苗芬 姚敏 鄭紅

南京醫(yī)科大學附屬兒童醫(yī)院口腔科（南京210000）

遺傳性牙齦纖維瘤（hereditary gingival fibromatosis，HGF）是一種牙齦組織廣泛性漸進性增生的良性病變，發(fā)病罕見。牙齦表面呈光滑或結(jié)節(jié)狀，質(zhì)地較韌，顏色未見異常［1-2］。為常染色體顯性遺傳或隱形遺傳［2］，有家族聚集性的特點。增生的牙齦覆蓋部分或者全部牙冠，嚴重影響咀嚼、美觀與語言，易誘發(fā)錯 畸形。目前相關(guān)基因研究主要定位于2p21-2p22 基因，而SOS1（son of sevenless homolog 1）基因是唯一被克隆與鑒定的HGF相關(guān)基因之一，其分子機制方面研究也取得了進展［3-6］。已有體外研究［3］發(fā)現(xiàn)HGF 患者的牙齦細胞增殖速度加快，而體內(nèi)牙齦細胞的增殖與凋亡程度，尚未見到相關(guān)報道。B細胞特異的莫洛尼白血病病毒插入位點1 基因（B cell specific moloney leukemia virus insert site 1，Bmi1）基因表達于全身各個組織和器官，并對其正常功能的維持發(fā)揮重要作用，Bmi1 可通過調(diào)控ink4a/arf 基因位點影響造血干細胞、神經(jīng)干細胞、腫瘤細胞的增殖與分化與衰老［7-9］。已有研究［10］發(fā)現(xiàn)Bmi1 基因可延長口腔上皮細胞的生命周期促進其增殖，同時Bmi1 基因也可以抑制輻射后口腔上皮細胞的衰落，發(fā)揮抗輻射保護作用［11］。但是Bmi1 基因是否在HGF 發(fā)病中發(fā)揮作用，還未見相關(guān)報道。本文收集2014年1月至2016年12月就診于浙江省口腔醫(yī)院的22 例HGF及15 例正常牙齦組織作為對照組，采用免疫組織化學染色法及PCR 法分析了HGF 及對照組的Bmi1 蛋白及mRNA 表達的差異，探討HGF 可能的發(fā)病機制。

1 材料與方法

1.1 標本收集自2014年1月至2016年12月就診于浙江大學醫(yī)學院附屬口腔醫(yī)院且術(shù)后病理診斷為HGF 的患者標本22 例，患者全口牙齦增生明顯，術(shù)后加強口腔衛(wèi)生，隨訪至2018年5月無一例復發(fā)。15 例對照組正常牙齦標本來自于下頜智齒拔除術(shù)患者。HGF 組和對照組的性別及年齡具有可比性，所有患者均簽署知情同意書，本課題經(jīng)院倫理委員會同意。

1.2 納入/排除標準納入標準：病理組織有典型的HGF 組織學特點，符合遺傳性牙齦纖維瘤的診斷標準；均有家族遺傳病史；無苯妥英鈉、硝苯吡啶等鈣通道阻滯類藥物服用史；未合并嚴重的心腦血管疾病；不存在精神障礙、難以溝通者。排除標準：牙齦炎、牙周炎、牙齦瘤等牙齦疾病患者；病理診斷無牙齦病變者；治療前進行過如牙齦切除術(shù)等相關(guān)治療；妊娠或哺乳期女性；不配合治療者或資料不完整者。

1.3 HE 染色HGF 及對照組新鮮組織標本經(jīng)多聚甲醛固定，脫水，包埋和切片，切片經(jīng)蘇木素染色，鹽酸酒精分化，沖洗返藍，伊紅復染，脫水透明，封片，鏡下觀察。

1.4 Bmi1、增殖細胞核抗原（proliferating cell nuclear antigen，PCNA）和半胱天冬酶-3（caspase-3）的表達石蠟切片脫蠟水化，0.1 mol/L 檸檬酸高壓抗原修復，Bmi1（1∶400，Sigma，hpa030472）、PCNA（1∶200，Sigma，p8825）和caspase-3（1∶500，Abcam，ab13585）等一抗4 ℃孵育過夜，二抗（1∶400，Sigma-aldrich，BS10650）加PV9000，二 氨 基 聯(lián) 苯 胺（DAB）顯色，蘇木素復染、脫水及鏡檢。每批染色均用同源IgG 抗體做為陰性對照。記錄鏡下200個細胞中的陽性細胞的個數(shù)，連續(xù)3 個視野下取均值。

