李莎莎 郭曉莉 杜燕

西安醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院腎病血液科（西安710077）

高尿酸血癥是一種以尿酸合成增多和（或）尿酸排泄障礙所致的代謝性疾病［1］。據(jù)統(tǒng)計在不同人群高尿酸血癥患病率約2.3%～41.4%，已經(jīng)成為嚴(yán)重威脅人類身體健康的公共衛(wèi)生問題，應(yīng)該引起人們的高度重視［2］。近年來，國內(nèi)外大量流行病學(xué)資料顯示高尿酸血癥是腎臟疾病發(fā)生、發(fā)展的獨立危險因素，其風(fēng)險性甚至高于蛋白尿［3］。腎小球硬化是多種慢性腎臟疾病終末期的最后歸途，腎小球系膜細(xì)胞是腎小球固有細(xì)胞中最活躍的細(xì)胞成分，具有增殖和表型轉(zhuǎn)化的功能，在腎小球病變從早期炎癥反應(yīng)向晚期硬化發(fā)展中起重要作用［4］。而溶解狀態(tài)的尿酸能否通過非依賴尿酸鹽結(jié)晶途徑誘導(dǎo)腎小球系膜細(xì)胞發(fā)生增殖及表型轉(zhuǎn)化參與腎小球硬化，國內(nèi)外相關(guān)報道較少。

本研究擬通過體外培養(yǎng)大鼠腎小球系膜細(xì)胞，給予不同濃度尿酸刺激，觀察腎小球系膜細(xì)胞增殖、細(xì)胞形態(tài)，超微結(jié)構(gòu)改變及表型轉(zhuǎn)化特異性指標(biāo)表達情況，以期為高尿酸性腎病發(fā)病機制提供新的理論依據(jù)。

1 材料及方法

1.1 儀器與試劑大鼠腎小球系膜細(xì)胞（HBZY-1）購自中國典型物保藏中心，DMEM 培養(yǎng)基，非布司他均購自美國Invitrogen公司。尿酸購自美國Sigma公司，反轉(zhuǎn)錄試劑盒，PCR 引物購自Takara 寶生物工程（大連）有限公司，PCR 擴增儀，凝膠成像分析儀均購自Bio-Rad 公司。TECNAIG2F30 S-Twin 型透射電鏡購自荷蘭Philips-FEI 公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 細(xì)胞培養(yǎng)大鼠腎小球系膜細(xì)胞（HBZY-1）貼壁培養(yǎng)于含有10%胎牛血清的DMEM 培養(yǎng)基中，于5% CO2、37 ℃飽和濕度的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。根據(jù)細(xì)胞狀態(tài)及生長速度決定換液時間，一般2～3 d 更換一次培養(yǎng)基，待貼壁細(xì)胞長至80%～90%融合時，以0.25%胰酶和0.02%EDTA 消化傳代，選擇對數(shù)生長期細(xì)胞用于實驗。

1.2.2 實驗分組根據(jù)尿酸不同濃度分組為：不同濃度尿酸組（0、0.05、0.1、0.2、0.4 mmol/L）組；根據(jù)0.2 mmol/L 的尿酸干預(yù)不同時間分組（0、24、36、48 h）。

1.2.3 細(xì)胞一般形態(tài)觀察分別在倒置顯微鏡及透射電鏡下觀察0.4 mmol/L UA 作用24 h 后HBZY-1細(xì)胞的變化，同時設(shè)立不加UA 的空白對照組，觀察尿酸干預(yù)前后HBZY-1 細(xì)胞的數(shù)量，形態(tài)學(xué)及超微結(jié)構(gòu)變化，并拍照采集圖片。

1.2.4 RT-PCR嚴(yán) 格 按RNAfast200 總RNA 極 速抽提試劑盒說明提取細(xì)胞總RNA 并行定量及純度鑒定。逆轉(zhuǎn)錄為cDNA，PCR 擴增反應(yīng)體系25 μL，上下游引物均由大連寶生物工程有限公司（Takara）設(shè)計合成（表1），反應(yīng)條件如下：預(yù)變性：94 ℃，30 s；變性：95 ℃，30 s；退火：55 ℃～65 ℃，30 s；延伸：72 ℃，30 s，共30 個循環(huán)，每組重復(fù)6 次，擴增結(jié)束后即可置于微量離心機上3 000 r/min 離心30 s，可用于瓊脂糖凝膠電泳。在Bio-Rad 凝膠成像分析系統(tǒng)中拍照，并用自帶軟件對結(jié)果進行灰度分析，計算各項指標(biāo)灰度值與內(nèi)參β-actin 的灰度值之比代表其相對強度。

