李娟敏 羅駿 袁秋虹 鄧偉民，3

1廣東藥科大學(xué)（廣州510006）；2廣州中醫(yī)藥大學(xué)（廣州510405）；3廣州軍區(qū)廣州總醫(yī)院（廣州510010）

絕經(jīng)后骨質(zhì)疏松癥（postmenopausal osteoporosis，PMOP）是多發(fā)于絕經(jīng)后婦女，與女性年齡增長(zhǎng)密切相關(guān)的骨代謝疾病，主要是由于卵巢功能下降，雌激素分泌缺乏導(dǎo)致骨密度（bone mineral density，BMD）降低，易發(fā)骨折［1］。雌激素的細(xì)胞效應(yīng)由雌激素受體α（estrogen receptor α，ERα）和雌激素受體β（estrogen receptor β，ERβ）介導(dǎo)，研究表明［2］，ER 存在并表達(dá)于幾乎所有關(guān)系到骨代謝的細(xì)胞中，主要表達(dá)于生長(zhǎng)板的軟骨細(xì)胞和成骨細(xì)胞中，破骨細(xì)胞中表達(dá)極少，大體上分布于松質(zhì)骨，皮質(zhì)骨中表達(dá)相對(duì)較低。ERα和ERβ的結(jié)構(gòu)、功能及在細(xì)胞中的分布等均有一定差異，但在骨代謝中的作用均十分重要。

以往PMOP的藥物治療中戊酸雌二醇（estradiol valerate，EV）是臨床上雌激素替代療法（estrogen replacement therapy，ERT）中的常用藥，但近年來(lái)愈來(lái)愈多的臨床和實(shí)驗(yàn)研究均表明雌激素類(lèi)藥物的長(zhǎng)期使用存在諸多毒副作用，增加了乳腺癌、子宮內(nèi)膜癌、心血管疾病等發(fā)病率［3-4］，其應(yīng)用受到諸多爭(zhēng)議，因此ERT 已不再作為一線防治PMOP的主要手段，但可以雌激素作用機(jī)制為基礎(chǔ)，尋找更合適的類(lèi)雌激素樣藥物用于PMOP 的防治，如來(lái)源于中草藥中的植物雌激素、選擇性雌激素受體調(diào)節(jié)劑（selective estrogen receptor modulators，SERMs）等。雷洛昔芬（raloxifene，RLX）為第二代SERMs，與雌激素作用途徑類(lèi)似，研究發(fā)現(xiàn)［5］，RLX可以上調(diào)ERα mRNA 基因的表達(dá)，有效抑制破骨細(xì)胞骨吸收作用，減少骨丟失，此外，RLX 能降低絕經(jīng)后婦女椎體骨折的發(fā)生率，增加BMD，但其長(zhǎng)期使用會(huì)增加靜脈血栓塞的危險(xiǎn)性。因此，以中醫(yī)藥基礎(chǔ)理論為指導(dǎo)，從我國(guó)傳統(tǒng)中醫(yī)藥寶庫(kù)中探索更為經(jīng)濟(jì)適用的中藥或復(fù)方作為PMOP 防治的替代藥具有重大現(xiàn)實(shí)意義。

