孟慧杰 楊雪迎 覃紅娟 鄺浩斌 李艷 黎燕瓊 巫麗蘭 譚守勇

廣州市胸科醫(yī)院（廣州510095）

肺結(jié)核是經(jīng)呼吸道傳播的重要傳染病，同時(shí)也是細(xì)胞免疫相關(guān)性疾病，在結(jié)核菌侵襲與機(jī)體免疫防御的博弈中，炎癥性細(xì)胞因子作為各種免疫細(xì)胞的激活與強(qiáng)化的重要介質(zhì)在結(jié)核病的發(fā)生、發(fā)展中發(fā)揮重要作用［1-2］。在臨床抗結(jié)核治療過程中肝毒性是抗結(jié)核藥物的主要副作用之一，以異煙肼、利福平和吡嗪酰胺引起的藥物性肝損傷（durg induced liver injury，DILI）最常見［3-4］，而肝細(xì)胞的損傷與炎癥性細(xì)胞因子介導(dǎo)的肝內(nèi)炎癥反應(yīng)密切相關(guān)［5-6］，IL-1α、IL-1β、IL-4、IL-6、IL-8、IL-10、γ-干擾素（interferon-γ，IFN-γ）和腫瘤壞死因子-α（tumor necrosis factor -α，TNF-α）作為常見的炎癥細(xì)胞因子在結(jié)核病的發(fā)展及肝損傷中都起著非常重要的作用。本文通過監(jiān)測(cè)抗結(jié)核治療過程中護(hù)肝藥干預(yù)與不干預(yù)情況下藥物肝損傷的發(fā)生率及外周血清中上述炎癥細(xì)胞因子的血清濃度變化，以期為預(yù)測(cè)抗結(jié)核性藥物肝損傷的發(fā)生及盡早干預(yù)提供新的理論依據(jù)。

1 資料與方法

1.1 一般資料 自2014年8月至2016年11月，廣州市胸科醫(yī)院確診為初治肺結(jié)核患者210 例，納入患者中，男155 例，女55 例，患者年齡16～65 歲之間，平均（42.74±14.32）歲。納入標(biāo)準(zhǔn)：（1）所有病例符合中華醫(yī)學(xué)會(huì)結(jié)核分會(huì)制定的初治肺結(jié)核標(biāo)準(zhǔn)；（2）治療前均未使用抗結(jié)核藥物；（3）治療前患者的肝功能血清丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶、天冬氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶、堿性磷酸酶、總膽紅素、直接膽紅素，白蛋白及凝血功能均在正常范圍內(nèi)；（4）完成2 個(gè)月強(qiáng)化治療及資料完整者。本研究經(jīng)本院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)后實(shí)施，并嚴(yán)格按照要求履行本研究《知情同意操作規(guī)范》，確保全部患者知情同意并簽署知情同意書后方可納入。排除標(biāo)準(zhǔn)：（1）合并各種肝病的患者；（2）抗結(jié)核治療前肝功能異常；（3）艾滋病患者或使用免疫抑制劑者；（4）肺部感染，呼吸衰竭，營養(yǎng)不良者；（5）合并嚴(yán)重的心臟血管、腎臟、神經(jīng)、造血系統(tǒng)等疾病以及影響其生存的嚴(yán)重疾?。ㄈ缒[瘤，骨髓抑制等）；（6）精神病患者，對(duì)本類藥物過敏者；（7）孕婦、哺乳期婦女或者準(zhǔn)備受孕的育齡婦女。

1.2 分組治療 將所有患者隨機(jī)分均為護(hù)肝藥干預(yù)組和空白對(duì)照組，其中護(hù)肝藥干預(yù)組中隨機(jī)選取乙酰半胱氨酸（0.2 g，每天3 次）或雙環(huán)醇（0.25 g，每天3 次）治療，對(duì)照組不加任何護(hù)肝藥。所有患者按體重給予異煙肼、利福平、乙胺丁醇和吡嗪酰胺治療，分別于抗結(jié)核治療前、治療2 周末監(jiān)測(cè)肝功能，并留取抗結(jié)核治療前后的血清，若患者在2個(gè)月內(nèi)未發(fā)生肝損傷留取2 周末的血清，若患者在2個(gè)月內(nèi)發(fā)生肝損傷則留取肝損傷時(shí)的血清標(biāo)本。

1.3 方法

1.3.1 主要試劑與儀器 多功能液相芯片系統(tǒng)Luminex 200 為Luminex 產(chǎn) 品。Milliplex Catalog ID.HCYTOMAG-60k-08 試劑盒購自美國Merk-millipore 公司。