1.2.5 Western blot檢測非布司他對尿酸誘導(dǎo)的HBZY-1 細(xì)胞α-SMA、TGF-β1 及fibronectin 的蛋白表達：按試劑盒說明書提取細(xì)胞總蛋白并測定濃度。進行聚丙烯酰胺凝聚電泳，半干轉(zhuǎn)移法降蛋白轉(zhuǎn)移至硝酸纖維素膜上。用新鮮的5%脫脂奶粉封閉過夜，相應(yīng)的一抗4 ℃孵化1 h，TBST 液洗滌3 次，加入相應(yīng)的二抗室溫孵化1 h 后，通過Western blot 曝光觀察，測定各蛋白表達量。

表1 RT-PCR 各引物序列Tab.1 The primer of RT-PCR

1.3 統(tǒng)計學(xué)方法計量數(shù)據(jù)以表示，運用SPSS 18.0 軟件進行統(tǒng)計分析，對符合正態(tài)分布，方差齊性的資料各組間比較采用單因素方差分析（one-way ANOVA），若方差不齊，或不符合正態(tài)分布，則采用秩和檢驗進行分析，檢驗水準(zhǔn)為α=0.05。

2 結(jié)果

2.1 尿酸對HBZY-1 細(xì)胞形態(tài)學(xué)的影響正常對照組HBZY-1 呈緊密的單層融合的三角形、不規(guī)則型貼壁生長，而尿酸處理組HBZY-1 細(xì)胞體積增大，兩端突起呈長梭形，逐漸轉(zhuǎn)變?yōu)轭愃评w維細(xì)胞樣形態(tài)（圖1）。透射電鏡下對照組HBZY-1 細(xì)胞微絨毛密長，而0.4 mmol/L 尿酸組細(xì)胞表面微絨毛短縮，融合，數(shù)量減少，內(nèi)質(zhì)網(wǎng)明顯擴張（圖2）。

2.2 尿酸對HBZY-1細(xì)胞增殖能力的影響HBZY-1細(xì)胞經(jīng)過0.2 ～0.8 mmol/L UA 作用24 h 后，各濃度UA組OD值與對照組OD值相比差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）（圖3）。其OD值變化見表2，且在一定的濃度范圍內(nèi)，其作用呈現(xiàn)明顯的濃度依賴性。

2.3 尿酸對HBZY-1細(xì)胞分泌血管緊張素Ⅱ（AⅡ）蛋白的影響0.05 mmol/L 的UA 作用于HBZY-1 細(xì)胞后，相比對照組差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）。0.1 mmol/L 的UA 作 用 于HBZY-1 細(xì) 胞24 h 相 比 對照組差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05），但作用24 h 后逐漸出現(xiàn)效果。0.2 mmol/L 和0.4 mmol/L 的UA 對HBZY-1 細(xì)胞分泌AII 的作用24 h 已出現(xiàn)，并隨著作用時間的延長AII 表達量顯著上調(diào)，與對照組相比差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）。見表3 及圖4。

圖1 UA 對HBZY-1 細(xì)胞形態(tài)學(xué)影響（×100）Fig.1 UA induces phenotypic change in HBZY-1 cells

圖2 尿酸對HBZY-1 細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)的影響（×4 000）Fig.2 UA induces Ultrastructural changes in HBZY-1 cells（×4 000）

表2 不同濃度UA 作用24 h 對HBZY-1 細(xì)胞增殖的影響Tab.2 The effects of uric acid on the proliferation of HBZY-1 cell in 24 hours

圖3 不同濃度UA 對HBZY-1 細(xì)胞增殖的影響Fig.3 The effects of uric acid on the proliferation of HBZY-1 cell

表3 尿酸對HBZY-1 細(xì)胞分泌血管緊張素Ⅱ的影響Tab.3 The expression of angiotensin Ⅱin HBZY-1 cell induced by uric acid ±s，ng/mL

表3 尿酸對HBZY-1 細(xì)胞分泌血管緊張素Ⅱ的影響Tab.3 The expression of angiotensin Ⅱin HBZY-1 cell induced by uric acid ±s，ng/mL

注：與對照組相比，*P ＜0.05

UA（mmol/L）0 0.05 0.1 0.2 0.4 24 h 3.222±0.17 3.184±0.196 3.147±0.056 5.135±0.225*5.228±0.196*36 h 3.556±0.141 3.742±0.172 4.857±0.170*5.377±0.112*5.618±0.211*48 h 3.668±0.17 3.891±0.225 5.079±0.170*5.953±0.225*7.383±0.310*

