馬曉萍 岳應(yīng)權(quán) 高曉勤

遵義醫(yī)藥高等?？茖W(xué)校組織胚胎學(xué)教研室（貴州遵義563006）

解脲脲原體（ureaplasma urealyticum，Uu）是人類泌尿生殖道感染的常見病原體［1］。研究表明，Uu 吸附于精子，可影響精子穿透卵細(xì)胞的能力和干擾精子與卵細(xì)胞受精并導(dǎo)致不育［2-3］。研究證實，人腎臟的雙羰基/L-木酮糖還原酶（dicarbonyl/L-xylulose reductase，DCXR）與附睪精子蛋白P34H是同一個蛋白［4］。精子DCXR（即P34H）是由附睪上皮分泌并定位于精子頂體部位的精子表面蛋白，精子在通過附睪時獲得DCXR 這種蛋白質(zhì)，在人類精子與卵子的相互作用非常重要，且DCXR蛋白表達(dá)下降與男性不育有關(guān)［5］；DCXR 的檢測可以作為診斷男性不育癥的一項重要指標(biāo)［6］。目前對Uu 感染是否會影響精子蛋白DCXR 表達(dá)尚未見相關(guān)報道，本研究探討Uu 感染對精子DCXR 蛋白的表達(dá)量和精子凋亡的影響，并對Uu 陽性不育者給予敏感抗生素治療，檢測治療前后的精子蛋白DCXR 表達(dá)和精子凋亡率，以闡明Uu 感染引起男性不育的機(jī)制，為臨床診斷和治療男性不育的療效的判斷提供有效的實驗依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑Percoll 分離液（美國Pharmacia公司）；DCXR 小鼠單克隆抗體（美國Abcam 公司）；Alexa Fluor?594 標(biāo)記山羊抗小鼠IgG（北京中山金橋生物技術(shù)有限公司）；DAPI 染色液（美國Abcam公司）；Uu 培養(yǎng)鑒定試劑盒（珠海迪爾公司）；TUNEL 細(xì)胞凋亡檢測試劑盒（武漢博士德公司）；精子細(xì)胞BWW 培養(yǎng)液（美國Toscience 公司）；RIPA裂解液和BCA 蛋白濃度測定試劑盒（武漢博士德生物有限公司）；PVDF 膜和ECL 化學(xué)發(fā)光試劑盒（Amersham Bioscience 公司）

1.2 標(biāo)本來源研究對象為2015年7月至2016年11月貴州醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院門診就診男性不育癥患者145 例。年齡23～42 歲，均為婚后1年以上不育（經(jīng)婦科檢查排除女方不孕因素），無外傷、遺傳性疾病家族史及性功能障礙病史，生殖系統(tǒng)無器質(zhì)性病變，精漿及血清抗精子抗體陰性，精液細(xì)菌培養(yǎng)陰性，血清衣原體抗體陰性。本研究經(jīng)醫(yī)院倫理學(xué)委員會批準(zhǔn)，且患者知情同意。

1.3 精液采集與分析無菌采集精液，待完全液化后，進(jìn)行精液常規(guī)檢查（輔助精子分析儀型號：CASASQH-Ⅲ型），檢測分析精液常規(guī)各項指標(biāo)（精子濃度、精子活力、精子形態(tài)等）。嚴(yán)格按試劑盒操作說明書進(jìn)行，對精液進(jìn)行Uu 培養(yǎng)鑒定及藥敏試驗，采用Uu 敏感的抗生素對Uu 陽性者進(jìn)行治療，停藥6 周后待Uu 培養(yǎng)轉(zhuǎn)為陰性后再次檢測精液質(zhì)量。