1.3.2 Luminex 200 液相芯片技術(shù)檢測(cè)細(xì)胞因子含量 從-80 ℃冰箱取出患者血清樣本，平衡至室溫后渦旋混勻，10 000 r/min，離心10 min 留取上清。標(biāo)準(zhǔn)品用去離子水倍比稀釋得到10 000、2 000、80、16 pg/mL 及3.2 pg/mL 五個(gè)梯度濃度的標(biāo)準(zhǔn)品，待測(cè)細(xì)胞因子的微珠與微珠稀釋液混合后加樣。加樣模板包含1 個(gè)空白對(duì)照孔（復(fù)孔加樣）、5 個(gè)標(biāo)準(zhǔn)曲線孔（復(fù)孔加樣）、低濃度和高濃度的質(zhì)控孔各1 個(gè)（復(fù)孔加樣）和若干個(gè)樣品孔。將混合好的微珠依次加入各反應(yīng)孔中（每孔的終體積為75 μL），封板膜封板后室溫避光振蕩孵育2 h，重復(fù)洗板2 次，加入25 μL 的反應(yīng)抗體進(jìn)行室溫避光孵育，1 h 后再加入25 μL 鏈霉素親和素，室溫避光孵育30 min 后洗板2 次，加入150 μL 鞘液避光振蕩使磁珠懸浮，在Luminex 儀器上讀取數(shù)據(jù)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，計(jì)算各樣品濃度。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS 19.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。定性資料采用χ2檢驗(yàn)，定量資料的比較符合正態(tài)性檢驗(yàn)采用配對(duì)t檢驗(yàn)，不符合正態(tài)檢驗(yàn)的計(jì)量資料采用秩和檢驗(yàn)。P＜0.05差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 護(hù)肝藥干預(yù)組與空白對(duì)照組肝損率比較入組總患者共210 例，退組77 例，治療2 周后護(hù)肝藥干預(yù)組和空白對(duì)照組的肝損傷發(fā)生率分別為14.77%和15.56%，兩組肝損率比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（χ2=0.17，P=0.68）。見表1。

表1 護(hù)肝藥干預(yù)組與空白對(duì)照組發(fā)生肝損率對(duì)比結(jié)果Tab.1 Comparison of liver damage rate between liverprotective intervention group and blank control group

2.2 護(hù)肝藥干預(yù)組與空白對(duì)照組在發(fā)生肝損傷時(shí)各細(xì)胞因子血清濃度比較 護(hù)肝藥干預(yù)組的TNF-α的中位數(shù)（14.05）較空白對(duì)照組（P50= 19.49）水平略低，而空白對(duì)照組中的IL-6、IL-8 和IL-10 較護(hù)肝藥干預(yù)組中的濃度呈倍數(shù)增高，護(hù)肝藥干預(yù)組與空白對(duì)照組的各細(xì)胞因子對(duì)比差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。見表2。

2.3 肝損組與非肝損組中個(gè)細(xì)胞因子變化特點(diǎn)比較 根據(jù)結(jié)核患者在治療過程中是否發(fā)生藥物性肝損傷，將患者分為肝損傷組和非肝損傷組，在非肝損組中，IFN-γ和IL-6 的治療后血清濃度較治療前明顯下降，而IL-10 的血清濃度較治療前則明顯升高，且差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）；而在肝損傷組中，IFN-γ、IL-6 和IL-4 于治療后血清濃度較治療前明顯下降，IL-10 和TNF-α的治療后血清濃度較治療前明顯升高，且差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）；IL-1α和IL-1β和IL-8 無論是在肝損組還是非肝損組于治療前后血清濃度未見明顯變化（P＞0.05）。見表3。

表2 護(hù)肝藥干預(yù)組和對(duì)照組在發(fā)生肝損傷時(shí)細(xì)胞因子對(duì)比結(jié)果Tab.2 Comparison of cytokines in liver injury between liver-protective intervention group and blank control group pg/mL

表3 抗結(jié)核治療過程中發(fā)生肝損傷時(shí)細(xì)胞因子變化情況Tab.3 Changes in cytokines during liver injury in anti-tuberculosis treatmentpg/mL

3 討論

肝臟是多數(shù)藥物代謝轉(zhuǎn)化的場(chǎng)所，在有關(guān)藥物性肝損傷的報(bào)道中，抗結(jié)核藥物所致的肝損傷居首位，發(fā)生率在5%～30%之間［7］?？菇Y(jié)核藥物引起的肝損害通常發(fā)生在2 個(gè)月以內(nèi)，服藥1 個(gè)月以內(nèi)尤其明顯［8］，目前對(duì)于抗結(jié)核治療期間是否需要進(jìn)行預(yù)防性保肝治療爭(zhēng)議較大，XU 等［9］的研究認(rèn)為在開始使用保肝藥物4 周后可預(yù)防性保肝治療。本文通過對(duì)比抗結(jié)核治療期間預(yù)防性護(hù)肝治療和不加護(hù)肝藥治療后的肝損率發(fā)現(xiàn)，護(hù)肝藥干預(yù)組的肝損傷發(fā)生率較空白對(duì)照組肝損率無明顯差異，這與楊雪迎等［10］報(bào)道結(jié)果相近。而從肝損發(fā)生的時(shí)間點(diǎn)可以看出護(hù)肝藥干預(yù)組發(fā)生肝損的時(shí)間點(diǎn)有部分延后性，同時(shí)，本研究分別對(duì)比了護(hù)肝藥物干預(yù)組和空白對(duì)照組發(fā)生肝損傷時(shí)各炎癥性細(xì)胞因子的水平，結(jié)果顯示兩組炎癥細(xì)胞因子均無明顯差異，說明無論是否加用護(hù)肝藥，其對(duì)肝損傷時(shí)的炎癥細(xì)胞因子變化影響不大。而在吳怡玲等［11］的研究認(rèn)為藥物性肝炎組的血清IL-10水平相對(duì)較低，IFN-γ水平相對(duì)較高，與本研究結(jié)果不同，可能與本研究的的肝損傷樣本量較小有關(guān)，后續(xù)需要更多的樣本量和實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證。