1.5 牙齦的Bmi1、PCNA和caspase-3 mRNA表達

1.5.1 總RNA 提取與定量在液氮速凍條件下研磨牙齦標本成粉末，并轉(zhuǎn)移至1.5 mL Eppendorf管，每100 mg 組織加1.0 mL Trizol 裂解液，打成勻漿狀，氯仿-異丙醇提取，以DEPC 處理水溶解RNA。經(jīng)紫外分光光度計測定提取物總RNA 濃度，A260/A280 范圍1.8 ～2.0 提示RNA 純度合格。置于-20 ℃?zhèn)溆谩?/p>

1.5.2 cDNA 的合成25 μL 反應體系組成：5 μL 10×RT 緩沖液，1 μL oligodT（18），3 μL dNTP，1 μL RNAseInhibitor，1 μL M-MLV 逆轉(zhuǎn)錄酶，加入DEPC處理水至25 μL 刻度。取2 μL 總RNA 在上述反應體系中逆轉(zhuǎn)錄成cDNA，70 ℃預變性5 min，42 ℃孵育60 min，冷卻備用。

1.5.3 PCR 反應反應體系：10 × buffer 2.5 μL，dNTP 2.5 μL，TaqDNA 聚合酶0.5 μL，上、下游特異引物各1 μL，模板1.5 μL，DEPC 處理ddH2O 水補足25 μL，混勻，離心。各引物序列可見表1。反應條件：30 個循環(huán)（預變性94 ℃5 min，變性94 ℃30 s，退火51 ℃30 s，延伸72 ℃45 s），72 ℃延伸10 min。每次擴增設置無模板cDNA 的陰性對照和內(nèi)參基因GAPDH 陽性對照。

表1 引物序列Tab.1 The primer sequence

1.6 統(tǒng)計學方法采用Image Pro Plus 6.0 圖像分析軟件分析組化染色圖像，采用SPSS 20.0 軟件包進行統(tǒng)計，Bmi1、PCNA 和caspase-3 mRNA 表達等計量資料比較采用t檢驗及雙側(cè)檢測，P＜0.05 為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

2.1 HGF 的牙齦形態(tài)學病變與正常牙齦相比，本研究收集的HGF 病例全口牙齦增生增厚明顯，覆蓋牙冠≥1/3，見圖1A。

2.2 兩組牙齦的HE 染色光鏡下可見HGF 組牙齦組織上皮層增厚，上皮釘突明顯伸長，結(jié)締組織體積增大，充滿粗大的膠原纖維和成纖維細胞，血管較少，結(jié)締組織內(nèi)輕度炎癥增生，見圖1B。

圖1 HGF 患者口內(nèi)照及牙齦HE 染色Fig.1 The photo of HGF and HE staining

2.3 兩組牙齦的Bmi1、PCNA 和caspase-3 表達比較兩組牙齦組織的PCNA 表達無統(tǒng)計學差異（P＞0.05），與對照組比，HGF 組牙齦組織的Bmi1表達明顯增高（P＜0.05），caspase-3 表達明顯降低（P＜0.05）。見表2 和圖2。

表2 兩組牙齦的Bmi1、PCNA 和caspase-3 表達比較Fig.2 The expression of Bmi1，PCNA and caspase-3 in 2 groups ±s

表2 兩組牙齦的Bmi1、PCNA 和caspase-3 表達比較Fig.2 The expression of Bmi1，PCNA and caspase-3 in 2 groups ±s

組別對照組HGF 組t 值P 值例數(shù)15 22 Bmi1 5.2±0.8 21.5±2.5 21.321 0.000 PCNA 7.9±2.1 6.2±2.2 2.350 0.029 caspase-3 25.6±2.1 9.8±1.0 30.689 0.000

