廖玉婷 張嘉文 莫小東 陳靖 高敏 趙繼紅

南方醫(yī)科大學附屬東莞人民醫(yī)院（廣東東莞523000）

胃腸間質瘤（gastrointestinal stromal tumor）作為胃腸道最常見的間葉源性腫瘤，可發(fā)生在胃、小腸及大腸等部位。相關研究證實腫瘤細胞來源于胃腸道Cajal 細胞，但具體發(fā)病機制未明，且胃腸間質瘤異質性強，進一步探索其發(fā)病機制及挖掘潛在治療靶點極為重要［1］。MicroRNAs（miRNAs）是一類內源性單鏈非編碼RNA 分子，其包含19 ～22 個堿基，主要通過堿基互補配對結合于靶mRNA 的3'非翻譯區(qū)，導致靶mRNA 降解或翻譯抑制從而發(fā)揮其生物學功能［2-3］。近年已有研究證實了其在肺癌、乳腺癌、肝癌及胃癌等腫瘤中存在異常表達［4-7］，但關于miRNA 在胃腸間質瘤中的表達情況及microRNA-301a（miR-301a）在胃腸間質瘤中的作用鮮有報道，本研究旨在探索胃腸間質瘤中miRNA 表達譜變化及miR-301a 在胃腸間質瘤中的分子生物學功能，希望有助闡明miRNA在胃腸間質瘤發(fā)生發(fā)展中的作用，并初步探討miR-301a 作為潛在靶向治療分子的可能性，現(xiàn)報告如下。

1 資料與方法

1.1 一般資料本研究經(jīng)醫(yī)院倫理委員會討論同意，所納入患者均已簽署知情同意書。研究選取2014年2月至2017年12月在我院行胃腸道間質瘤切除手術治療的患者45 例，均確診為新發(fā)病例。其中男24 例，女21 例，年齡27～87 歲，平均（55.8±1.5）歲，中位年齡59.0 歲。收集患者術后腫瘤標本及癌旁正常組織，其中癌旁正常組織定義為距腫瘤旁約1 ～2 cm 或以上的組織，腫瘤標本及對應的癌旁正常組織經(jīng)我院兩位病理科醫(yī)師獨立檢查確認。記錄患者完整的臨床病理特征，并采用改良美國國立衛(wèi)生署分類系統(tǒng)（2008），根據(jù)患者胃腸間質瘤腫物的大小、部位、腫瘤細胞核分裂象及壞死情況進行惡性危險度分級：共分為高危級15 例、中危級6例、低危級10例和極低危級9例。

1.2 研究方法

1.2.1 芯片檢測隨機選取5 例胃腸間質瘤及癌旁正常組織，采用Trizol 試劑（Invitrogen 公司）提取總RNA，取200 ng 用于檢測差異表達的miRNA，miRNA 芯片采用miRNAV 18.0（廣州銳博），樣本經(jīng)過Cy3孵育，在Thermofisher雜交儀中進行隨機芯片雜交20 h，隨后利用GE 洗脫液A 和GE 洗脫液B 分別室溫洗脫非結合RNA，利用高敏掃描儀掃描檢測結果，芯片檢測獨立重復3次并取重合結果。

1.2.2 熒光定量PCR 反應選取40 例胃腸間質瘤及癌旁正常組織，采用Trizol 試劑（Invitrogen 公司）提取總RNA，對總RNA 進行逆轉錄反應合成cDNA，稀釋10 倍后利用Sybr Green（Takara 生物）檢測各miRNA 表達情況，總體系20 μL，反應條件及體積為：1 μL cDNA 模板與1 μL 引物相混合，加入10 μL Sybr Green 檢測液，與8 μL DEPC 水（Invitrogen 公司）混合，吹打混勻并上機，在37 ℃下反應10 min，升溫至95 ℃持續(xù)30 s，隨后降溫至65 ℃1 min，重復45 個循環(huán)數(shù)，隨后在65 ～95 ℃之間形成溶解曲線，U6 作為檢測內參，以2-ΔΔCt計算目的miRNA 相對表達量。

1.2.3 細胞培養(yǎng)與轉染胃腸間質瘤細胞系GIST-48 和GIST-T1 購自美國ATCC 公司，在含10%胎牛血清的DMEM 高糖培養(yǎng)基中（Gibco 公司）培養(yǎng)，溫箱溫度設定條件為37 ℃，利用Lipofectamine 3000（賽墨菲公司）將miR-301a 過表達試劑miR-301a mimic（廣州銳博）和空白對照mimic control（廣州銳博）轉染上述細胞，進行后續(xù)功能學實驗。

1.2.4 MTT 增殖實驗將前述實驗細胞與對照細胞消化，計數(shù)1 000 個細胞并鋪板，在含10%胎牛血清的DMEM 高糖培養(yǎng)基中培養(yǎng)，在細胞貼壁時（24 h）與48、72、96 h 時在培養(yǎng)基中加入MTT 試劑，37 ℃孵育2 h 之后，利用酶標儀計算細胞在450 nm 的吸光度，記錄4 個時間點并作比較。