多年的動(dòng)物實(shí)驗(yàn)及臨床研究均表明［6-8］，中藥補(bǔ)腎壯骨顆?？梢蕴岣吖撬杞M織中類(lèi)固醇受體輔助激活因子3 和過(guò)氧化物酶體增殖物活化受體γ協(xié)同刺激因子-1α mRNA 表達(dá)水平，降低雌激素相關(guān)受體α 及其下游基因骨橋蛋白mRNA 表達(dá)水平，促進(jìn)成骨特異基因骨保護(hù)素、Runt 相關(guān)基因2的表達(dá)，抑制成脂肪特異性基因PPARγ2 的表達(dá)，提高去卵巢大鼠BMD，降低骨轉(zhuǎn)換水平及骨髓脂肪含量，此外，Wnt/β-catenin 信號(hào)通路可能參與其調(diào)節(jié)，表明本方在防治絕經(jīng)后及老年性骨質(zhì)疏松癥方面具有明顯療效。此前對(duì)ERs 的研究多集中于 基 因 及mRNA 層 面［9］，但 研 究 顯 示［10］，ERs mRNA 和蛋白在骨骼中的表達(dá)存在分離現(xiàn)象，故本研究旨在探討中藥復(fù)方制劑補(bǔ)腎壯骨顆粒對(duì)BMD 及ERα、ERβ兩種蛋白表達(dá)的影響，期望該方能在防治PMOP 的藥物中提供新的選擇。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 6 個(gè)月齡SPF 級(jí)SD 未育雌性大鼠60 只，由南方醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供，許可證號(hào)：SCXK（粵）2016-0041。所有SD 大鼠均在恒溫、恒濕的無(wú)菌環(huán)境中飼養(yǎng)，室溫控制在23 ～25 ℃，濕度55%～60%，標(biāo)準(zhǔn)大鼠飼料喂養(yǎng)，自由攝食飲水，通風(fēng)良好，適應(yīng)喂養(yǎng)7 d 后，建立去卵巢骨質(zhì)疏松模型。

1.2 實(shí)驗(yàn)藥物 補(bǔ)腎壯骨顆粒［廣州軍區(qū)廣州總醫(yī)院，批準(zhǔn)文號(hào)：廣制字（2011）F01008］由鹿角膠、龜甲膠、淫羊藿、骨碎補(bǔ)、水蛭、山藥、生地黃七味中藥制成，由廣州軍區(qū)廣州總醫(yī)院制劑中心提供。EV（補(bǔ)佳樂(lè)，1 mg/片，德國(guó)先靈公司生產(chǎn)，廣州先靈藥業(yè)有限公司分裝，國(guó)藥準(zhǔn)字J20030089）、RLX片（易維特，60 mg/片，美國(guó)禮來(lái)公司生產(chǎn)，禮來(lái)蘇州制藥有限公司分裝，國(guó)藥準(zhǔn)字J20030057）由廣州軍區(qū)廣州總醫(yī)院藥劑科提供。

1.3 實(shí)驗(yàn)主要試劑及儀器 Anti-Estrogen Receptor alpha 抗體（貨號(hào)：ab32063）及Anti-Estrogen Receptor beta 抗體（貨號(hào)：ab3576）均購(gòu)自abcam 公司，臺(tái)式高速離心機(jī)購(gòu)自SCIlogex 公司，磁力攪拌器購(gòu)自常州澳華儀器有限公司，電泳儀購(gòu)自北京六一儀器廠，低溫冰箱購(gòu)自德國(guó)西門(mén)子（Siemens AG）股份公司，掃描儀購(gòu)自佳能株式會(huì)社（Canon），灰度分析軟件采用Image J，多功能酶標(biāo)儀購(gòu)自美國(guó)Thermo 公司，美國(guó)GE 雙能X 線骨密度儀（型號(hào)：Prodigy）購(gòu)自通用電氣（中國(guó)）有限公司。

1.4 實(shí)驗(yàn)方法

1.4.1 造模與分組 大鼠適應(yīng)性喂養(yǎng)1 周后，隨機(jī)平均分成5 組：假手術(shù)組（SHAM 組）、模型組（OVX組）、中藥組（CM 組）、戊算雌二醇組（EV 組）、雷洛昔芬組（RLX 組），無(wú)菌條件下全部采用10%水合氯醛以3 mL/kg 體積腹腔注射麻醉，俯臥位固定，行背部?jī)蓚?cè)腰椎旁約1.5 cm 處縱行切口入腹，SHAM 組大鼠僅切除卵巢周?chē)倭恐窘M織后立即縫合［13］，其余組切除雙側(cè)卵巢并結(jié)扎兩側(cè)輸卵管。切口縫合后用無(wú)菌棉球蘸取75%醫(yī)用消毒乙醇擦拭傷口，并涂抹適量5%碘酊。術(shù)后連續(xù)3 d以40 KU/（kg·d）青霉素劑量行大鼠大腿肌肉注射，以防術(shù)后感染。