1.4 Western blot 檢測精子DCXR 蛋白表達(dá)精液標(biāo)本采用密度梯度法離心分離出成熟精子。收集精子并懸浮洗滌2 次，顯微鏡下調(diào)整精子濃度為2.0×107/mL。加入RIPA 裂解液提取細(xì)胞蛋白，BCA 蛋白濃度測定試劑盒測定蛋白濃度，提取蛋白50 μg 經(jīng)12% SDS-PAGE 電泳分離后，轉(zhuǎn)至PVDF 膜，TBS 封閉后加小鼠單克隆抗體DCXR（1∶1 000 稀釋），4 ℃緩慢振蕩過夜；次日加HRP 標(biāo)記的酶標(biāo)二抗（1∶10 000 稀釋），洗膜后ECL 顯影，凝膠成像系統(tǒng)掃描。蛋白的相對表達(dá)量用目標(biāo)蛋白積分吸光度與內(nèi)參蛋白β-actin 吸光度比值表示。

1.5 免疫熒光檢測DCXR 蛋白在精子的定位多聚賴氨酸載玻片上滴加獲能后的精子懸液并室溫干燥，4%多聚甲醛固定，血清封閉液進(jìn)行封閉。加入小鼠單克隆抗體DCXR（1∶400 稀釋），4 ℃過夜。洗滌后加Alexa Fluor?594 標(biāo)記山羊抗小鼠Ig（G1∶100 稀釋）室溫孵育。DAPI 染色孵育后PBS漂洗后封片。用激光共聚焦顯微鏡觀察并照相，分別隨機(jī)選取多個視野攝片，計數(shù)精子DCXR 標(biāo)記陽性率，每組計數(shù)200 個精子。

1.6 精子DNA 鏈完整性的檢測（TUNEL 法）嚴(yán)格按試劑盒操作說明書進(jìn)行TUNEL 細(xì)胞凋亡檢測。4%多聚甲醛室溫下固定精液涂片，PBS 洗滌并用3% H2O2于室溫處理；滴入稀釋的ProteinaseK于標(biāo)本片，TBS 洗滌。標(biāo)本片加脫氧核糖核苷酸末端轉(zhuǎn)移酶（TdT）和地高辛標(biāo)記的脫氧核苷酸（DIG-dUTP）的標(biāo)記液標(biāo)記，DAB 顯色后光鏡鏡檢。在上述實驗步驟中，標(biāo)本片不加TdT 酶的作為陰性對照組。精子凋亡為精子頭部呈棕黃色染色為陽性。計算精子凋亡率，計數(shù)精子200 個以上。精子凋亡率（%）=（凋亡的精子數(shù)/精子總數(shù)）×100%。

1.7 統(tǒng)計學(xué)方法結(jié)果以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示。用SPSS 17.0 統(tǒng)計軟件包對實驗數(shù)據(jù)進(jìn)行ANOVA 單因素方差分析檢驗，P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 Uu 感染陽性不育組與Uu 陰性不育組的精液常規(guī)檢測結(jié)果145 例不育組中，精液Uu 培養(yǎng)結(jié)果陽性47 例，陽性率32.41%。Uu 陽性不育組與Uu 陰性不育組精液分析結(jié)果見表1。對Uu 陽性者給予Uu 敏感的抗生素治療，停藥6 周后，Uu 培養(yǎng)陰性后再次進(jìn)行精液常規(guī)檢測。治療后Uu 陽性不育組的精子密度、精子活動率和精子正常形態(tài)率均明顯高于Uu 陽性不育組治療前（P＜0.05）。

表1 Uu 陽性不育組與Uu 陰性不育組的精子密度、精子活動率和精子正常形態(tài)率Tab.1 Sperm concentration，Spermmotility and normal morphology rate of sperm in infertile group with negative and positive culture for Uu ±s

表1 Uu 陽性不育組與Uu 陰性不育組的精子密度、精子活動率和精子正常形態(tài)率Tab.1 Sperm concentration，Spermmotility and normal morphology rate of sperm in infertile group with negative and positive culture for Uu ±s

注：與Uu 陰性不育組比較，*P ＜0.05；與Uu 陽性不育組（治療前）比較，#P ＜0.05

組別Uu 陰性不育組Uu 陽性不育組（治療前）Uu 陽性不育組（治療后）例數(shù)98 47 47精子密度（×106/mL）85.14±11.26 64.32±8.15*72.78±9.29#精子活動率（%）56.58±6.31 31.12±4.94*42.49±6.29#精子正常形態(tài)率（%）28.63±4.05 13.36±3.87*23.68±5.75#