1.3 統(tǒng)計學方法采用SPSS 19.0 進行統(tǒng)計學分析，計量資料以表示，兩組間的比較采用t檢驗或秩和檢驗。計數(shù)資料以構成比進行描述，兩組間的比較采用卡方檢驗。以P＜0.05 為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 miRNA 芯片檢測結果在5 例胃腸間質瘤患者的腫瘤組織及癌旁正常組織中進行miRNA 芯片檢測，共檢測到10 個差異表達的miRNA，其中miR-301a、miR-21、miR-19、miR-179 及miR-194 在胃腸間質瘤中表達明顯增高，而miR-146、miR-199a、miR-30、miR-217 及miR-421 表達明顯降低，其中又以miR-301a 的倍數(shù)變化最為明顯（P＜0.01）。見表1。

表1 miRNA 芯片檢測結果Tab.1 The detection results of miRNA chip

2.2 芯片結果驗證各選取上調或下調最明顯的3 個miRNA，利用剩余的40 例胃腸間質瘤患者的腫瘤組織及癌旁正常組織對基因芯片檢測的結果進行驗證，熒光定量PCR 的結果顯示，相對于癌旁正常組織，腫瘤組織中miR-301a、miR-21、miR-19的表達量顯著增高，而miR-146、miR-199a、miR-30表達顯著降低，miR-301a 的增高最為明顯（P＜0.01）。見表2。

表2 miRNA 芯片結果驗證Tab.2 The verification of miRNA chip results

2.3 臨床特征相關性分析收集患者臨床病理特征，根據(jù)miR-301a 表達量將患者分為miR-301a 高表達組和miR-301a 低表達組，結合患者臨床病理特征作卡方檢驗。結果提示，患者miR-301a 表達量與性別、年齡、腫瘤發(fā)病部位無關，與腫瘤危險度分級、腫物大小、腫物細胞核分裂象和壞死情況相關。見表3。

2.4 MTT 增殖實驗在兩種胃腸間質瘤細胞系中過表達miR-301a，并在細胞中轉入空載miRNA作為對照，MTT 實驗提示，在基線MTT 值（0 h）一致的情況下，過表達miR-301a 能顯著增強胃腸間質瘤細胞的增殖能力。見表4。

3 討論

胃腸間質瘤約占胃腸道間葉源性腫瘤的70%，其臨床特征不典型，多表現(xiàn)為腹部不適、消化道出血或腹部腫塊，少數(shù)患者可無明顯臨床癥狀，導致胃腸間質瘤早期診斷困難［8］。同時它是一種惡性潛能未定的腫瘤，其異質性極強，可表現(xiàn)為由良性到惡性的多層次變化，對傳統(tǒng)放、化療不敏感，為臨床治療帶來巨大挑戰(zhàn)［9］。外科手術和靶向藥物治療是目前胃腸間質瘤最主要的治療方式。然而，即使完整切除腫瘤且手術切緣經(jīng)病理證實為陰性，也有很大一部分患者在術后出現(xiàn)復發(fā)或轉移；約85%的胃腸間質瘤患者有KIT或PDGFRA基因突變，對靶向藥物伊馬替尼敏感，但在治療過程中部分患者仍產(chǎn)生原發(fā)性或繼發(fā)性耐藥，最終又出現(xiàn)復發(fā)或轉移［1］。故深入研究胃腸間質瘤發(fā)生發(fā)展的分子生物學機制、進一步發(fā)掘胃腸間質瘤的潛在治療靶點極為重要。

近年來，越來越多的研究證實了miRNA 在腫瘤發(fā)生發(fā)展中的重要作用，并在腫瘤細胞生物學表型中起重要的調控功能。如GE 等［10］通過miRNA 芯片的方法發(fā)現(xiàn)了胃癌組織中存在明顯的miRNA表達譜失常，以miR-31為代表的miRNA能顯著影響胃癌細胞的增殖和遷移；而KURODA 等［11］報道了結腸癌中miRNA 的表達失調，并初步證實了差異表達的miRNA 對結腸癌發(fā)生發(fā)展的影響，而關于胃腸間質瘤中是否存在miRNA 表達譜異常及其是否能影響胃腸間質瘤生長增殖則鮮有報道。本研究通過收集原發(fā)胃腸間質瘤患者的腫瘤及癌旁正常組織，首次通過基因芯片的方法發(fā)現(xiàn)了胃腸間質瘤中同樣存在miRNA 表達失調，其中以miR-301a 的表達失調最為顯著。因芯片結果僅由少部分病例的腫瘤與正常組織篩選得出，為進一步證明芯片結果，本研究采用熒光定量PCR 的方法對40 例臨床樣本進行驗證實驗。實驗結果證實了在胃腸間質瘤中確實存在多個miRNA 的表達譜異常，并以miR-301a 的表達異常最為明顯。有文獻提示對腫瘤發(fā)生發(fā)展起重要作用的miRNA常常與惡性臨床特征密切相關，如DING 等［12］報道胃癌組織中miRNA-27a 的表達量與胃癌分期、淋巴結轉移密切相關。結合文獻，本研究將腫瘤組織中miR-301a 表達水平分為高表達組與低表達組，應用統(tǒng)計學分析其與患者的臨床病理特征的關系。結果發(fā)現(xiàn)miR-301a 的表達水平與胃腸間質瘤的腫瘤危險度分級、腫物大小、腫瘤細胞核分裂象和壞死情況相關，而這些臨床病理特征與患者的預后和復發(fā)密切相關［13］。這進一步證實了我們的芯片結果，并提示miR-301a 可能在胃腸間質瘤的發(fā)生發(fā)展中發(fā)揮重要作用。這是國內外最早關于miR-301a 在胃腸間質瘤中表達水平的探索，并率先證實了其表達水平與胃腸道間質瘤的臨床特性特征密切相關，提示miR-301a 可能在胃腸道間質瘤的發(fā)病機制中發(fā)揮重要作用。

