唐敏 張玉高

西南醫(yī)科大學(xué)附屬醫(yī)院風(fēng)濕免疫科（四川瀘州646000）

系統(tǒng)性紅斑狼瘡（systemic lupus erythematosus，SLE）是一種累及多器官的自身免疫性疾病，導(dǎo)致多個(gè)器官的組織損傷，以狼瘡樣腎炎為最主要并發(fā)癥［1-2］。其具體發(fā)表機(jī)制目前尚未完全闡明。MIR155HG（MIR155 host gene，又名BIC）是長度為1 500 bp 的LncRNA，因其為miR-155的宿主基因，故而得名［3-4］。研究發(fā)現(xiàn)，MIR155HG在多種腫瘤患者中高表達(dá)，通過MYB轉(zhuǎn)錄因子轉(zhuǎn)錄激活得以表達(dá)上調(diào)，繼而導(dǎo)致許多抑癌基因表達(dá)下調(diào)［5］。然而，MIR155HG 對SLE的作用和機(jī)制尚無文獻(xiàn)報(bào)道。前期通過基因芯片發(fā)現(xiàn)LncRNA MIR155HG 在SLE 患者血清中的表達(dá)明顯高于正常對照組，本研究旨在研究LncRNA MIR155HG在SLE患者血清中的作用及意義。

1 對象與方法

1.1 研究對象 收集2015年1月至2017年12月于我院就診的80 例SLE 患者，年齡16～50 歲，平均（27±5）歲，其中男30 例，女50 例，排除腫瘤、感染等其他疾病?；顒悠诨颊撸⊿LEDAI 評分≥5分）35 例，穩(wěn)定期患者45 例（SLEDAI 評分＜5 分）。另選取同期健康體檢者40 例為對照組，年齡15～55 歲，其中男16 例，女24 例。通過本院倫理委員會批準(zhǔn)后所有研究對象均采集10 mL 靜脈血，并分離血清，置于-80 ℃冰箱備用，所有研究對象均簽署知情同意書。

1.2 血清總RNA 提取 采用TRIZOL（購自美國Invitrogen 公司）提取總RNA。將分離所得血清，置于冰上融化；取250 μL 血清樣品，加入750 μL Trizol，振蕩器混勻，靜置5 min；加入200 μL 氯仿，振蕩器混勻，靜置10 min；室溫下離心12 000 rpm、10 min，留取上清液并量取其體積，轉(zhuǎn)移至另一個(gè)無Rnase 的EP 管中；分別加入與上清液等體積的異丙醇，振蕩器振蕩混勻，室溫下靜置3 min；室溫下離心12 000 rpm 、10 min；倒出管內(nèi)液體，加用1 mL 75%乙醇；室溫12 000 rpm 離心2 min；倒出乙醇，并用Tip 槍頭將剩余液體吸干凈，晾干。每管中加入10 μL 無Rnase 的ddH2O，以能夠充分溶解RNA；用分光光度計(jì)測定總RNA 濃度及純度。