2.2 Uu 感染陽性不育組與Uu 陰性不育組的精子DCXR 蛋白的表達(dá)結(jié)果顯示不育各組中精子多數(shù)存在DCXR 蛋白的表達(dá)，Uu 陽性不育組精子DCXR/β-actin 平均光密度均低于與Uu 陰性不育組（P＜0.05），見圖1。對Uu 陽性者進(jìn)行Uu 敏感的抗生素治療，治療后Uu 陽性不育組的DCXR/β-actin 平均光密度明顯高于治療前Uu 陽性不育組（P＜0.05）。

2.3 Uu 感染陽性不育組與Uu 陰性不育組的精子DCXR 蛋白定位結(jié)果顯示Uu 陽性不育組中多數(shù)精子頂體處DCXR 表達(dá)不均勻，熒光強(qiáng)度較弱，熒光陰性的精子數(shù)較多，見圖2。對Uu 陽性者進(jìn)行Uu 敏感的抗生素治療，治療后Uu 陽性不育組的精子DCXR 陽性率明顯高于治療前Uu 陽性不育組，經(jīng)統(tǒng)計學(xué)分析差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）。

2.4 Uu 感染陽性不育組與Uu 陰性不育組的精子凋亡率結(jié)果顯示Uu 陽性不育組的精子凋亡率高于與Uu 陰性不育組（P＜0.05），見圖3。對Uu 陽性者進(jìn)行Uu 敏感的抗生素治療，治療后Uu 陽性不育組的精子凋亡率明顯低于治療前Uu 陽性不育組，經(jīng)統(tǒng)計學(xué)分析差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）。

圖1 Western blot 檢測DCXR 蛋白在精子的表達(dá)（A）及相對表達(dá)量（B）Fig.1 Detection of DCXR protein expression by Western blot（A）and the relative expression（B）

圖2 免疫熒光檢測精子DCXR 蛋白的定位（A）及精子DCXR 陽性率（B）Fig.2 The localization of DCXR on human spermatozoa by immunofluorescent staining（A）and DCXR positive rate on human spermatozoa（B）

圖3 TUNEL 法檢測凋亡精子（A）及精子凋亡陽性率（B）Fig.3 TUNEL method to detect sperm apoptosis（A）and Tunel-positive rate on human spermatozoa（B）

2.5 精子DCXR 蛋白表達(dá)量和精子DCXR 陽性率與精子凋亡率的相關(guān)性相關(guān)性分析提示精子DCXR蛋白表達(dá)量與精子凋亡率呈負(fù)相關(guān)（r=-0.427，P＜0.01）；精子DCXR 陽性率與精子凋亡率呈負(fù)相關(guān)（r=-0.562，P＜0.01）。見圖4。

圖4 精子DCXR 蛋白表達(dá)量和精子DCXR 陽性率與精子凋亡率的相關(guān)性Fig.4 Correlation among the DCXR protein expression，the percentage of DCXR-positive rate and Tunel-positive rate on human spermatozoa

3 討論

解脲脲原體是引起男性泌尿生殖道感染的常見病原體，常寄居于泌尿生殖道，引起非淋菌性尿道炎、慢性前列腺炎、附睪炎等，導(dǎo)致男性不育［7-8］。精子在附睪內(nèi)達(dá)到功能成熟從而獲得受精能力，并依賴附睪合成和分泌的蛋白產(chǎn)生作用［9］。研究報道，DCXR 可作為一種“兼職蛋白”在人附睪組織中發(fā)揮其酶活性和蛋白結(jié)合特性，DCXR 既可作為精子在附睪達(dá)到成熟的標(biāo)志物［5］，同時還具有L-木酮糖還原酶和雙羰基還原酶活性，可殺滅附睪液中的細(xì)菌［10］。研究表明DCXR 還可表達(dá)在附睪上皮細(xì)胞的細(xì)胞核內(nèi)，具有清除附睪液及精漿中的某些對精子造成損傷的有毒物質(zhì)的作用［10］。本文對Uu 陽性不育者給予敏感抗生素治療，并對治療前后的精子蛋白DCXR 表達(dá)和精子凋亡率進(jìn)行檢測分析，探討Uu 感染對精子蛋白DCXR 表達(dá)和精子凋亡率的影響。