表3 miR-301a 與臨床病理特征相關性分析Tab.3 The correlation analysis between miR-301a and clinicopathological features例

表4 MTT 增殖實驗結果Tab.4 The results of MTT proliferation test±s，OD

表4 MTT 增殖實驗結果Tab.4 The results of MTT proliferation test±s，OD

注：與相應空載組相比較，*P ＜0.05

細胞名稱GIST-48 GIST-48 GIST-T1 GIST-T1處理方式過表達組空載組過表達組空載組0 h 0.12±0.01 0.13±0.03 0.15±0.08 0.15±0.11 24 h 0.38±0.15*0.20±0.08 0.42±0.20*0.19±0.16 48 h 0.69±0.63*0.42±0.15 0.73±0.49*0.42±0.21 96 h 0.98±0.85*0.61±0.22 1.05±0.45*0.68±0.75

最新的文獻［14］報道m(xù)iR-301a 是一種致癌miRNA，其過表達能提高細胞的活力，減少細胞凋亡。它與乳腺癌、前列腺癌、胰腺癌、黑色素瘤等多種腫瘤的發(fā)生、轉移、預后不良及耐藥有密切的關系［15-17］。如ZHENG 等［18］報道m(xù)iR-301a 在乳腺癌組織中表達明顯上調，miR-301a 的表達量升高提示患者存在較大的轉移風險；此外，多個研究團隊均發(fā)現(xiàn)miR-301a 在前列腺癌組織中過表達，miR-301a 的表達能促進癌細胞的周期轉化和增殖，直接影響了前列腺癌的復發(fā)和轉移［17-20］；在黑色素瘤中，miR-301a 同樣可通過調控TIMP2 介導黑色素瘤進展［21］。前述實驗已證實miR-301a 在胃腸間質瘤組織中高表達，為進一步探索其對腫瘤細胞增殖、侵襲和遷移的影響。本研究通過在兩株胃腸間質瘤細胞系中過表達miR-301a，并采用MTT實驗檢測細胞的增殖情況。結果提示miR-301a 能顯著促進兩株胃腸間質瘤細胞增殖，對胃腸間質瘤的生長進展具有重要推進作用，這與近年關于miR-301a 在腫瘤細胞的中的作用報道相一致。結合前述臨床樣本及臨床特征相關性分析結果，并配合實驗研究中關于細胞增殖水平的MTT 檢測，miR-301a 在胃腸道間質瘤發(fā)生發(fā)展中的重要作用進一步得到了證實。上述研究結果證實，miR-301a 是胃腸間質瘤潛在的促癌分子，其表達水平高低能顯著影響胃腸間質瘤的增殖和發(fā)展，是未來研究開發(fā)胃腸間質瘤靶向治療需關注的重要分子。

本研究不足之處在于：（1）在芯片結果的驗證中，收集的樣本皆為我院單中心樣本，無法排除單中心取材帶來的偏倚。（2）本研究僅進行了胃腸間質瘤細胞的體外增殖性試驗，未進行體內試驗驗證。未來相關研究應收集多中心臨床樣本，以進一步驗證miR-301a 在胃腸道間質瘤中的表達情況及其臨床意義，并重點關注miR-301a 在體內的作用，以進一步證實其在體內的促癌作用，并研發(fā)相關拮抗miR-301a 的藥物以抑制胃腸間質瘤細胞增殖生長。

綜上所述，胃腸間質瘤存在顯著的miRNA 表達失調，miR-301a 的過表達與胃腸間質瘤的危險度分級密切相關，并在體外實驗中能明顯促進胃腸間質瘤細胞生長增殖。未來的相關研究將進一步探討miR-301a 發(fā)揮生物作用的分子機制，miR-301a 有望作為新的分子靶點，為胃腸間質瘤患者提供一種新的治療策略。