圖2 兩組牙齦的Bmi1、PCNA 和caspase-3 表達（×200）Fig.2 Bmi1，PCNA and caspase-3 immunohistochemistry staining of 2 groups（×200）

2.4 兩組牙齦的Bmi1、PCNA 和caspase-3 mRNA表達比較兩組牙齦組織的PCNA mRNA表達無統(tǒng)計學差異（P＞0.05），與對照組比，HGF 組牙齦組織的Bmi1 mRNA 表達明顯增高（P＜0.05），caspase-3 mRNA 表達明顯降低（P＜0.05）。見圖3。

3 討論

HGF 患者牙齦組織結(jié)締組織內(nèi)膠原纖維累積，牙齦增生可覆蓋部分直至全部牙冠，可導致牙齒移位或者錯 畸形［1-2］，影響咀嚼和面部美觀，嚴重者可影響患者的心理和生活。但HGF 的病因和發(fā)病機制尚不明確，可能也是治療后易復發(fā)的原因之一。

圖3 兩組牙齦的Bmi1、PCNA 和caspase-3 mRNA 表達比較Fig.3 The Bmi1，PCNA and caspase-3 mRNA of 2 groups

HGF 的研究熱點在于牙齦成纖維細胞的增殖速度，爭議較大：GAWRON 等［12］得出HGF 成纖維細胞增殖快于對照組；電鏡下顯示HGF 成纖維細胞增生明顯［13］；GAWRON 等［14］研究，與正常人比，HGF 患者增殖較慢，而膠原和粘多糖的生物合成較快；SAYGUN 等［15］發(fā)現(xiàn)在牙齦組織中沒有發(fā)現(xiàn)Ki-67 陽性表達，HGF 結(jié)締組織增生是膠原和細胞內(nèi)間質(zhì)過度合成和累積有關(guān)。HGF 的病理表現(xiàn)為細胞外基質(zhì)蛋白的過度積累，Ⅰ型膠原蛋白表達度是典型的病變［16］。本實驗結(jié)果與SAYGUN 等研究類似，PCNA 與細胞增殖緊密相關(guān)，PCNA 及mRNA在兩組牙齦組織的表達無統(tǒng)計學差異，說明HGF牙齦增厚可能與牙齦成纖維細胞凋亡降低，膠原、細胞外基質(zhì)大量合成有關(guān)。

Bmi1 基因可抑制造血干細胞、神經(jīng)干細胞的衰老與凋亡，使之永生［17］。KIM 等［18］通過轉(zhuǎn)基因方法使體外口腔上皮細胞Bmi1 基因高表達，延長上皮細胞壽命，抑制凋亡。Bmi1 還可通過抑制TGF-β 信號通路，抑制口腔上皮細胞的衰老［19］。本課題顯示，與對照組比，HGF 患者牙齦組織的Bmi1 蛋白及mRNA 表達明顯提高，推測Bmi1 蛋白及mRNA 可能參與了HGF 的發(fā)病。

Caspase-3 被激活后能夠增加凋亡特異性核酸酶并水解DNA，造成細胞凋亡［20］。體外研究顯示舌癌細胞Bmi1mRNA 高于正常粘膜細胞，抑制caspase-3 mRNA 可拮抗細胞凋亡［21］。沉默Bmi1 基因能誘導NCI-H345 細胞凋亡，與上調(diào)caspase-3 蛋白表達有關(guān)［22-23］。本課題顯示，HGF 牙齦組織的Bmi1 蛋白及mRNA 表達升高，同期caspase-3 蛋白及mRNA 降低，推測Bmi1 基因通過抑制促凋亡基因caspase-3 及mRNA 表達而誘導HGF，針對Bmi1基因的靶向治療可為HGF 的臨床治療提供了新思路，由此，細胞研究及相關(guān)細胞因子將成為進一步的研究計劃。

綜上所述，HGF 發(fā)病與Bmi1 基因關(guān)系緊密，可能與Bmi1 通過抑制促凋亡基因caspase-3 及mRNA 表達相關(guān)。