2.4 RT-PCR 檢測尿酸對HBZY-1 細(xì)胞表型轉(zhuǎn)化指標(biāo)mRNA 表達的變化除0.05 mmol/L 組外各個指標(biāo)的各濃度組與其對照組比較，差異均具有統(tǒng)計學(xué)意義（均P＜0.05），見圖5、6。并且隨著UA濃度的增加，α-SMA、TGF-β1 及Fn mRNA 表達逐漸上調(diào)，具有明顯的劑量依賴性。

各個指標(biāo)的各時間組與其對應(yīng)的對照組比較，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05），見圖7、8，并且隨著時間的延長，其mRNA 表達逐漸上調(diào)，且具有明顯的時間依賴性。

圖4 不同濃度UA 作用不同時間對HBZY-1 細(xì)胞分泌AII的影響Fig.4 The expression of angiotensin II in HBZY-1 cell incubated with different concentration of uric acid for different time

圖5 不同濃度UA 對HBZY-1 細(xì)胞α-SMA、TGF-β1 及Fn mRNA 表達的影響Fig.5 The mRNA of α-smooth muscle actin（α-SMA），transforming growth factor-β1（TGF-β1）and fibronectinin HBZY-1 cell induced by uric acid

圖6 不同濃度UA 對HBZY-1 細(xì)胞α-SMA、TGF-β1 及Fn mRNA 表達Fig.6 Statistical analysisof the mRNA of α-smooth muscle actin（α-SMA），transforming growth factor-β1（TGF-β1）and fibronectin in HBZY-1 cell induced by uric acid

圖7 UA 作用不同時間對HBZY-1 細(xì)胞α-SMA、TGF-β1 及Fn mRNA 表達的影響Fig.7 The mRNA of α-smooth muscle actin（α-SMA），transforming growth factor-β1（TGF-β1）and fibronectin in HBZY-1 cell induced by uric acid

2.5 Western blot 檢測尿酸對HBZY-1 細(xì)胞表型轉(zhuǎn)化相關(guān)蛋白表達的變化0.05、0.1 及0.2 mmol/L的UA作用于HBZY-1細(xì)胞48 h Fn蛋白表達未見明顯增加，與對照組相比差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）。當(dāng)UA 大于0.2 mmol/L 時Fn 蛋白大量表達，并與對照組相比差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）。見圖9、10。各個指標(biāo)的各時間組與其對應(yīng)的對照組比較，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）。見圖11、12。

3 討論

流行病學(xué)調(diào)查證實，在高尿酸血癥患者中僅5%～12%最終可發(fā)展為痛風(fēng)，即88%～95%表現(xiàn)為無癥狀性高尿酸血癥［5］。目前高尿酸血癥致腎臟損傷的研究較多集中在尿酸鹽結(jié)晶沉積于腎臟引起的腎小管-間質(zhì)機械損傷、腎間質(zhì)炎細(xì)胞浸潤等引起的慢性間質(zhì)性腎炎，而無尿酸鹽結(jié)晶形成的溶解狀態(tài)下的高尿酸血癥對腎小球的損傷研究較少［6］。系膜細(xì)胞屬腎臟主要固有細(xì)胞之一，其與毛細(xì)血管袢之間不存在基底膜，因此，任何來自血流異常信號等多種病理因素均可直接對腎小球系膜細(xì)胞造成損傷［7-8］。高尿酸是否引起系膜細(xì)胞發(fā)生肌成纖維細(xì)胞表型改變即（MFT）過程從而參與腎小球硬化，國內(nèi)外相關(guān)報道甚少。

圖8 UA 作用不同時間對HBZY-1 細(xì)胞α-SMA、TGF-β1 及Fn mRNA 表達的統(tǒng)計分析Fig.8 Statistical analysisof the mRNA of α-smooth muscle actin（α-SMA），transforming growth factor-β1（TGF-β1）and fibronectin in HBZY-1 cell induced by uric acid

圖9 不同濃度UA 對HBZY-1 細(xì)胞α-SMA、TGF-β1 及Fn蛋白表達的影響Fig.9 The expressions of α-smooth muscle actin（α-SMA），transforming growth factor-β1（TGF-β1）and fibronectin proteins in HBZY-1 cell induced by uric acid

GUILHERME等［9］研究發(fā)現(xiàn)尿酸（8和10 mg/dL）可誘導(dǎo)人系膜細(xì)胞增殖，這一作用可能與系膜細(xì)胞收縮導(dǎo)致腎小球濾過率下降有關(guān)。本研究中尿酸組細(xì)胞較對照組細(xì)胞增殖速度明顯加快，提示隨著尿酸濃度的增加其促增殖作用逐漸增強呈現(xiàn)明顯的劑量依賴性。此研究結(jié)果與國內(nèi)外報道基本一致［10］。