1.4.2 給藥方法及取材 持續(xù)觀察2 周后，各組大鼠生長(zhǎng)狀態(tài)良好，毛發(fā)光滑，活動(dòng)正常，無(wú)死亡情況。按照人與動(dòng)物體表面積比值折算得等效給藥劑量，各組大鼠每天定時(shí)灌胃給藥1 次，灌胃量為10 mL/（kg·d），中藥組臨床等效給藥量為2.5 g/（kg·d），EV 組給藥0.071 mg/（kg·d），RLX 組給藥量為4.29 mg/（kg·d），SHAM 組及OVX 組灌服等量生理鹽水。每周稱量1 次體質(zhì)量，根據(jù)體質(zhì)量變化調(diào)整給藥劑量。連續(xù)給藥3 個(gè)月，于最后一次給藥2 h 后，每組中隨機(jī)選取半數(shù)大鼠麻醉，在體測(cè)定其脊柱及股骨頸BMD，隨后腹主動(dòng)脈采血處死，收集血清并立即于-80 ℃超低溫冰箱保存?zhèn)溆?，取其左?cè)股骨，剔凈其上軟組織后，0.9%生理鹽水洗凈并用無(wú)菌紗布包裹放于-20 ℃保存，待測(cè)量各組股骨組織ERα及ERβ蛋白的表達(dá)，給藥6個(gè)月后采用相同方法處理剩余大鼠。

1.4.3 指標(biāo)檢測(cè) 骨密度儀檢測(cè)大鼠連續(xù)給藥3、6 個(gè)月后的活體BMD 值，重點(diǎn)檢測(cè)部位為脊柱和股骨頸。Western blot 法檢測(cè)左側(cè)股骨組織ERα、ERβ 蛋白表達(dá)，ELISA 法檢測(cè)血清雌二醇（E2）含量。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 本實(shí)驗(yàn)結(jié)果采用SPSS 19.0 進(jìn)行數(shù)據(jù)處理，以（）表示計(jì)量資料，采用單因素方差分析，組間兩兩比較分析用LSD 法，P＜0.05表示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 BMD 的測(cè)定 如表1所示，與SHAM 組相比，給藥后OVX 組脊柱和股骨頸的BMD 均下降，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05，P＜0.001），表明PMOP 大鼠造模成功。給藥3個(gè)月后，與OVX組相比，CM組脊柱BMD升高（P＜0.01），股骨頸BMD也升高，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。EV組及RLX組脊柱BMD略高于OVX組，但差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），股骨頸BMD 高于OVX 組（P＜0.05）。6 個(gè)月后，與OVX 組相比，各給藥組脊柱BMD 均明顯升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），CM 組股骨頸BMD 高于OVX 組（P＜0.05），其他兩用藥組BMD 與OVX組比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。與CM 組比較，兩階段給藥后EV 組及RLX 組的脊柱及股骨頸BMD 差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。由此可見(jiàn)，復(fù)方中藥補(bǔ)腎壯骨顆粒能在一定程度上逆轉(zhuǎn)大鼠去卵巢后導(dǎo)致的骨代謝失衡，維持破骨細(xì)胞與成骨細(xì)胞的平衡狀態(tài)，提高去勢(shì)大鼠BMD 值。

表1 各組BMD 結(jié)果Tab.1 The result of born mineral density in each group（n=6） ±s，g/cm2

表1 各組BMD 結(jié)果Tab.1 The result of born mineral density in each group（n=6） ±s，g/cm2

注：與SHAM 組相比，ΔP ＜0.05，ΔΔΔP ＜0.001；與OVX 組比較，*P ＜0.05，**P ＜0.01

3 個(gè)月6 個(gè)月組別脊柱BMD股骨頸BMD脊柱BMD股骨頸BMD SHAM 組0.185±0.0210.181±0.0200.202±0.0120.192±0.012 OVX 組0.168±0.003Δ0.164±0.004Δ0.176±0.005ΔΔΔ0.176±0.010ΔΔΔ CM 組0.188±0.008**0.180±0.010*0.190±0.007*0.188±0.005*EV 組0.175±0.0100.178±0.008*0.188±0.011*0.185±0.012 RLX 組0.177±0.0120.179±0.010*0.191±0.013*0.187±0.004