IFN-γ是控制結(jié)核分枝桿菌感染的一種關(guān)鍵性細(xì)胞因子，對(duì)控制結(jié)核感染的免疫防御至關(guān)重要。當(dāng)機(jī)體感染結(jié)核分枝桿菌后，IL-6 可以誘導(dǎo)保護(hù)性T 細(xì)胞的產(chǎn)生并激活T 細(xì)胞分泌IFN-γ，起到加強(qiáng)IFN-γ 的作用［1，12］。從本研究中可以看出無論是肝損組還是非肝損組，經(jīng)過抗結(jié)核治療后炎癥細(xì)胞因子IFN-γ和IL-6的水平均較治療前明顯降低，而IL-10 作為重要的免疫抑制因子，具有很強(qiáng)的抗炎作用，在抗結(jié)核治療后的血清水平較治療前明顯升高，這與張國英等［13］研究結(jié)果相似，說明2 周的抗結(jié)核治療后可明顯控制由結(jié)核分枝桿菌感染引起的炎癥反應(yīng)。而在梁曉燕等［14］的研究中，抗結(jié)核治療2 個(gè)月或6 個(gè)月末后的IL-4 的水平也顯著降低，與本研究結(jié)果不同的原因可能是隨著抗結(jié)核治療時(shí)間的持續(xù)，人體大量的結(jié)核分枝桿菌被清除或進(jìn)入休眠狀態(tài)，人體內(nèi)免疫應(yīng)答水平降低所致。

TNF-α作為細(xì)胞內(nèi)的促炎因子，在介導(dǎo)肝損傷的發(fā)病機(jī)制中也發(fā)揮重要作用，它一方面具有直接的細(xì)胞毒作用，引起肝細(xì)胞壞死；另一方面又可引起微循環(huán)障礙導(dǎo)致肝細(xì)胞壞死，同時(shí)誘導(dǎo)機(jī)體產(chǎn)生和釋放IL-6 和IL-8 釋放，并與IL-6 相互激發(fā)，引起級(jí)聯(lián)放大反應(yīng)，進(jìn)一步加重肝損傷［15-16］。對(duì)比本研究肝損組和非肝損組中各因子治療前后的變化，可以看出肝損組中的IL-4 的血清濃度較治療前明顯降低，而TNF-α較治療前明顯升高，說明隨著肝損傷的逐步進(jìn)展，IL-4 和TNF-α在抗結(jié)核性藥物性肝損傷過程中發(fā)揮重要作用，血清中IL-4 濃度的降低和TNF-α的升高提示了肝損傷的發(fā)生，也許可以通過監(jiān)測(cè)血清中IL-4 和TNF-α的變化趨勢(shì)來輔助預(yù)測(cè)肝損傷的發(fā)生。

此外，雖然有研究認(rèn)為IL-1 和IL-8 也參與了機(jī)體的抗結(jié)核免疫應(yīng)答，促進(jìn)抗原活化的T 細(xì)胞增殖，同時(shí)也參與巨噬細(xì)胞活化，但本研究中IL-8、IL-1α 和IL-1β 在抗肺結(jié)核治療中無論是否加用護(hù)肝藥，治療前后及肝損前后的血清水平均無明顯變化，這可能與IL-1 的基因多態(tài)性和結(jié)核控制好轉(zhuǎn)程度相關(guān)。

綜上所述，本研究通過對(duì)比抗結(jié)核治療前后肝損組與非肝損傷組各因子的血清濃度的變化發(fā)現(xiàn)，發(fā)生結(jié)核性肝損傷時(shí)血清中IL-4 的濃度明顯降低伴TNF-α濃度升高，為通過檢測(cè)炎癥細(xì)胞IL-4和TNF-α的動(dòng)態(tài)趨勢(shì)來預(yù)測(cè)并盡早地干預(yù)結(jié)核性肝損傷的發(fā)生提供了新的思路。但細(xì)胞環(huán)境及細(xì)胞因子之間的平衡與調(diào)節(jié)錯(cuò)綜復(fù)雜，它們互相影響并制約，后續(xù)需要更多的樣本進(jìn)行分析及動(dòng)物實(shí)驗(yàn)進(jìn)行探究。