AII是腎素-血管緊張素（RAS）系統(tǒng)中最重要的生物活性肽。研究證實AII參與多種慢性腎臟疾病的發(fā)生及發(fā)展，AII 可通過改變血流動力學(xué)和非血流動力學(xué)因素包括ROS產(chǎn)生，促纖維化因子如TGFβ1、TNF-α和大量炎性細(xì)胞浸潤等引起腎小球纖維化［9］。動物實驗表明給大鼠長期持續(xù)灌注AngII 能導(dǎo)致間質(zhì)性腎炎發(fā)生，并且大量Ⅳ型膠原纖維沉積腎間質(zhì)最終導(dǎo)致間質(zhì)纖維化［11-12］。本實驗結(jié)果提示高尿酸可誘導(dǎo)系膜細(xì)胞大量表達AII，而且在一定濃度和時間范圍內(nèi)呈劑量-時間依賴關(guān)系?？梢夾II 與腎小球系膜細(xì)胞表型轉(zhuǎn)化有關(guān)，推測AII 可能是高尿酸誘導(dǎo)系膜細(xì)胞大量表達α-SMA、TGF-β1和fibronectin 的上游因子，但需進一步研究探討。

圖10 不同濃度UA 對HBZY-1 細(xì)胞α-SMA、TGF-β1 及Fn 蛋白表達的統(tǒng)計學(xué)分析Fig.10 Statistical analysisof the expression of α-smooth muscle actin（α-SMA），transforming growth factor-β1（TGF-β1）and fibronectin proteins in HBZY-1 cell induced by uric acid

α-SMA 是系膜細(xì)胞轉(zhuǎn)分化為肌成纖維細(xì)胞的特異性標(biāo)志已被國內(nèi)外大量研究所證實。本實驗結(jié)果提示高尿酸可誘導(dǎo)系膜細(xì)胞發(fā)生表型改變，倒置顯微鏡下可見正常HBZY-1 細(xì)胞經(jīng)0.4 mmol/L UA 作用后，HBZY-1 細(xì)胞體積逐漸增大，兩端突起呈長梭形，逐漸轉(zhuǎn)變?yōu)轭愃评w維樣細(xì)胞形態(tài)。細(xì)胞表面微絨毛短縮，融合，數(shù)量減少，內(nèi)質(zhì)網(wǎng)明顯擴張。同時尿酸作用下HBZY-1 細(xì)胞α-SMA 基因轉(zhuǎn)錄及蛋白質(zhì)水平明顯增強，且在一定劑量和時間范圍內(nèi)呈劑量時間依賴性。以上證據(jù)均提示高尿酸可誘導(dǎo)體外培養(yǎng)的HBZY-1 細(xì)胞從靜止/成熟型轉(zhuǎn)變?yōu)樵錾?分泌型。

圖11 UA 作用不同時間對HBZY-1 細(xì)胞α-SMA、TGF-β 1 及Fn 蛋白表達的影響Fig.11 The expressions of α-smooth muscle actin（α-SMA），transforming growth factor-β1（TGF-β1）and fibronectin proteins in HBZY-1 cell induced by uric acid

TGF-β1 是目前已知的最強的致纖維化因子之一，研究［13］表明當(dāng)腎小球系膜細(xì)胞發(fā)生表型轉(zhuǎn)化時其表達上調(diào)，其可通過TGF-β1/Smads 信號通路等多種機制導(dǎo)致腎臟纖維化。本實驗結(jié)果提示TGF-β1 mRNA 及蛋白表達明顯上調(diào)，且具有劑量時間依賴性。這些結(jié)果均提示高尿酸可誘導(dǎo)系膜細(xì)胞大量表達TGF-β1。當(dāng)腎小球系膜細(xì)胞發(fā)生表型轉(zhuǎn)化后Fn 大量表達，并在腎小球內(nèi)大量蓄積，導(dǎo)致腎小管周圍毛細(xì)血管閉塞，腎小球有效濾過率下降，最終引起腎功喪失，成為腎小球硬化的物理基礎(chǔ)。本實驗同樣也發(fā)現(xiàn)高尿酸可誘導(dǎo)系膜細(xì)胞大量表達纖維連接蛋白（fibronectin）。纖維連接蛋白是細(xì)胞外基質(zhì)的重要組成成分，在腎纖維化過程中起重要作用。

圖12 UA 作用不同時間對HBZY-1 細(xì)胞α-SMA、TGF-β1 及Fn 蛋白表達的統(tǒng)計分析Fig.12 Statistical analysisof the expression of α-smooth muscle actin（α-SMA），transforming growth factor-β1（TGF-β1）and fibronectin proteins in HBZY-1 cell induced by uric acid

由此可見由高尿酸可誘導(dǎo)的大鼠腎小球系膜細(xì)胞增殖及發(fā)生表型轉(zhuǎn)化可能是腎小球硬化的重要機制。