2.2 ERα、ERβ蛋白相對(duì)表達(dá)量的測(cè)定 如圖1、表2所示，兩階段給藥后與SHAM 組相比，OVX 組ERα、ERβ蛋白相對(duì)表達(dá)量均降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.001），各給藥組與OVX 組相比蛋白相對(duì)表達(dá)量均顯著提高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.001）。給藥3 個(gè)月后，EV 組及RLX 組兩種蛋白水平與CM 組比較的差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。給藥6 個(gè)月后，EV 組ERβ蛋白相對(duì)表達(dá)水平高于CM 組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01），RLX組ERα及ERβ蛋白相對(duì)表達(dá)量均低于CM 組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。

2.3 血清E2含量測(cè)定 如表3所示，與對(duì)應(yīng)SHAM 組比較，兩階段給藥后OVX 組血清E2含量均顯著降低（P＜0.01）。與OVX 組比較，各用藥組E2含量均有所升高（P＜0.05），其中給藥3 個(gè)月后RLX 組升高明顯（P＜0.01）。兩階段給藥后RLX組、EV 組與CM 組比較差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。6個(gè)月后各組大鼠血清E2含量較給藥3個(gè)月時(shí)均下降，可能是隨著大鼠年齡增長(zhǎng)，其機(jī)體功能下降所致。

表2 各組ERα、ERβ蛋白相對(duì)表達(dá)量Tab.2 Relative expression of ERα and ERβ proteins in each group（n=6） ±s

表2 各組ERα、ERβ蛋白相對(duì)表達(dá)量Tab.2 Relative expression of ERα and ERβ proteins in each group（n=6） ±s

注：與SHAM 組相比，ΔΔΔP ＜0.001；與OVX 組比較，***P ＜0.001；與CM 組比較，□P ＜0.05，□□P ＜0.01

組別3 個(gè)月6 個(gè)月SHAM 組OVX 組CM 組EV 組RLX 組ERα/β-actin 1.470±0.018 0.737±0.012ΔΔΔ 1.160±0.009***1.170±0.014***1.167±0.008***ERβ/β-actin 1.387±0.017 1.053±0.022ΔΔΔ 1.130±0.019***1.145±0.022***1.122±0.015***ERα/β-actin 0.567±0.022 0.297±0.021ΔΔΔ 0.475±0.019***0.468±0.015***0.450±0.014***□ERβ/β-actin 0.705±0.019 0.543±0.026ΔΔΔ 0.660±0.020***0.610±0.024***□□0.633±0.021***□

圖1 蛋白免疫印跡圖Fig.1 Protein imprinting figure

3 討論

早前研究已證明用6 個(gè)月齡去卵巢未孕雌鼠可成功模擬PMOP，其BMD、骨礦鹽含量、骨生物力學(xué)以及形態(tài)結(jié)構(gòu)與正常組大鼠均有顯著差異，符合骨質(zhì)疏松診斷標(biāo)準(zhǔn)［11-12］。我國(guó)傳統(tǒng)醫(yī)學(xué)認(rèn)為骨質(zhì)疏松癥是以腎虛為主要病機(jī)，補(bǔ)腎壯骨顆粒是由廣州軍區(qū)廣州總醫(yī)院研制的中藥復(fù)方制劑，其中龜甲膠、鹿角膠具有滋陰養(yǎng)血、補(bǔ)腎壯骨之功，淫羊藿、骨碎補(bǔ)可補(bǔ)腎陽(yáng)、強(qiáng)筋骨、祛風(fēng)濕，山藥補(bǔ)腎健脾益精，水蛭破血除瘀通經(jīng)，生地黃涼血補(bǔ)血、滋陰清熱。多年動(dòng)物實(shí)驗(yàn)及臨床研究均表明本復(fù)方制劑兼具補(bǔ)腎、健脾、祛瘀三位一體，其在防治絕經(jīng)后及老年性骨質(zhì)疏松癥方面有明顯療效［13-14］。

表3 各組血清E2 含量測(cè)定結(jié)果Tab.3 Results of determination of serum estradiol content in each group ±s，ng/mL

表3 各組血清E2 含量測(cè)定結(jié)果Tab.3 Results of determination of serum estradiol content in each group ±s，ng/mL

