理類型中的表達(dá) CK19 蛋白定位于細(xì)胞質(zhì)，作為一種中間絲蛋白，存在于所有上皮細(xì)胞，并且在乳頭狀癌穩(wěn)定表達(dá)。本研究中，乳頭狀癌陽性率為98%，而結(jié)節(jié)性甲狀腺腫為8.86%，濾泡性腺瘤為7.69%，與乳頭狀癌差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。

2.3.4 Galectin-3 在三種病理類型中的表達(dá) Galectin-3 是β-半乳糖結(jié)合凝集素家族成員，可表達(dá)于甲狀腺乳頭狀癌和濾泡癌，本研究結(jié)果顯示：乳頭狀癌陽性率為98%，結(jié)節(jié)性甲狀腺腫和濾泡性腺瘤的陽性率分別是：3.80%、5.77%，與乳頭狀癌差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。

3 討論

甲狀腺癌為頸部最常見的惡性腫瘤之一，發(fā)病率逐年上升。準(zhǔn)確診斷甲狀腺結(jié)節(jié)對(duì)治療有重大意義。

圖1 HBME-1、CD56、CK19 和galectin-3 在三種病理類型中的免疫組化染色Fig.3 IHC staining of HBME-1、CD56、CK19 和galectin-3 in 3 pathological types

經(jīng)研究證實(shí)：70%的TI-RADS 4a 類結(jié)節(jié)為良性［5］，但是，TI-RADS 4a 類結(jié)節(jié)的潛在惡性風(fēng)險(xiǎn)使穿刺活檢成為必需的處理方案［6］。在臨床應(yīng)用中，超聲引導(dǎo)下細(xì)針穿刺活檢（fine needle aspiration biopsy，F(xiàn)NAB）和CNB 各有優(yōu)勢(shì)［7］。

目前，多個(gè)臨床實(shí)踐指南推薦FNAB 作為診斷甲狀腺結(jié)節(jié)首選方法，因?yàn)镕NAB 具有較高的靈敏度和特異性，然而，F(xiàn)NAB 局限于細(xì)胞學(xué)活檢，缺少組織學(xué)支持，對(duì)乳頭狀和濾泡性病變?cè)\斷存在誤診和漏診可能性［8］。與FNAB 相比，CNB 作為組織學(xué)活檢，能更大范圍的展現(xiàn)主要病理形態(tài)，但是，由于甲狀腺血供豐富，對(duì)患者行CNB后臨床觀察結(jié)果顯示：CNB 造成中量（出血區(qū)厚度6～10 mm）和大量出血（＞10 mm）的風(fēng)險(xiǎn)顯著大于FNAB［9］，出血風(fēng)險(xiǎn)高是限制CNB在病理診斷運(yùn)用的最重要因素。

射頻消融（radio frequency ablation）在甲狀腺穿刺活檢中的運(yùn)用不僅使TI-RADS 4a 結(jié)節(jié)檢查與治療密切結(jié)合，并且顯著降低了CNB 的出血風(fēng)險(xiǎn)，其原因主要是RFA 采用射頻電極使其周圍離子和極性分子產(chǎn)生震蕩摩擦，結(jié)節(jié)溫度升高，發(fā)生凝固性壞死，隨后被脫水、碳化和吸收［10］，與此同時(shí)，當(dāng)穿刺過程中結(jié)節(jié)周圍血管被刺破而出血時(shí)，則可以通過燒灼而止血，避免出血等并發(fā)癥。

乳頭狀癌是最常見的甲狀腺癌病理類型，占全部甲狀腺癌的85%～90%［11-12］。常規(guī)穿刺組織病理檢查與診斷，乳頭狀癌呈現(xiàn)乳頭樣結(jié)構(gòu)，毛玻璃樣細(xì)胞核，核內(nèi)包涵體，細(xì)胞核溝和細(xì)胞外砂礫體等病理學(xué)特點(diǎn)，但是由于穿刺組織取材有限，穿刺導(dǎo)致組織變形等原因，導(dǎo)致一部分病理診斷很困難，甚至漏診和誤診，并且，甲狀腺良性病變中伴有的良性乳頭狀增生，假乳頭樣增生等病變，與乳頭狀癌的乳頭結(jié)構(gòu)在HE 切片中也難以鑒別，所以，HBME-1、CD56、CK19 和galectin-3 等蛋白的免疫組化檢測(cè)成為乳頭狀癌診斷中必需的方法，對(duì)甲狀腺結(jié)節(jié)的鑒別診斷具有至關(guān)重要的作用。

本研究選取2016年4月至2018年4月天津中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院收治的181 例TI-RADS 4a級(jí)病例，行甲狀腺CNB，并結(jié)合免疫組化檢測(cè)HBME-1、CD56、CK19 和Galectin-3 的蛋白表達(dá)，探索甲狀腺TI-RADS 4a 類結(jié)節(jié)的正確診斷方法。