本研究顯示Uu 陽性不育組的精子DCXR 蛋白表達(dá)量明顯低于Uu 陰性不育組，對Uu 陽性者進(jìn)行Uu 敏感的抗生素治療，治療后Uu 陽性不育組的精子DCXR 蛋白表達(dá)量明顯高于治療前Uu 陽性不育組。通過免疫熒光方法清晰顯示DCXR 定位于人精子頂體帽區(qū)，Uu 陽性不育組的DCXR 蛋白在精子頂體處的熒光強(qiáng)度和陽性率大幅減弱。進(jìn)行Uu 敏感的抗生素治療后，Uu 陽性不育組部分精子DCXR 陽性率升高。從結(jié)果可知，Uu 感染陽性不育者經(jīng)治療后其精子DCXR 蛋白表達(dá)量和精子DCXR 陽性率均較治療前升高。研究已證實Uu 感染可廣泛引起睪丸病理損傷并影響睪丸功能，干擾精子產(chǎn)生過程［11-12］。筆者推測Uu 感染可能會引起附睪功能紊亂并導(dǎo)致DCXR 蛋白表達(dá)減少和精子DCXR 陽性率的下降從而引起不育患者生育能力低下；在對Uu 感染不育患者運用抗感染治療后，精子DCXR 蛋白表達(dá)有明顯的升高。

Uu 感染可造成生精細(xì)胞從曲精小管嚴(yán)重脫落，生精細(xì)胞結(jié)構(gòu)破壞，還可引起生殖系統(tǒng)中吞噬細(xì)胞增多，產(chǎn)生一系列氧自由基與過氧化產(chǎn)物，誘導(dǎo)生精細(xì)胞凋亡［13-14］。本文實驗結(jié)果顯示Uu 陽性不育組的精子凋亡率高于與Uu 陰性不育組，經(jīng)過Uu 敏感的抗生素治療后，Uu 陽性不育組的精子凋亡率明顯低于治療前。說明Uu 代謝產(chǎn)物和一系列氧自由基對精子具有毒害作用，可誘導(dǎo)精子發(fā)生凋亡，在對Uu 感染不育患者運用抗感染治療后，精子凋亡率有明顯的降低。

同時，本實驗結(jié)果還顯示精子DCXR 蛋白表達(dá)量和精子DCXR 陽性率分別與精子凋亡率呈負(fù)相關(guān)，結(jié)果說明精子DCXR 蛋白的表達(dá)可能還發(fā)揮了其雙羰基還原酶的活性，能夠清除Uu 感染后精漿中的某些毒性物質(zhì)，對精子起一定的保護(hù)作用，促進(jìn)精子的成熟并減少精子凋亡率。

從結(jié)果可見，Uu 感染可引起附睪功能紊亂導(dǎo)致精子蛋白DCXR 表達(dá)量降低，Uu 還可通過其代謝產(chǎn)物和氧自由基誘導(dǎo)精子發(fā)生凋亡導(dǎo)致精子凋亡率增高，從而引起男性不育；同時，精子DCXR蛋白的表達(dá)還可能具有清除UU 感染后精漿中的某些毒性物質(zhì)，對精子起保護(hù)和減少精子凋亡率的作用。Uu 陽性不育者通過敏感抗生素治療后，可拮抗Uu 對精子結(jié)構(gòu)的損傷，減少精子蛋白DCXR 的缺失和精子凋亡的發(fā)生，促使精子蛋白DCXR 含量上升和降低精子凋亡率。本研究表明，Uu 感染引起精子DCXR 蛋白的表達(dá)量減少和精子凋亡率的增高，可能Uu 感染造成男性不育的重要原因之一。檢測精子DCXR 蛋白表達(dá)和精子凋亡率為男性不育癥的診斷和藥物療效的判斷提供有效的實驗依據(jù)。