注：與SHAM 組比較，ΔΔP ＜0.01；與OVX 組比較，* P ＜0.05，**P ＜0.01

組別SHAM 組OVX 組CM 組EV 組RLX 組例數(shù)6 6 6 6 6 3 個(gè)月0.696±0.006 0.314±0.025ΔΔ 0.403±0.020*0.472±0.009**0.416±0.037*6 個(gè)月0.369±0.051 0.188±0.028ΔΔ 0.294±0.023*0.288±0.028*0.275±0.048*

本實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，EV 可有效提高去卵巢大鼠血清E2水平（P＜0.01，P＜0.05），提高股骨頸和脊柱BMD，并能提高ERα、ERβ 蛋白相對(duì)表達(dá)量，與以往研究結(jié)果一致［15-16］。此外，RLX 可提高大鼠股骨頸及脊柱BMD，顯著提高ERα、ERβ 蛋白表達(dá)水平（P＜0.001），并使血清E2水平升高（P＜0.05），可有效去卵巢大鼠的骨質(zhì)疏松癥狀改善。血清E2結(jié)果顯示，給藥后CM 組水平升高（P＜0.01，P＜0.05），與其他兩給藥組比較差異不明顯，表明中藥補(bǔ)腎壯骨顆?？赡苡写萍に丶?dòng)樣作用，對(duì)去卵巢大鼠雌激素水平的提高功同EV 及RLX。對(duì)BMD 的影響表明，中藥補(bǔ)腎壯骨顆粒持續(xù)給藥3個(gè)月后主要導(dǎo)致了大鼠脊柱部位BMD 的提高（P＜0.01），也可提高股骨頸部位BMD（P＜0.05），給藥6 個(gè)月后脊柱及股骨頸部位BMD 均提高（P＜0.05）。兩個(gè)階段CM 組與EV 及RLX 組的BMD 比較差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。與此同時(shí)，CM 組ERα、ERβ蛋白水平較OVX 組均有明顯提高（P＜0.001）；給藥6 個(gè)月后，與CM 組比較，RLX 組ERα、ERβ蛋白水平均低表達(dá)（P＜0.05），EV 組ERβ蛋白低表達(dá)（P＜0.01）。

由此可見(jiàn)，補(bǔ)腎壯骨顆?？捎行岣逧Rα、ERβ 蛋白表達(dá)，調(diào)整ERα/ERβ 比例，提高E2的同時(shí)，激動(dòng)雌激素受體信號(hào)通路，一定程度上恢復(fù)去卵巢大鼠骨代謝水平，提高大鼠BMD。在長(zhǎng)期給藥的基礎(chǔ)上，本方對(duì)兩種主要ER 亞型蛋白表達(dá)的提高較EV 及RLX 更具優(yōu)勢(shì)，可能規(guī)避這兩種藥物的諸多不良反應(yīng)及副作用。

從各方面綜合分析可知，大鼠體內(nèi)雌激素水平的變化一定程度上影響著ERα、ERβ 的分布及表達(dá)，BMD 水平也隨之變化。由各用藥組與OVX組的對(duì)比可知，EV、RLX 及補(bǔ)腎壯骨顆粒均可在一定程度上調(diào)節(jié)去卵巢大鼠骨代謝失衡的狀況，這與其在臨床上被用于防治絕經(jīng)后婦女骨質(zhì)疏松癥的機(jī)制一致。補(bǔ)腎壯骨顆粒是從我國(guó)傳統(tǒng)醫(yī)藥寶庫(kù)中經(jīng)過(guò)長(zhǎng)期實(shí)踐提煉出的中藥復(fù)方制劑，具有一定類(lèi)雌激素樣作用，并可上調(diào)雌激素受體蛋白的表達(dá)，有效增加BMD，較西藥安全有效，毒副作用小，且能兼顧整體，使五臟調(diào)和，在防治PMOP方面具有巨大潛能。但本研究仍存在許多不足，例如實(shí)驗(yàn)樣本數(shù)量不足、實(shí)驗(yàn)周期較長(zhǎng)等對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果均可產(chǎn)生一定影響，此外，中藥復(fù)方組分復(fù)雜，其中哪一種或幾種成分起主要作用等仍有待進(jìn)行更深入的研究。