首先，研究結(jié)果表明：乳頭狀癌的CK19 陽性率為98%，而結(jié)節(jié)性甲狀腺腫為8.86%，濾泡性腺瘤為7.69%，與乳頭狀癌相比差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。由此可見，CK19 在乳頭狀癌的表達(dá)水平升高，是診斷乳頭狀癌的一個(gè)特異性指標(biāo)，但是在結(jié)節(jié)性甲狀腺腫和濾泡性腺瘤中也可有低水平表達(dá)。CK19 被認(rèn)為是鑒別診斷甲狀腺乳頭狀癌和乳頭狀增生非常敏感的標(biāo)記物。研究表明，CK19 在乳頭狀癌的表達(dá)率明顯高于甲狀腺良性病變。本研究中，CK19 在乳頭狀癌陽性表達(dá)率顯著高于結(jié)節(jié)性甲狀腺腫和濾泡性腺瘤（P＜0.05）。還有研究表明：CK19、CD56 聯(lián)合檢測(cè)對(duì)鑒別PTC 與假乳頭狀增生的甲狀腺良性病變有起重要的作用［13］。

其次，本研究中，乳頭狀癌Galectin-3 陽性表達(dá)率為98%，與結(jié)節(jié)性甲狀腺腫3.80%和濾泡性腺瘤5.77%之間差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。SANUVADA 等［14］的研究結(jié)論認(rèn)為：Galectin-3 蛋白異常表達(dá)是診斷乳頭狀癌的特異性指標(biāo)。進(jìn)一步的研究表明：Galectin-3 最重要的作用是鑒別乳頭狀癌與乳頭狀癌濾泡亞型以及甲狀腺濾泡癌。Galectin-3 通過抑制腫瘤細(xì)胞凋亡、促進(jìn)腫瘤細(xì)胞侵襲轉(zhuǎn)移、逃脫免疫監(jiān)視及參與血管生成等幾個(gè)方面的作用，參與腫瘤的生長(zhǎng)、轉(zhuǎn)移，在PTC 的生長(zhǎng)、轉(zhuǎn)移中扮演著重要角色。

此外，本研究中乳頭狀癌的HBME-1 陽性表達(dá)率為90%，與結(jié)節(jié)性甲狀腺腫1.27%和濾泡性腺瘤1.92%相比，差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。本研究結(jié)果提示：HBME-1 可以作為鑒別乳頭狀癌和良性甲狀腺增生和腫瘤的免疫標(biāo)記物。HBME-1 可用于區(qū)分甲狀腺乳頭狀癌和乳頭狀增生，在甲狀腺腫瘤血管形成、腫瘤細(xì)胞生長(zhǎng)及轉(zhuǎn)移中作用顯著［15］。

最后，本研究中，乳頭狀癌的CD56 陽性表達(dá)率為16%，顯著低于結(jié)節(jié)性甲狀腺腫陽性表達(dá)率96.20%（P＜0.05）和濾泡性腺瘤陽性表達(dá)率96.15%（P＜0.05），說明CD56 在甲狀腺良性病變中表達(dá)升高，在PTC 表達(dá)率降低，提示CD56 表達(dá)率降低甚至缺失有助于PTC 的病理診斷。CD56又稱為神經(jīng)細(xì)胞黏附分子，是免疫球蛋白超家族中的一個(gè)成員，表達(dá)于正常甲狀腺濾泡上皮，神經(jīng)元、星形細(xì)胞、雪旺細(xì)胞、肌管和自然殺傷細(xì)胞，CD56 對(duì)區(qū)分甲狀腺乳頭狀癌與甲狀腺良性病變的價(jià)值，其特異性和敏感性均達(dá)到100%。

本研究顯示：CNB 聯(lián)合HBME-1、CD56、CK19和galectin-3 免疫組化檢測(cè)，對(duì)TI-RADS4a 類結(jié)節(jié)病理診斷具有非常重要的價(jià)值和作用。然而，CNB 畢竟取材有限，對(duì)多發(fā)性的異質(zhì)性生長(zhǎng)的PTC，仍無法全面反映其病理形態(tài)。所以，多點(diǎn)位CNB，并結(jié)合HBME-1、CD56、CK19 和galectin-3 等基因水平檢測(cè)是進(jìn)一步提高乳頭狀癌診斷準(zhǔn)確性的重要保證。同時(shí)，與FNAB 相比，CNB 出血率較高，所以，術(shù)前應(yīng)注意篩查出血因素，術(shù)中應(yīng)選擇最佳穿刺路徑，術(shù)后也應(yīng)當(dāng)采用影像學(xué)方法動(dòng)態(tài)監(jiān)測(cè)患者出血征象。