1.3 Real-time PCR 檢測LncRNA MIR155HG 的表達(dá) 采用TRIZOL（購自美國Invitrogen 公司）提取總RNA，逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)參照AMV 逆轉(zhuǎn)錄試劑盒說明［購自寶生物工程（大連）有限公司產(chǎn)品］，在20 μL 體系中加2 μg 總RNA 進(jìn)行cDNA 的合成。Real-time PCR 采用2xSYBR Green PCR Master Mix［寶生物工程（大連）有限公司產(chǎn)品］，取適量cDNA 作為摸板，引物濃度0.4 μmol/L，15 μL 體系進(jìn)行擴(kuò)增，每個(gè)待測樣本設(shè)置3 個(gè)平行樣，根據(jù)目標(biāo)基因設(shè)計(jì)合成相應(yīng)上下游引物進(jìn)行PCR 擴(kuò)增，引物由寶生生物工程（大連）有限公司合成，MIR155HG 上游引物：5′-ACGGTTGTGCGAGCAGAGAATCTA-3′，MIR155HG 下游游引物：5′-CTCATCTAAGCCTCACAACAACCT-3′），以U6 作為內(nèi)參照（U6 上游引物5′-CTCGCTTCGGCAGCACA-3′；下 游 引 物5′-AACGCTTCACGAATTTGCGT-3′）。PCR 反應(yīng)在定量PCR 反應(yīng)儀上進(jìn)行。PCR 反應(yīng)條件：95 ℃10 min；（95 ℃15 s；60 ℃30 s；72 ℃30 s）× 40 個(gè)循環(huán)。三次獨(dú)立實(shí)驗(yàn)后得到的數(shù)據(jù)運(yùn)用公式RQ = 2-ΔΔCt的方法進(jìn)行分析。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 采用SPSS 17.0 統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。計(jì)量資料采用t檢驗(yàn)或One-way ANOVA 分析，用表示；LncRNA MIR155HG 與各臨床病理參數(shù)之間的關(guān)系使用Chi-Square 檢驗(yàn)；ROC 分析評估LncRNA MIR155HG 作為SLE的生物標(biāo)志物潛能的分析；Pearson 線性回歸法分析LncRNA MIR155HG 的表達(dá)與SLEDAI 評分的相關(guān)性。以P＜0.05 為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 LncRNA MIR155HG在SLE患者血清中高表達(dá) QRT-PCR檢測LncRNA MIR155HG在SLE患者及健康對照組患者中的差異表達(dá)，結(jié)果提示與健康對照組比較，LncRNA MIR155HG 在SLE 患者中的表達(dá)明顯升高，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.001，見圖1A）；進(jìn)一步分析發(fā)現(xiàn)，LncRNA MIR155HG 在SLE 活動期患者組高于SLE 穩(wěn)定期患者組，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.001，見圖1B）。

圖1 LncRNA MIR155HG 在SLE 患者血清中的表達(dá)Fig.1 Expression of circulating LncRNA MIR155HG in SLE patients

2.2 活動期SLE 患者血清LncRNA MIR155HG的表達(dá)與SLEDAI 評分的相關(guān)性 Pearson 線性相關(guān)系數(shù)分析活動期SLE 患者血清LncRNA MIR155HG 的表達(dá)與SLEDAI 的相關(guān)性，結(jié)果提示血清LncRNA MIR155HG 的表達(dá)與SLEDAI 呈正相關(guān)（r=0.781，P＜0.001，圖2）。

圖2 活動期SLE 患者血清LncRNA MIR155HG 的表達(dá)與SLEDAI 的相關(guān)性Fig.2 The correlation between serum LncRNA MIR155HG levels and SLEDAI

2.3 活動期SLE 患者血清LncRNA MIR155HG的表達(dá)與合并狼瘡腎炎的關(guān)系 在45例活動期SLE患者中選取合并狼瘡腎炎者29例，無狼瘡腎炎患者16 例，合并狼瘡腎炎患者血清LncRNA MIR155HG的表達(dá)較無狼瘡腎炎患者明顯增高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.001）。見圖3。

圖3 活動期SLE 患者合并腎炎與無腎炎血清LncRNA MIR155HG 的差異表達(dá)Fig.3 Differential expression of serum LncRNA MIR155HG in active SLE patients with and without nephritis

2.4 血清LncRNA MIR155HG作為診斷SLE的生物標(biāo)志物的潛能 血清LncRNA MIR155HG作為診斷SLE患者血清標(biāo)志物的ROC曲線下面積為0.720（95%CI：0.601～0.840，P＜0.001，圖4A），當(dāng)取xx值時(shí)，靈敏度和特異性分別為81.3%（閾值15%）和90.2%（閾值30%）。血清LncRNA MIR155HG作為診斷是否合并狼瘡腎炎的ROC曲線下面積為0.915（95%CI：0.870～0.960，P＜0.001，圖4B），當(dāng)取xx值時(shí)，靈敏度和特異性分別為82.5%（閾值20%）和90.8%（閾值30%）。

圖4 受試者工作特征曲線（ROC）分析LncRNA MIR155HG 作為診斷SLE 血清標(biāo)志物（A）及是否合并狼瘡腎炎（B）的潛能Fig.4 Receiver operating characteristic（ROC）curve analysis of LncRNA MIR155HG for the discriminative ability of SLE patients vs healthy controls（A）and SLE with nephritis vs SLE without nephritis（B）

3 討論

近年來，國內(nèi)外學(xué)者曾從基礎(chǔ)到臨床，從環(huán)境感染到個(gè)體，從整體到細(xì)胞、蛋白、基因、表觀遺傳修飾等多個(gè)層次探討SLE 的發(fā)病機(jī)理，雖然對SLE的認(rèn)識取得了很大成就，但仍缺乏突破性進(jìn)展，其具體發(fā)病機(jī)制尚未明確［6-7］。長鏈非編碼RNA（LncRNA）是一類轉(zhuǎn)錄本長度超過200 個(gè)核苷酸，不編碼蛋白質(zhì)的功能性RNA 分子［8-9］。LncRNA 通過表觀遺傳修飾與轉(zhuǎn)錄后加工、調(diào)控及翻譯等多種機(jī)制在細(xì)胞生命活動中發(fā)揮重要功能［10］。LncRNA 與細(xì)胞的分化和激活亦存在關(guān)聯(lián)，且在先天性和獲得性免疫系統(tǒng)中，對免疫細(xì)胞的分化和激活發(fā)揮了重要的調(diào)節(jié)作用，進(jìn)而影響了系統(tǒng)性紅斑狼瘡（SLE）的發(fā)生發(fā)展［11-12］。對LncRNA 在SLE發(fā)生發(fā)展中的作用機(jī)制研究，可為尋找早期診斷該病的標(biāo)志物及藥物、生物治療靶點(diǎn)奠定基礎(chǔ)。MIR155HG 中包含有mi R-155 的前體序列。盡管目前對MIR155HG 在腫瘤中的表達(dá)差異與功能研究較少，但來自MIR155HG 的miR-155 在SLE 中的作用已有文獻(xiàn)報(bào)道［13］。研究發(fā)現(xiàn)，miR-155 在SLE患者尿中高表達(dá)，miR-155 的表達(dá)與蛋白尿及SLEDAI 相關(guān)［14］。miR-155 能夠減少SLE 患者的白細(xì)胞介素12（IL-21）的表達(dá)，調(diào)節(jié)自身抗體產(chǎn)生和炎癥反應(yīng)。然而關(guān)于MIR155HG 在SLE 患者中的表達(dá)及意義，目前國內(nèi)外尚未見相關(guān)報(bào)道。本研究發(fā)現(xiàn)與健康對照組比較，SLE 患者血清LncRNA MIR155HG 的表達(dá)水平顯著增高，SLE 活動期患者組高于SLE 穩(wěn)定期患者組，且LncRNA MIR155HG的表達(dá)與系統(tǒng)性紅斑狼瘡疾病活動度（SLEDAI）呈正相關(guān)。SLE 合并狼瘡腎炎患者血清LncRNA MIR155HG 的表達(dá)明顯高于無腎炎組。血清LncRNA MIR155HG 作為診斷SLE 患者血清標(biāo)志物的ROC 曲線下面積為0.720（95%CI：0.601～0.840，P＜0.001），靈敏度和特異性分別為81.3%和90.2%。血清LncRNA MIR155HG 作為診斷是否合并狼瘡腎炎的ROC 曲線下面積為0.915（95%CI：0.870～0.960，P＜0.001），靈敏度和特異性分別為82.5%和90.8%。以上研究提示血清LncRNA MIR155HG 在SLE 患者中高表達(dá)，與SLE 患者的活動度相關(guān)，LncRNA MIR155HG 有可能成為一個(gè)新的SLE 疾病活動度評估及預(yù)后判斷的分子標(biāo)志物。